JPS592691A - アルコールおよび糖質の酸化法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酸化発酵菌を用いてアルコールおよび糖質の
酸化を効率的に行ない、酸化反応生成物を実用的に得る
方法に関する。さらに詳しくは、酸化発酵菌体を高分子
のゲルに包括固定化することと、反応時の環境を酸素加
圧状態下に置くことの組合わせ罠よって、アルコールお
よび糖質を立体特異的、高選択率、高収率および高速度
で酸化反応を行うことができる新規な方法を提供するも
のである。

酸化発酵とは、微生物が有機物を酸化する場合、基質の
不完全酸化忙より中間代謝産物が多量に蓄積する発酵の
場合を云うが、この酸化発酵は、さらに次の二つに分類
できる。一つは、−次酸化発酵と呼ばれるもので、酢酸
菌やシュードモナス菌によるグルコン酸やソルボース発
酵などのように基質の直接酸化（脱水素）のみが関与す
る場合で、他の一つは二次酸化発酵と呼ばれるもので、
糸状菌によるクエン酸、アロイソクエン酸、フマール酸
、シュウ−発酵などのように、基質と著しく構造を異に
する化合物を作る場合である。本発明者らは、このなか
で、前者の一次酸化発酵を対象として研究を行ない、本
発明を達成するに到った。

従来、微生物によるアルコールおよび糖質（本明細書中
、アルコールとは、低級から高級、１価から多価、鎖状
から環状すべてのアルコールを指し、糖質とは、糖、糖
アルコール、配糖体、糖タンパクおよび糖脂質すべての
糖類を指す）の酸化反応が、立体特異的選択性をもって
進行する特徴を生かして、工業的な生産手段として古く
から用いられてきた。例えば、エタノールから食酢の製
−＼〜〜− 造、Ｄ−グルコースから食品加工用のグルコン酸の製造
、Ｄ−ソルビトールからビタミンＣの合成の中間体であ
るＬ−ソルボースの製造、Ｄ−グル６、、、、、、−、
−−、、、、、＝、−コースからビタミンＣ合成中間体
である５−ケト−アラボアスコルビン酸合成中間体の２
−ケトーＤ−グルコン酸の製造、食品や化粧品用のジヒ
ドロキシアセトンの製造というように、多数有用な生産
に用いられている。

これら発酵による工業的生産手段は、前述の長所を持っ
ているため古くから行われてきたが、反面法のような短
所を持っている。それは、第１Ｋ目的の物質の生産が酸
化発酵菌の増殖に同調もしくは追随して進行するためＫ
、一般の化学反応と比較して反応時間が長いことである
。第２に酸化発酵菌の増殖の期間、他の細菌の混入によ
る汚染を常に防がなければならないことである。第３に
発酵の終了後の培養液から目的とする反応生成物を得る
場合、あらかじめ発酵培地に添加した酸化発酵菌の増殖
に必要な栄養物質やミネラル、ビタミン等の微量物質を
除去し、酸化発酵菌による着色、着臭物質および菌体自
身の除カを行わなければならないときである。第４に発
酵法は、菌体の増殖と目的とする生成物の生産条件が一
般忙異なるため、バッチ式反応装置が用いられることが
多く、連続化が難しいことである。

以上述べたような短所を持つため、従来の発酵法による
生産は、多大の設備投資と維持費を必要とし、また排水
処理等公害対策の上から立地条件が制約されるために経
済性の問題を持っている。

上記の如き欠点を解決するため、近年、微生物を固定化
して反応を定常的かつ連続的に行おうとする試みがなさ
れている。固定化された微生物菌体の調製方法には、種
々の方法が提案されてきている。例えば、（１）担体結
合法と称し、水不溶性の担体に微生物を結合させる方法
で、物理的に吸着させる方法、イオン的に結合させる方
法、および共有結合によって結合させる方法が含まれる
。（２）架橋法と称し、微生物菌体を２個またはそれ以
上の官能基をもった試薬で架橋する方法。（３）包括法
と称し、微生物を天然もしくは合成の高分子ゲルの微細
な格子の中に包み込む格子型包括法と、半透膜性の高分
子皮膜によって被覆するマイクロカプセル型包括法があ
る。

