KR800000241B1

KR800000241B1 - 고정화 포도당 이성화 효소의 제조방법

Info

Publication number: KR800000241B1
Application number: KR7801586A
Authority: KR
Inventors: 한문희; 정태화; 박영훈
Original assignee: 천병두; 재단법인 한국과학기술연구소
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1978-05-25
Publication date: 1980-04-02

Abstract

내용 없음.

Description

고정화 포도당 이성화 효소의 제조방법

본 발명은 포도당 수용액으로 부터 과당 시럽(포도당과 과당의 혼합물)을 생산함에 있어 사용되는 포도당이성화 효소를 고정하는 새로운방법에 관한 것이다.

미생물 효소에 의해 포도당 수용액으로 부터 과당 시럽을 생산하는 방법은 1960년대 중반부터 활발히 연구되기 시작하여 초기에는 슈도모나스히드로필라(pseudomonas hydrophila), 스트렙토마이세스알부스(streptomyces albus), 스트렙토 마이세스 플라보비레우스(streptomyces flavovireus), 스트렙토마이세스 에키나투르(streptomyces echinatur), 스트렙토마이세스 아크로모제누스(streptomyces achromogenus), 스트렙토마이세스 올리바세우스(streptomyces olivaceus), 바실레스코아귤란스(bacillus coagulans) 등의 미생물을 배양하여 이로부터 수용성효소를 추출, 정제하여 사용하였으나 효소 추출정제 비용이 비싼관계로 실용화되지 못하고 있다가 1970년대에 이르러 효소의 고정화방법이 개발됨에 따라 이 공정의 산업화가 가능하게 되었다. 효소를 고정화 하게 되면 효소의 재사용과 연속적 반응이 가능하며, 고정화방법에 따라서는 효소의 안정성도 크게 증가시킬 수 있어 효소의 단위 역가당 생산성을 획기적으로 향상 시킬 수 있게된 것이다.

또한 최근에는 효소함유 균체를 직접 고정화 시킴으로써 효소 추출비용의 절감으로 효소 생산원가를 대폭 절감 시키는 방법이 개발되어 이에 대한 연구가 주로 진행되고 있다.

지금까지 개발된 포도당 이성화 효소의 고정화 방법에 있어서, 알려지고 있는 제조방법은 다음과 같은 특허가 소개 되고 있다.

(1) 셀룰로오스 흡착법(미국특허 3,694,312)

(2) 용출효소의 수지담체 흡착법(미국특허 3,960,663, 일본특허 51-70, 51-871)

(3) 글루트 알데히드 가교법(일본특허 51-51, 51-580)

그러나 이중에서 (1)의 셀룰로오스 흡착법은 흡착지지체인 디이에이이 셀룰로오스(DEAE-cellulose)를 사용하기 때문에 반응장치내의 압력 손실이 커서 조작상 불편할 뿐만 아니라 위험성이 높으며, (2)의 용출 효소의 수지담체 흡착법은 일단 효소를 균체로 부터 용출시켜야 하는 과정을 거쳐서 흡착 시키게 되므로 다량의 효소가 유실된다.

또한 (3)의 가교제를 이용한 균체의 고정화 방법은 이와 같은 단점들을 어느 정도 보완하기는 하였으나 부분적으로 용출시킨 균체 자체에 글루트 알데히드를 처리하게 되므로 효소 역가 손실이 크고 또 효소원으로서 바실러스 균(bacillus coagulans)을 사용하고 있으므로 스트렙토마이세스 속의 균주를 사용할 경우에는 이 방법을 적용할 수 없었다. 이에 따라 이러한 방법을 스트렙토마이세스 속 균주의 포도당 이성화 효소에 적용하는 방법이 시도 되었으나(미국특허 3,779,869), 이 방법에 의해 제조된 고정화 포도당 이성화 효소도 글루트 알데히드 처리에 의한 역가 손실이 크고 과립상으로 조제할 수 없어 관형 연속반응기에 사용하기가 부적당하였다.

그러나 본 발명은 상기의 공지 제조방법과는 달리 새롭고도 진보된 고정화 포도당 이성화 효소의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조내용은 균체 자체에 포도당 이성화 효소를 생산 축적하는 미생물을 배양, 균체 자체를 효율적으로 고정화하여 효소의 역가 손실을 최소로 줄이는 반면, 이를 직접 회분식 반응기에 사용하거나 관형식 반응기에 충전하고 연속식으로 과당 시럽을 제조하는 것이다.

