KR800000422B1 - 고정화 포도당 산화효소의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

고정화 포도당 산화효소의 제조방법

본 발명은 포도당 산화효소(glucose oxidase)와 카탈라제(catalase)를 동시에 균체내에 축적하는 미생물의 균체를 고정화시켜 효소적 방법으로 포도당 함유용액으로부터 글루콘산(gluconic acid)을 생산하는 새로운 방법에 관한 것이다.

글루콘산의 제조법에는 염기성포도당 용액을 전기적으로 산화시켜 제조하는법(미국 특허 1,937,273), 하이포브로마이트(hypobromite)를 촉매로한 화학적 산화법(미국특허 1,648,368) 등이 있으나 경제성 문제로 실용화 되고 있지 못하다. 현재 공업적으로는 발효법을 사용하여 아스퍼질러스나이저(aspergillus niger), 아스퍼질러스 푸마리쿠스(aspergillus fumaricus), 슈도모나스 오발리스(pesudomonas ovalis), 페니실륨 크리소게넘(penicillium chrysogenum), 아세토박터 아세티(acetobacter aceti) 등의 균주를 이용해서 포도당의 알데히드기를 산화시켜 생산하고 있다(미국특허 1,849,053 및 미국특허 2,916,515).

현재 사용되고 있는 이들 글루콘산 제조법은 포도당 수용액에 직접 균체를 배양하여 발효적으로 포도당을 산화시키기 때문에 균체가 성장하는데 필요한 유기염을 영양원으로 첨가하여야 하여, 또 생성된 글루콘산을 중화시키고 균체의 성장을 돕기 위하여 탄산칼슘을 넣어야만 한다. 이때 생성된 글루콘산 칼슘은 발효액중에 결정으로 석출되어 균체의 성장 및 포도당의 산화과정을 저해시키는 방해물질이 된다. 따라서 이 글루콘산 칼슘의 결정화를 막기 위해 붕산 또는 붕산소오다를 첨가하므로 이들 불순물을 최종 발효산물에서 제거하는데 큰 문제점이 있다. 이와 같은 결점을 제거하거 위하여 포도당산화효소를 생산하는 균체에서 효소를 추출·정제하여 사용하는 방법이 연구되었으나 포도당이 글루콘산으로 산화되는 반응계에서는 포도당산화효소와 카탈라제의 두가지 효소가 필요하기 때문에 효소의 추출, 정제 비용이 글루콘산의 생산원가 보다 상대적으로 고가격이어서 실용화 되지 못하고 있다. 그러나 1970년대에 이르러 효소의 고정화 방법이 개발됨에 따라 이를 응용하여 포도당산화효소를 고정화시키는 연구가 진행되고 있다. 효소를 고정화시키면 효소의 재사용이 가능해지고 또 효소의 안정성도 증가시킬 수 있어 효소의 단위 역가당 생산성의 향상이 가능하다. 또한 최근에는 효소함유 균체를 직접 고정화시켜 효소의 추출, 정제 비용을 절약하여 효소 생산원가를 대폭 절감시키는 방법이 개발되어 이에 대한 연구가 이루어지고 있다.

지금까지 알려지고 있는 포도당산화효소의 고정화 방법으로는 폴티아크릴아미드에 의한 겔 포괄법, 글루트 알데히드에 의한 가교법, 파라-아미노스티렌법, 다공성 유리구슬(porous glass bead)이나 무공성 유리구슬(non-porous glass bead)을 이용한 공유결합법 등이 발표되어 있으나 이들의 제조방법은 공통적으로 모두가 정제된 효소를 필요로 하여 효소 자체에 화학처리를 하여 고정화시키기 때문에 효소의 불활성율이 높아 효소의 생산원가가 비싸게 되고 또 별도의 공정을 통하여 카탈라제를 동시에 고정화시켜야 하므로 공업적으로 실용화하기에는 여러가지 단점을 가지고 있다.

본 발명은 상기와 같은 여러가지 결점을 개선할 수 있는 새롭고도 진보된 고정화 포도당 산화효소를 이용한 글루콘산의 제조방법에 관한 것인바, 본 발명은 공지와 같이 포도당 산화효소와 카탈라제의 두가지 효소를 별도로 고정화한 후 이들을 다시 혼합하여 사용하는 불편한 공정과는 달리, 고정화 균체를 직접포도당 함유용액에 작용시켜 글루콘산을 생산하는 공정을 개발하는데 있다.