これらの方法の中で、（１）の担体結合法の中の共有結
合によって結合する方法や（２）の架橋法は、固定化の
際の条件が厳しいため、微生物の持つ酵素活性が失なわ
れたり、微生物の増殖がさまたげられたりする欠点があ
る。（３）の包括法の中のマイクロカプセル型の方法は
、固定化を行う場合の操作が煩雑である上、調製時に使
用する試薬および有機溶媒によシ、微生物の持つ酵素活
性が低下するという欠点がある。（１）のイオン結合法
は、水不溶性担体と微生物との結びつきが弱いために、
イオン強度の高い条件下や微生物が増殖する際、微生物
菌体が担体から脱離しやすい欠点がある。（１）の物理
的吸着法は、イオン結合法よシもさらに結合力が弱いた
めに、微生物菌体の脱離が甚しい欠点がある。これらの
方法に比し、（３）の包括法の中の格子型の方法は、微
生物の固定化の操作が簡単であり、微生物の酵素活性の
保持性も高く、包括用の高分子ゲルからの微生物の脱離
は、増殖の場合も認められないなど優れた方法であるた
めに、微生物菌体の固定化法としては最もよく用いられ
るが、反応の際、基質が包括用高分子ゲルの微細な格子
中を通過して、酵素活性のある微生物菌体まて到達し、
また逆に出ていかなければならないため、反応に時間が
かかる欠点含有している。

本発明者らが用いた固定化方法は、この格子型包括法で
ある。

前記の如き短所を克服するために、近年、酵素や微生物
菌体を固定化して、反応の供給液に微生物の栄養物質や
ミネラル、ビタミン等の微量物質を全く添加しないか、
添加しても微量もしくは一部のみのものを用いて、目的
の反応物質の回収精製が容易な連続プロセスの研究が進
んでいる。実際、この方法でＬ−アスパラギン酸やＬ−
リンゴ酸の製造などが工業的に実施されている。

しかしながら、これら工業化されている技術は、すべて
固体である固定化酵素もしくは微生物菌体と、液体であ
る反応基質水溶液とから成る固液二相系の反応であって
、本発明の対象とするアルコールおよび糖質の酸化反応
のように１気体である酸素を必要とする気液固三相系の
反応に関するものは全く見られない。

その主な理由は、基質である気体の酸素が、固定化菌体
による反応では供給不足になるために、生産速度が著し
く低下し、実用上生産手段として用いることができない
からである。そこで、この酸素の供給を充分に行うため
に、固定化菌体と酸素の接触を良くする工夫が色々と試
みられてきている。例えば、反応装置としては、菌体を
高分子ゲルで固定化した円盤状のネットを同軸上に多数
釜べて取りつけ、酸素と反応基質水溶液の界面で回転す
るようにしたものや、あるいは多量のビーズ状固定化菌
体を回転軸に取シ付けた十字型のバスケットの中に入れ
、これを上記と同様、気液の界面で回転させるようＫし
たものなどの報告がある。しかしながら、これらの装置
は、複雑で運転動力が大きいにもかかわらず反応の速度
は未だ遅く、工業的に実施できるような生産効率を得る
までＫは到っていない。

本発明によれば、酸化発酵菌を高分子ゲルで包括固定化
し、これを酸素加圧の状態下、反応の基質水溶液と接触
させるという工業上実施し易い方法で反応の速度が著し
く加速される。

微生物の加圧酸素に対する抵抗性（適応性）′ｆ：。

考えると、微生物の進化の過程において、まず最初に地
球上に出現したものは嫌気性微生物でアシ、ついで好気
性微生物が出現したものと考えられている。この長い地
球の歴史において、微生物が現在よりも何倍も高い酸素
濃度の下に置かれた経験はなく、酸素に対する抵抗性を
獲得した好気性の微生物といえども、高濃度の酸素に対
する適応性はかなり狭いものである。一方、圧力に対し
ては深海忙おいて発見される微生物に認められる如く、
水圧に対する抵抗性は非常に高く、加圧酸素条件下にお
ける微生物にとって問題なのは酸素濃度である。