본 발명의 제조방법을 더욱 구체적으로 설명하면, 포도당 이성화 효소를 생산 축적하는 미생물을 이미 알려진 방법에 의해 효소생산 조건하에서 배양, 배지를 원심분리 하거나 여과하는 등의 방법으로 회수된 균체를 습윤된 상태 또는 건조시킨후 (수분함량 1-85%) 건조균체 무게의 10-100% 무게의 젤라틴을 10-40% 수용액으로 만들어 균체와 잘 혼합하고 지지체로 셀룰로오스 물질, 예컨대 목재 셀룰로오스 분말 혹은 디이에이이 셀룰로오스(DEAE-cellulose) 등을 효소-젤라틴 혼합물과 잘 혼합한 다음 사출 성형기로 사출한다. 이때 사출기의 구경은 효소의 원하는 크기에 따라 0.5-1.5mm 정도로 조절할 수 있다. 사출된 효소 혼합물을 5% 글루트 알데히드 수용액 중에서 30초-1분간 처리하여 증류수로 3-4회 세척한 뒤 상온에서 공기 건조 시킨다. 건조된 효소 혼합물은 약절구등의 마쇄기를 이용하여 적절한 크기로 분쇄한 후 고정화 효소 제품으로 얻는다.

본 발명에 의하여 제조된 효소 균체는 단백물질인 젤라틴에 포괄(entrapping) 되어 젤라틴이 글루트 알데히드에 의해 고정화됨으로써 균체 자체가 젤라틴 속에 고정화된다. 여기에 셀룰로오스 물질은 균체와 젤라틴의 혼합물 속에 부형제로 들어감과 동시에 반응액중에서 일부 용출 가능성 있는 효소를 흡착하는 구실을 하기 때문에 고정화 효소의 역가 보지를 유지할 뿐 아니라 기질과 최종산물이 과립 내부로 유출입하는 반응을 원활히 하는데 기여하고 있다. 특히 글루트 알데히드는 균체 자체에 직접 작용하여 균체를 고정화 하는 것이 아니라 젤라틴에 작용하여 젤라틴을 고정화시키고 균체를 고정된 젤라틴 속에 포괄시켜 효소를 고정화하기 때문에 기존의 균체 또는 효소자체에 직접 글루트 알데히드를 가교제로 사용 고정화시키는 방법보다 효소의 역가 손실을 최소한으로 줄일 수 있는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라 본 발명의 제조방법은 기존 방법보다 사용되는 글루트 알데히드의 농도를 더욱 묽게 할 수 있으며 효소 담체와 글루트 알데히드 와의 접촉시간도 훨씬 단축할 수 있어 비교적 고가인 글루트알데히드의 사용량을 줄일 수 있는 이점을 가지고 있다. 또한 본 발명으로 제조된 고정화 포도당 이성화 효소는 사출기의 구경을 임의로 조절할 수 있기 때문에 원하는 크기의 과립상으로 제조될 수 있으며, 건조후 다시 기질과 접촉하여도 적당한 강도를 계속 유지하여 대형 관형식 반응기에도 충분히 사용할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 제조된 고정화 포도당 이성화 효소는 실험실적 크기의 생산은 물론 산업적 규모의 과당시럽 생산에도 적합하다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예증하여 줄것이나 본 발명의 범위가 이에 국한 된다는 것은 아니다.

[실시예 1]

포도당 이성화 효소 생산력이 강한 스트렙토마이세스 속 균주(KFCC 35,051)를 시료 균주로 사용한 경우, 사용된 전배양용 배지조성과 효소생산용 천연배지 조성은 다음과 같다.

이때 콘스팁리커(corn steep liquor)는 옥수수 전분공장에서 구입한 옥수수 침적수로서 고형분 함량이 약 1.5%로 장기간 저장이 불가능 하므로 구입한 즉시 분무건조기(spray dryer)로 분무 건조하여 보관 사용하였고 pH 조절에 의해 생기는 침전은 여과 및 원심분리에 의하여 제거 하였다. 또한 밀기울은 입자 크기가 40메시 정도로 분쇄한 것을 사용하여 진한 황산은 0.3-0.6% 넘어 가수분해한 뒤 10N 가성소오다로 중화 시키고 침전물을 여과하고 그 여액을 사용하였다. 효도 균체는 전 배양에서 배양된 균주를 10% 접종량으로 하여 효소 생산용배지에 무균적으로 접종한 후 28ℓ발효조에서 통기 배양하였다. 약 48시간 발효후 균체를 7,000r.p.m에서 연속 원심 분리하여 회수하였고 이때 회수된 균체는 약 84%의 수분을 함유하고 있었다. 이 습윤 균체 1kg을 동결 건조시킨 결과 수분 함량이 약 5%인 170g의 건조균체를 얻었다.