본 발명의 내용을 더 구체적으로 설명하면 포도당 산화효소와 카탈라제를 동시에 생산하여 균체내에 축적하는 미생물을 이미 알려진 방법에 따라 효소생산 조건하에서 배양한 후 배양액을 원심분리 또는 여과법 등에 의해 제거하고 회수된 균체를 습윤균체 그대로 혹은 균체를 건조시킨 후(수분함량 1-90%) 효소생산 균주가 사상균일 경우에는 균사를 절삭기로 절삭하여 사출성형이 용이하도록 처리한 다음, 여기에 건조균체 무게의 10-100% 무게의 젤라틴을 10-40% 수용액으로 만들어 균체와 잘 혼합한 다음 사출 성형기로 사출한다. 이때 사출기의 구경은 고정화효소의 원하는 크기에 따라 0.1-20mm 정도로 조절할 수 있다. 이와 같이 사출된 효소 혼합물을 상온에서 건조 또는 동결건조한 후 적당한 크기로 분쇄하여 과립화한 다음, 10% 글루트 알데히드 수용액 중에서 5분간 처리하여 증류수로 수회 세척하여 상온에서 건조하거나 동결건조시켜 고정화 효소의 표품으로 한다.

본 발명의 제조방법에 의하면 효소균체는 단백물질인 젤라틴에 포괄(entrapping)되며, 그후 젤라틴이 글루트 알데히드에 의해 고정화 되므로 균체 자체가 젤라틴속에 포괄 고정화된다. 이 방법은 기존의 포도당 산화효소의 고정화 방법과는 달리 정제된 효소나 균체를 직접 고정화시키는 것이 아니라, 글루트 알데히드가 젤라틴에 작용하여 젤라틴을 고정화시키고 균체를 고정된 젤라틴 속에 포괄시킴으로써 효소를 고정화시키는 것이므로 기존의 정제된 효소에 글루트 알데히드 등의 가교제를 사용하여 고정화시키는 방법보다 효소의 역가손실을 최소한으로 줄일 수 있으며 또 포도당 산화효소와 카탈라제가 동시에 고정화됨으로 효소의 생산원가를 절감할 수 있고 동시에 복잡한 공정을 간단히 할 수 있는 이점이 있다. 본 발명은 기존 방법들과 비교하여 가교제인 글루트 알데히드의 농도를 더욱 묽게할 수 있으므로 비교적 고가인 글루트 알데히드의 사용량을 줄일 수 있는 장점이 있다. 그리고 본 발명에 의한 방법으로 제조된 고정화 효소는 사출기의 구경을 임의로 조절할 수 있기 때문에 원하는 크기의 과립상으로 제조될 수 있으며 젤라틴의 양과 글루트 알데히드의 농도와 처리시간을 자유로이 조절함으로써 건조후 다시 기질(基質)과 접촉했을때 원하는 강도를 유지할 수 있어 대형 회분식 반응기나 연속식 관형 반응기에 사용이 가능하다. 따라서 본 발명에 의해 제조된 포도당 산화효소 및 카탈라제의 복합 고정화 효소는 포도당 함유용액으로 부터 실험실적 용도는 물론 산업적 규모로 글루콘산을 생산하는데 매우 효과적이다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예증하여 줄 것이나 본 발명의 범위가 이에 국한된다는 것은아니다.

[실시예 1]

포도당 산화효소 및 카탈라제의 생산력이 강한 아스퍼질스속 균주(AB 1301)를 시료균주로 사용한 경우의 효소 생산용 배지의 조성은, 다음 표(1)과 같다.