本発明において加圧酸素条件下と呼ぶのは、純酸素を用
いた場合の大気圧（７６０ｍｎＨｇ　）以上の状態を指
す。つまシ、地表上の空気中に比較し、約５倍以上の濃
度の雰囲気をいう。また加圧酸素の上限は特に限定され
るものではないが、１０の二乗のオーダーである。

従来、酸化発酵菌のように好気性の微生物を用いる発酵
生産の場合、反応速度を上げるために、反応槽へ供給す
る空気の圧力を上げたり、酸素濃度を高めた気体を用い
ることは知られていた。そこで、本発明のように反応を
酸素の加圧状態下におくことＫより、酸素の供給を充分
に行々い反応速度を上けることは推測できるよってある
が、実際には不可能な方法であった。なぜならば、一般
に酸化発酵菌のような好気性の微生物にとって、酸素は
生命を維持する上で必須のものであるが、るる濃度以上
の酸素に晒されると、酸素が生体に毒として働らき、微
生物の生育を逆に阻害することが知られているからであ
る。

通常の好気性細菌の場合、数気圧の酸素加圧下では、そ
の増殖能は全く停止するかもしくは死滅してしまい、増
殖後の菌体でもその菌体の持つ種々の酵素活性が失なわ
れてしまうことが知られている。事実、ンルビトールを
ソルボースへ酸化する能力を持つグルコノバクタ−・サ
ブオキシダンスの場合、６０容量−の酸素濃度の気体を
供給した発酵では、空気を供給する場合の約半分の酸化
能力に低下してしまい、２気圧の酸素下では全く酸化に
進行しない。上記のソルボ−ス発酵の場合、工業的には
２気圧の空気または４ｏ容量−の酸素を含む高濃度空気
が用いられるが、これは酸素濃度で見ると空気の２〜３
倍の程度であって、本発明のように５倍以上（実施例で
は５０〜２５０倍で効果が顕著）という高濃度の酸素濃
度下に反応を行うことは全く考えられない条件であった
。

しかしながら、本発明においては、これらの過去の知見
に反して、酸素加圧下においても高分子ゲルで酸化発酵
菌体を包括固定化することにより、菌体の酵素活性を失
なうことなく長時間安定に反応を続けることができた。

過去の研究では、高分子ゲルに包括固定化された菌体は
遊離の菌体に比べて、温度やｐＨに対する安定性が向上
することが報告されているのに留意し、酸素の圧力に対
する安定性の向上の万一の可能性をテストした結果、前
述のごとき酸素の毒性に対しても安定性の向上すること
が・確認された。そして、遊離の菌体の場合、酸素加圧
下では、そのアルコールや糖質の酸化活性の寿命が著し
く短かかったのに対し、高分子ゲルで包括固定化した菌
体では、寿命が驚くほど長く安定である事実も確認でき
た。たソし、この事実に関する理論的理由は、現在のと
ころ明らかてない。

以上述べたように、本発明は、アルコールや糖質を酸化
する能力をもった菌体を高分子のゲルで包括固定化し、
反応を酸素加圧状態下で行うという工業上実施し易い方
法で、従来の発酵法の短所を充分克服できたのであるが
、本発明の応用範囲をさらに広く横側したところ、酸素
を基質として生育する微生物のアルコールや糖質の酸化
反応のすべてに適用できるものであった。

例えば、アセトバクター・アセチによるエタノールから
酢酸への変換、グルコノバクタ−・サブオキシダンスに
よるＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの変換、同
じくグルコノバクタ−・サブオキシダンスによるＤ−グ
ルコースから５−ヶ）−Ｄ−グルコン酸への変換、シュ
ードモナス・フルオレッセンスによるＤ−グルコースか
ら２−ヶ）−Ｄ−グルコン酸への変換、グルコノバクタ
−サブオキシダンスによるグリセ１リンからジヒドロキ
シアセトンへの変換、アスペルギルス・ニガーによるＤ
−グルコースからグルコン酸への変換、およびペニシリ
ウム・ツタツムによるＤ−グルコースからＤ−アラボア
スコルビン酸への変換など、広範囲の酸化反応に適用が
可能である。