이중 48g의 건조균체를 취하여 여기에 10%젤라틴 수용액 90㎖을 천천이 가하면서 잘 혼합한 후 사출성형기를 통하여 효소-젤라틴 혼합물을 사출 시키고 다시 5% 글루트 알데히드 수용액중에서 30초 동안 처리한 후 증류수로 3-4회 세척하였다. 세척된 사출물을 상온에서 12시간 공기 건조 시키고 약절구로 분쇄하여 약 48g의 건조된 과립상의 고정화포도당 이성화 효소를 얻었다. 효소역가 수율은 40%였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 건조 균체중 50g의 건조균체릍 취하고 여기에 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 10%가 되도록 10%의 젤라틴 수용액을 첨가하여, 효소-젤라틴의 혼합물로 만든 다음 사출기로 사출 성형하고 다시 5%의 글루트 알데히드 수용액중에서 30초동안 처리한 후 증류수로 3-4회 세척하였다.

세척된 사출물을 상온에서 12시간 공기 건조 시키고 약절구로 분쇄하여 약 56g의 건조된 과립상의 포도당 이성화 효소를 얻었다. 이때의 효소 역가수율은 45%이었다.

[실시예 3]

실시예 1에서 얻은 건조균체 중 50g의 건조균체를 취하고 여기에 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 20%가 되도록 20%의 젤라틴 수용액을 첨가하여, 효소-젤라틴의 혼합물로 만는 다음 사출기로 사출성형하고 다시 5%의 글루트 알데히드 수용액중에서 30초동안 처리한 후 증류수로 3-4회 세척하였다.

세척된 사출물을 상온에서 12시간 공기건조 시키고 약절구로 분쇄하여 약 63g의 건조된 과립상의 고정화 포도당 이성화 효소를 얻었다. 이때의 효소 역가수율은 42%이었다.

[실시예 4]

실시예 1에서 얻은 건조균체중 50g의 건조균체를 취하고 여기에 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 30%가 되도록 30%의 젤라틴 수용액을 첨가하여, 효소-젤라틴의 혼합물로 만든 다음 사출기로 사출 성형하고 다시 5%의 글루트 알데히드 수용액중에서 30초 동안 처리한 후 증류수로 3-4회 세척하였다.

세척된 사출물을 상온에서 12시간 공기 건조 시키고 약절구로 분쇄하여 약 65g의 건조된 과립상의 고정화포도당 이성화 효소를 얻었다. 이때의 효수 역가수율은 40%이었다.

[실시예 5]

실시예 1에서 얻은 건조 균체 중 50g의 건조균체를 취하고 여기에 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 40%가 되도록 40%의 젤라틴 수용액을 첨가하여, 효소-젤라틴의 혼합물로 만든 다음 사출기로 사출 성형하고 다시 5%의 글루트 알데히드 수용액중에서 30초 동안 처리한 후 증류수로 3-4회 세척하였다.

세척된 사출물을 상온에서 12시간 공기건조 시키고 약절구로 분쇄하여 약 75g의 건조된 과립상의 고정화포도당 이성화 효소를 얻었다. 이때의 효소역가 수율은 42%이었다.

[실시예 6]

실시예 1에서 얻은 건조균체중 50g의 건조균체를 취하고 여기에 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 100%가 되도록 40%의 젤라틴 수용액을 첨가하여, 효소-젤라틴의 혼합물로 만든 다음 사출기로 사출성형하고 다시 5% 글루트 알데히드 수용액중에서 30초 동안 처리한 후 증류수로 3-4회 세척하였다.

세척된 사출물을 상온에서 12시간 공기건조 시키고 약절구로 분쇄하여 약 110g의 건조된 과립상의 고정화 포도당 이성화 효소를 얻었다. 이때의 효소 역가수율은 40%이었다.