효소생산균주는 효소생산 배지의 10%에 해당하는 양의 동일한 조성의 전배양 배지에서 배양한 것을 직접 효소생산배지에 무균적으로 전량을 접종한 후 20ℓ의 발효조에서 통기 배양하였다. 30℃에서 48시간 배양 후 균체를 분당 회전속도 7,000에서 연속 원심분리하여 수분함량 약 90%의 균체를 회수하였다. 이 습윤균체 2kg을 증류수로 수회 세척한 후 동결건조시켜 수분함량 약 5%의 건조균체 200g을 얻었다. 이 균체 200g을 절단기로 균사의 길이가 0.1-2mm 이하가 되도록 절단한 후 40% 젤라틴 수용액 100ml을 천천히 가하면서 잘 혼합한 다음 구경 0.7mm의 사출 성형기로 효소-젤라틴 혼합물을 사출시켜 건조한 후 적당한 크기로 분쇄하고 다시 10% 글루트 알데히드 수용액에서 5분간 처리한 다음 증류수로 5-6회 세척하였다. 세척된 제품을 동결건조하여 약 210g의 포도당 산화효소 및 카탈라제의 복합 고정화효소의 과립을 얻었다. 효소역가의 수율은 카탈라제가 건조균체의 35%였고 포도당 산화효소의 경우는 건조균체의 30%였다.

[표 1]

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 건조균체 50g을 절단기로 균사의 길이가 0.1-2mm 되도록 절단한 후 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 10%가 되도록 10%의 젤라틴 수용액으로 효소-젤라틴 혼합물을 만든 다음 구경이 0.7mm인 사출기에서 사출형성하고 다시 10%의 글루트 알데히드 수용액에서 5분간 처리하고 증류수로 5-6회 세척하였다. 세척된 시료를 동결건조한 결과 약 45g의 포도당 산화효소와 카탈라제가 함유된 복합고정화효소의 과립을 얻었다. 효소역가의 수율은 포도당 산화효소 기준으로 건조균체 효소역가의 32%이었고 카탈라제 기준으로는 건조균체 효소역가의 38%이었다.

[실시예 3]

실시예 1에서 얻은 건조균체 50g을 절단기로 균사의 길이가 0.1-2mm 되도록 절단한 후 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 20%가 되도록 20%의 젤라틴 수용액으로 효소-젤라틴 혼합물을 만든 다음 구경이 0.7mm인 사출기에서 사출 성형하고 다시 10%의 글루트 알데히드 수용액에서 5분간 처리하고 증류수로 5-6회 세척하였다. 세척된 시료를 동결건조한 결과 52g의 포도당 산화효소와 카탈라제가 함유된 복합 고정화효소의 과립을 얻었다. 효소역가의 수율은 포도당 산화효소 기준으로 건조균체 효소역가의 30%이었고 카탈라제 기준으로는 건조균체 효소역가의 35%이었다.

[실시예 4]

실시예 1에서 얻은 건조균체 50g을 절단기로 균사의 길이가 0.1-2mm 되도록 절단한 후 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 30%가 되도록 30%의 젤라틴 수용액으로 효소-젤라틴 혼합물을 만든 다음 구경이 0.7mm인 사출기에서 사출 성형하고 다시 10%의 글루트 알데히드 수용액에서 5분간 처리하고 증류수로 5-6회 세척하였다. 세척된 시료를 동결건조한 결과 약 50g의 포도당 산화효소와 카탈라제가 함유된 복합고정화효소의 과립을 얻었다. 효소역가의 수율은 포도당 산화효소 기준으로 건조균체 효소역가의 25%이었고 카탈라제 기준으로는 건조균체 효소역가의 35%이었다.

[실시예 5]

실시예 1에서 얻은 건조균체 50g을 절단기로 균사의 길이가 0.1-2mm 되도록 절단한 후 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 40%가 되도록 40%의 젤라틴 수용액으로 효소-젤라틴 혼합물을 만든 다음 구경이 0.7mm인 사출기에서 사출성형하고 다시 10%의 글루트 알데히드 수용액에서 5분간 처리하고 증류수로 5-6회 세척하였다. 세척된 시료를 동결건조한 결과 약 80g의 포도당 산화효소와 카탈라제가 함유된 복합고정화효소의 과립을 얻었다. 효소역가의 수율은 포도당 산화효소 기준으로 건조 균체 효소 역가의 28%이었고 카탈라제 기준으로는 건조균체 효소역가의 30%이었다.