本発明の固定化菌体の調製の除用いる高分子ゲルの材料
の酸化反応の能力に及はず影響を検討した結果、天然多
糖類であるアガロース、Ｋ−カラギーナンおよびアルギ
ン酸が適しておシ、合成高分子であるポリアクリルアミ
ドや、半合成高分子であるセルロースアセテートは適し
ていないことが判った。

以下、本発明の実施例を挙げて説明する。

実施例１ Ｄ−ソルビトール１３重量％、コーンステイープリカー
２重量％、炭酸カルシウム０．３重量％よシ成る培地に
グルコノバクタ−・サブオキシダンスを接種し、５０℃
、２４時間振盪培養を行った。

培養終了後、遠心分離機にて集菌した生菌体（乾燥重量
換算５１５ｍ１）を１３重量％のＤ−ソルビトール水溶
液２−にけん濁し、これに４重量−のアルギン酸ソーダ
水溶液４−を加え、よく攪拌混合した。この混合液を０
．１モルの塩化カルシウム水溶液中で直径約０．４１１
１の繊維状に紡出した後、約１ｃＷＩの長さに切断し固
定化菌体を得た。この固定化菌体に１３重量％のＤ−ソ
ルビトール水溶液５０−を添加し、容量１００−の攪拌
装置付小型圧力容器中、３０℃で毎分６４０回転の攪拌
を行ない、空気もしくは酸素の所定の圧力を加えて反応
を行った。Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの変
換反応の経時的変化の結果を図面に示した。空気の常圧
下で反応を行った場合、４時間後わずか１７チの変換率
であったが、酸素の２０気圧下では９１％、５０気圧下
では９９チの交換率であった。

実施例２ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算６６５ｒＩ＃
９）を１５重量％のＤ−ソルビトール水溶液１０−にけ
ん濁した。この菌体けん濁液ｔｌ−２分割し、一方のけ
ん濁液５ｔｄＫ、４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液１
０ゴを加えよく混合し、０．１モルの塩化カルシワム水
溶液中へ滴下し、直径約０．５〜１，０１１のビーズ状
の固定化菌体を得た。

他方、５−の菌体けん濁液は、固定化合行わず遊離菌体
のま＼反応に供した。反応の基質は１３重量％のＤ−ソ
ルビトール水溶液５０−をそれぞれ加え、反応は温度３
０’Ｃ，２時間、毎分４００００回転拌を行ない、酸素
を１０１ｇ／ｍ・Ｇの加圧下で行った。反応が終ると、
固定化菌の方は戸別し、蒸留水で洗浄後、同条件下、再
び反応を行った。一方、遊離薗の方は反応後遠心分離機
にて集ｍｌ、、１３重量％のＤ−ソルビトール水溶液５
ｄにけん濁した後、同条件下、再び反応を行った。

このようにして繰り返し反応を行った時のＤ−ソルビト
ールからＬ−ソルボースへの変換率および初回反応時の
変換率に対する残存活性を求めた結果を表１に示す。表
１よシ、固定化菌の場合は、１０回繰り返し使用後の残
存活性は、初期の約８７−を示していたが、遊離の菌の
場合は全く活性を失なってい友。

表　　１　　　　　　　　　　　（単位ニー）実施例５ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・茗プオキシダンス生菌体（乾燥重量換算１９４〜）を
１３重量％のＤ−ソルビトール水溶液１０−にけん濁し
た。この菌体けん濁液に４重量−のアルギン酸ソーダ水
溶液２０＋ｄを加えよく混合し−１０，１モルの塩化ナ
トリウム水溶液中へ滴下することによシ、直径０．５〜
１　ａｌｌのビーズ状の固定化菌体を得た。一方、この
グルコノバクタ−・サブオキシダンスの菌株を常法によ
シマイトマイシンＣｔＣて変異処理を行った後、小型圧
力容器中、実施例１の培地組成を持つ２．５重量％寒天
プレートに植菌し、酸素圧力の徐々に高い条件下へ植え
継ぎながら、選択取得した。このようにして得られた１
［１ｋｙ／ｄ−Ｇの酸素耐性変異株を実施例１と同様に
して培養、集菌したグルコノバクタ−・サブオキシダン
ス酸素耐性変異株の生菌体（乾燥重量換算１９０＃Ｉｐ
）を用いて、同上の方法で固定化菌体を得た。このよう
にして得た２種の固定化菌体を、容量５００−１攪拌装
置付の圧力容器に入れ、１５重量％のＤ−ソルビトール
溶液が常に１５０Ｗ１を滞留するように、毎分１２−の
速さで連続的に流した。反応は１０ｋｐ／ｄ・Ｇ酸素加
圧下、３０℃、毎分４８回転で攪拌しながら行った。こ
の時のＬ−ソルボースへ変換の半減期とその間の平均変
換率を表２に示す。