[실시예 7]

실시예 1에서 얻은 습윤균체중 300g의 습윤균체를 취하고 여기에 40%의 젤라틴 수용액 170㎖을가하여 균일하게 혼합한 다음, 지지체로 디이에이이 셀룰로오스(DEAE-cellulose)를 수분함량이 약 20% 될때까지 소량씩 첨가하고 혼합하여 준다. 이렇게 얻은 혼합물을 구경 0.7mm의 사출성형기를 통하여 사출시키고 5%의 글루트알데히드 수용액 중에서 1분동안 처리한 다음 증류수로 3-4회 세척하였다. 상온에서 철야공기건조 시킨 후 약절구를 사용, 적절한 크기로 분쇄하여 160g의 건조된 과립상의 고정화 이성화 효소제품을 얻었다. 효소 역가의 고정화후의 수율은 초기 습윤균체 역가의 약 20%이였다.

[실시예 8]

실시예 1에서 얻은 습윤균체 중 200g의 습윤균체를 취하고 여기에 30%의 젤라틴 수용액 145㎖를 가하여 균일하게 혼합한 다음 60g의 정제분말 셀룰로오스 솔카플록(SOLKA-FLOC; 상품명)을 가하였다. 이렇게 얻은 혼합물을 0.7mm 사출 성형기를 통하여 사출 시키고 5%의 글루트 알데히드 수용액에 1분 동안 처리한 다음 증류수로 3-4회 세척 하였다. 이것을 상온에서 12시간 건조 시킨 후 분쇄하여 약 100g의 건조된 과립상의 고정화 포도당 이성화 효소 제품을 얻었다. 효소 역가의 고정화 후의 수율은 초기균체 역가의 약 15% 이였다.

[실시예 9]

실시예 7의 방법으로 제조된 과립상의 포도당 이성화 효소는0.1M인산염 완충액(pH 7.5)에 녹인 1M의 포도당을 기질로 하고 0.1g의 고정화 포도당 이성화 효소를 10㎖ 기질에 60℃에서 반응시켰을때 2시간후 포도당의 과당으로의 전화율 약 2%였다. 고정화 효소를 반응용액으로 부터 여과하여 증류수로 세척하고 회수한 뒤 다시 새로운 기질(1M 포도당 용액)을 가하여 같은 조건하에서 반복 사용하였다. 10번의 반복사용할 때 매회 효소 활성은 다음 표 1과 같았다.

[표 1]

표 1에 따르면 2시간씩 10회 반복 사용한 후 효소 역가는 초기 역가의 85% 정도임을 알 수 있으며 반응중의 효소용출 현상은 거의 없음을 발견할 수 있었다.

[실시예 10]

실시예 7과 같은 방법으로 제조된 과립상의 고정화포도당 이성화 효소를 0.1M트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 녹인 1M의 포도당을 기질로 하여 기질 50㎖당 고정화 효소 0.5g을 사용하고 60℃에서 회분식 반응을 진행 시켰을 때 18시간후에 40%의 이성화율을 보였다. 이때 기질에는 10밀리몰의 Mg²⁺이온과 1밀리몰의 Co²⁺이온을 첨가 하였다.

[실시예 11]

실시예 7과 같은 방법으로 제조된 과립상의 고정화포도당 이성화 효소를 관형 반응기에 충전 시키고 포도당 기질농도 14.4%, 기질의 반응기내 체류 시간을 1.7시간으로 하여 60℃에서 연속적으로 반응을 진행 시켰을 때 정상 상태의 이성화율은 40%이었고, 반응기내 체류 시간을 3.3시간으로 하였을 때에는 정상상태의 이성화율이 45% 이었다.

Claims

포도당 이성화 효소의 활성을 갖는 미생물을 공지의 방법으로 배양하여 균체를 회수하여 그 균체 자체를 효소원으로 사용할 때, 균체를 건조 또는 습윤시킨 다음 여기에 건조균체 무게의 10-100%에 해당하는 젤라틴을 10-40% 수용액으로 만들어 균체와 혼합하고 지지체로 셀룰로오스 물질을 첨가하여 과립상으로 만든 다음, 이 과립화된 효소, 젤라틴, 셀룰로오스로 조성된 혼합물을 5%의 글루트 알데히드 수용액으로 30초-1분간 처리하여 효소 활성을 갖는 균체를 고정화하는 것을 특징으로 하는 고정화 포도당 이성화 효소의 제조방법.