[실시예 6]

실시예 1에서 얻은 건조균체 50g을 절단기로 균사의 길이가 0.1-2mm 되도록 절단한 후 젤라틴 함량이 건조균체 무게의 100%가 되도록 40%의 젤라틴 수용액으로 효소-젤라틴 혼합물을 만든 다음 구경이 0.7mm인 사출기에서 사출성형하고 다시 10%의 글루트 알데히드 수용액에서 5분간 처리하고 증류수로 5-6회 세척하였다. 세척된 시료를 동결건조한 결과 약 80g의 포도당 산화효소와 카탈라제가 함유된 복합고정화효소의 과립을 얻었다. 효소역가의 수율은 포도당 산화효소 기준으로 건조균체 효소역가의 28%이었고 카탈라제 기준으로는 건조균체 효소역가의 30%이었다.

[실시예 7]

실시예 1의 방법에 의해 제조된 포도당 산화효소 및 카탈라제의 복합 고정화 효소 0.5g을 산소로 포화된 5.4%의 포도당 수용액 150ml를 기질로 하여 반응온도 30℃, 반응액의 pH5.5를 유지하며 2시간 반응시켰을 때 포도당의 글루콘산으로의 변화율은, 약 0.6%였다. 이때 반응액은 충분한 양의 공기를 공급해주며 산소의 포화상태를 유지하였으며, 산 생성에 따라 떨어지는 pH는 수산화나트륨 수용액을 가하여 일정한 pH를 유지하였다. 이 고정화 효소를 반응용액으로부터 여과회수하여 증류수로 수회 세척한 뒤 다시 새로운 기질(5.4% 포도당 수용액)을 가하여 같은 조건하에서 10회 반복했을 때의 효소 활성은 다음 표 (Ⅱ)와 같았다.

[표 2]

[실시예 8]

실시예 1의 방법에 의해 제조된 포도당 산화효소 및 카탈라제의 복합 고정화효소 10g을 산소로 포화된 5.4% 포도당 수용액 150ml을 기질로 하여 반응액의 pH를 5.5로 유지하며, 반응온도 30℃에서 반응액중의 산소포화도를 유지시키기 위해 분당 1.5ℓ 이상의 공기를 공급하며 14시간 동안 회분석 반응조에서 반응시켰을 때 포도당의 90%가 글루콘산으로 변하였다. IRC 120의 양이온 교환수지 컬럼(4×24cm)에 통과시켜 양이온을 제거하고 이 용액을 앰버라이트 IRA 410의 음이온 교환수지의 컬럼(4×24cm)에 통과시켜 글루콘산을 음이온 교환수지에 흡착시킨 다음 컬럼을 증류수로 세척하고 흡착된 글루콘산을 0.8% 가성소오다 용액을 통과시켜 희수하고 회수된 글루콘산을 글루콘산칼슘의 결정으로 석출시켜 회수한 결과 7.4g이었다.

[실시예 9]

실시예 1의 방법에 의해 제조된 복합 고정화효소 10g을 산소로 포화된 l4%의 이성화당 수용액(과당과 포도당의 45:55 혼합물이며 고형분 함량은 70%) 150ml을 기질로 실시예 8과 같은 반응 조건하에서 24시간 반응시켰을 때 포도당 96%가 글루콘산으로 변하였다. 이 반응 용액을 실시예 8과 같이 양이온과 음이온 교환 수지를 통과시켜 글루콘산을 회수한 결과 글루콘산 칼슘으로 7.7g이었다.

Claims (1)

1. 포도당 함유 수용액으로부터 글루콘산을 제조함에 있어 포도당산화효소와 카탈라제의 활성을 동시에 갖고 있는 미생물을 배양하여 균체를 회수한 후 균체 자체를 효소원으로 사용하되 이를 건조시키거나 습윤균체(수분함량 90% 이하) 상태로 사용하며, 여기에 건조균체 무게의 10-100%에 해당하는 젤라틴을 10-40% 수용액으로 만들어 균체와 혼합하고 과립상으로 성형한 다음 이 과립화된 효소-젤라틴 혼합물을 건조시킨 후 10%의 글루트 알데히드 수용액으로 5분간 처리하여 포도당 산화효소 및 카탈라제의 활성을 함께 가지고 있는 복합고정화 효소를 제조함을 특징으로 하는 고정화 포도당 산화효소의 제조방법.