表　　２ 実施例４ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算１９０ダ）を
１３重量−のＤ−ソルビトール水溶液２ｔｐｔｌＫけん
濁したものを、各種の高分子で包括固定化した。用いた
高分子の種類はアクリルアミド、セルロースアセテート
、アガロース、Ｋ−カラギーナンおよびアルギン酸ソー
ダの５種類である。各種固定化菌体の作成方法金欠に載
げる。

まずアクリルアミドの場合は、５ｃｈｎａｒｒらの方法
［Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
、　５５　、７３２（１９７７））に準じて行った。つ
まシ、用いた菌体けん濁液は４．２　ｍ　（蒸留水で希
釈）、アクリルアミドは１，５ｓｄ、ＴＩＭＥＤは０．
１−、アンモニウムパーザルフエイトは０．２−である
。固定化彼、ゲルは１片２〜３　Ｉｌｌの立方体状に切
断した。次にセルロースアセテートの場合は、ジアセテ
ートの３０チアセトン溶液４ｆｎ１．に前述の菌体けん
濁液２−を添加混合後、ドライアイス・メタノール中へ
滴下し、ビーズ状に保った後、真室で有機溶媒を除去し
た。ビーズの大きさは直径約２〜５　＋１１１１となる
ように調整した。アガロースの場合は、５０〜６０℃、
４重量％のアガロース水溶液に前述の菌体けん濁液１−
をすげやく添加混合後、０〜１℃で固化させた。これを
−片２〜５　ｍ１ｍの立方体状に切断した。Ｋ−カラギ
ーナンの場合は、千畑らの方法（’Ｅｎｒｏｐ、　Ｊ＋
Ａｐｐ１０Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ。

７．１６１　　（１９７９））に準じて行った。つまり
、４０℃、６重量−〇に一カラギーナンゲル４−に、前
述の菌体２−をすばやく添加混合後、２％ＫＣＬ溶液中
へ滴下を行ない、ビーズ状のゲルを作成した。ビーズの
直径は約２〜３１１１１になるよう調製した。最後にア
ルギン酸ソーダの場合は、４重量％のアルギン酸ソーダ
水溶液４−に、前述の菌体けん濁液２−を添加混合後、
０．１モルの塩化力ルシワム水溶液中へ滴下、シ、ビー
ズ状に固化させた。

ビーズの直径は約２〜３１１ＩＩＫなるように調製した
。

以上のように調製した５種の固定化菌体ゲルに、１３重
量％のＤ−ソルビトール水溶液５０＠１！ｉ添加し、容
量１００−の攪拌装置付小型圧力容器中で、３０℃で毎
分２００回転の攪拌を行ない、１０ｋｇ／ｄ・Ｇ酸素加
圧下で５時間反応させた。この時のそれぞれの高分子ゲ
ルにおけるＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースへの変
換率の結果を表３に示した。

表　　５ 実施例５ グルコース１０重量％、コーンスチープリカー０．５重
量％、炭酸カルシタム２．５重量％、硫酸マグネシウム
０．０１重量％、燐酸二水素カリウム０．０５重量％を
含む培地に、アスペルギルス・ニガーを接種し、２７℃
、４８時間、振盪培養を行った。培養終了後、遠心分離
機にて集菌した生菌体（乾燥重量換算５１０１Ｑ）ｉ１
０重量％のＤ−グルコース水溶液２ｍ１Ｋけん濁した。

これに４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液４ｄを加え、
よく攪拌混合した後、０．１モルの塩化カルシウム水溶
液中で直径約０．７罪の繊維状に紡出した。この繊維状
固定化ゲルを約１ｃｒｎの長さに切断した。この固定化
菌体に１０重量％のＤ−グルコース水溶液５０−を添加
し、容量１００−の攪拌装置付小型圧力容器中、２７℃
で毎分４００回転の攪拌を行ない、空気雰囲気で常圧下
で５時間反応を行った時のグルコン酸への変換率は１４
チであった。次に酸素を１０に９／ｃｉｌ−Ｇで加圧下
、同条件で反応を行った時の変換率は９４チで、はソ定
量的に進行していた。

実施例６ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算２ｏｏｍｙ）
を１０重ＪＩＳのグリセロール水溶液２ＩＩＩＩＩにけ
ん濁した。このけん濁液に４重量％のアルギン酸ソーダ
水溶液４−を加え、よく攪拌混合した。この混合液を０
．１モルの塩化力ルシワム水溶液中で直径約０．７ｍｍ
の繊維状に紡出した後、約１ｃＷＩの長さに切断し固定
化菌体を得た。この固定化菌体に１０重量％のグリセロ
ール水溶液５〇−全添加し、容量１００−の攪拌装置付
小型圧力容器中、３０℃で毎分４００回転の攪拌を行な
い、空気で常圧下５時間反応を行った時のジヒドロキシ
アセトンへの変換率は７．５チであった。次に酸素を１
０　ｋｇｌｃｔｌ　−Ｇで加圧下、同条件で反応を行っ
た時の変換率は８７チであった。

実施例７ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクター
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算２００４）を
１０重量％のＤ−グルコース水溶液２ゴにけん濁した。

このけん濁液に４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液４−
を加え、よく攪拌混合した。この混合液全０．１モルの
塩化カルシウム水溶液中で直径約０．７１１Ｉ１１の繊
維状に紡出した後、約１ｃｒｎの長さに切断し固定化菌
体を得た。この固定化菌体に１０−量チのＤ−グルコー
ス水溶液５０−を添加し、容量１００−の攪拌装置付小
型圧力容器中、５０℃で毎分４００回転の攪拌を行ない
、空気で常圧下　５時間反応を行った時の５−ケ）−Ｄ
−グルコン酸への変換率は９％であった。次に酸素＝１
１ｏｋｇ／ｃｄ・Ｇで加圧下、同条件で反応を行った時
の変換率は６９％でめった。

実施例８ 酵母エキス０．５重量％、ポリペプトン０．２重量％、
グルコース３．０重量％、酢酸１．０重量％およびエタ
ノール４．０重量％を含む培地にアセトノククター・ア
セチを接種し、３０℃、７２時間振盪培養を行った。培
養終了後、遠心分離機にて集菌した生菌体（乾燥重量換
算１８０〜）を、４．０重量−のエタノール及び１．０
重量％の酢酸を含む水溶液２−にけん濁した。このけん
′濁液に４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液４ｒｒ１１
！を加え、よく攪拌混合し、０．１モルの塩化カルシウ
ム水溶液中で直径約０．４龍の繊維状に紡出した後、約
１Ｃｒｎの長さに切断し固定化菌体を得た。この固定化
菌体に、４重量％のエタノールおよび１重量−の酢酸を
含む水溶液５０−を添加し、容量１００−の撹拌装置付
小型圧力容器中、６０℃で毎分４００回転の攪拌を行な
い、空気で常圧下５時間反応を行った時のエタノールか
ら酢酸への変換率は１５チであった。次に酸素を１０ｋ
ｇ／ｃｍ・Ｇで加圧下向条件下で反応を行った時の変換
率は８８％であった。

実施例９ グルコース５．０重量％、ペプトン１．０重′！！＃、
％、牛肉エキス１．０重量ｆＩを含む培地にシュードモ
ナス・フルオレッセンス’ｋｍｌｉＬ、５０℃、２４時
間振盪培養を行なった。培養終了後、遠心分離機にて集
菌を行った生菌体（乾燥重量換算３ｓＯ＃＋＆）を１０
重量−のＤ−クルコース水溶液２−にけん濁した。この
けん濁液に４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液４−を加
え、よく攪拌混合し、０．１モルの塩化カルシウム水溶
液中で直径約０．７鶴の繊維状に紡出した後、約１ｃｒ
ｎの長さに切断し固定化菌体を得た。この固定化菌体に
１０重量％のＤ−グルコース水溶液５０ｄｔ−添加し、
容量１０ローの攪拌装置付小型圧力容器中、３０℃で毎
分４００回転の攪拌を行ない。空気で常圧下５時間反応
を行った時のＤ−グルコースから２−ヶ）−Ｄ−グルコ
ン酸への変換率は１１％であった。次に酸素ｔ−１０ｋ
ｇ／ｃｄ−Ｇで加圧下、同条件で反応を行った時の変換
率は７８チであった。

実施例１０ グルコース５重量％、麦芽エキス２重量％、ペプトン０
．１・重量％を含む培地にペニシリワム・ツタツムを接
種し、３０℃、４８時間振盪培養を行った。培養終了後
、遠心分離機にて集菌を行った生菌体（乾燥重量換算４
００ダ）を１００重量％Ｄ−グルコース水溶液２ｄにけ
ん濁した。このけん濁液に４重量−のアルギン酸ソーダ
水溶液４ｄを加え、よく攪拌混合し、０．１モルの塩化
カルシウム水溶液中で直径約０．７１ＲＨの繊維状に紡
出した後、約１ｃｒｎの長さに切断し固定化菌体を得次
。この固定化菌体に１０重量％のＤ−グルコース水溶液
５０２ｄｆ：添加し、容量１００−の攪拌装置付小型圧
力容器中、５０℃で毎分４００回転の攪拌を行ない、空
気で常圧下５時間反応を行った時のＤ　−クルコースか
らＤ−アラボアスコルビン酸への変換率は６チであった
。次に酸素を１０ｋｇ／ｃｍ・Ｇで加圧下、同条件で反
応を行った時の変換率は２７チであった。

【図面の簡単な説明】

図面は実施例１におけるＤ−ソルビトールからＬ−ソル
ボースへの変換反応の静時的変化の結果を示すグラフで
ある。 ２　　　４　　　６　　　８ 人人角周（ｈｒ） 第１頁の続き ＣＩ２　Ｒｉ／８０　）　　　　　　　　　６７６０−
４Ｂ＠発　明　者　相田浩 浦和市根岸２−１６−５ 手続補正書 昭和５７年１１月３０日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １　事件の表示 特願昭５７−１１０６７４号 ２　発明の名称 糖質の酸化法 ５　補正をする者 事件との関係・特許出願人 （０４６）旭ダウ株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ピル５階
６　補正の内容 明細書第２６頁１１行と１２行の間に下記の記載を挿入
する。 ［実施例１１ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算４０ダ）を５
重量％のＤ−ンルビトール水溶液０．５−にけん濁し、
これに４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液１−を加え、
よく攪拌混合した。この混合液を０．１モルの塩化カル
シウム水溶液中へ滴下することによシ、直径０．５〜Ｉ
　Ｉｍのビーズ状の固定化菌体を得た。これを内容積３
０−（直径１８ｍ１）の耐圧反応管に入れ、５重量％の
Ｄ−ンルビトール水溶液１０−を添加し、２７℃、５時
間、毎分１３０回の往復振盪下、反応を行った。 反応後の結果は、空気で常圧下行った場合、酸素で４　
ｋｇｌｃｒｌ　−Ｇの圧力下で行った場合、および酸素
で８ｋｇ／ｄ−Ｇの圧力下で行った場合のＬ−ンルポー
スへの変換率が、それぞれ１３％、４２％。 および７３％であった。 実施例１２ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算４０■）を５
重量−のプロピレングリコール水溶液０．５〜Ｉにけん
濁し、これに４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液１−を
加え、よく攪拌混合した。 この混合液を０．１モルの塩化カルシウム水溶液中へ滴
下することにより、直径０．５〜１１８１１のビーズ状
の固定化菌体を得た。これを内容積３０７ｄ（直径１８
ｍ＋ｉ）の耐圧反応管に入れ、５重量％のプロピレング
リコール水溶液１０−を添加し、２７℃、５時間、毎分
１５０回の往復振盪下、反応を行った。反応後の結果は
、空気で常圧下行った場合、酸素で４　ｋｇ、、’ｉ・
Ｇの圧力下で行った場合、および酸素で８　ｋｐ／ｍ・
Ｇの圧力下で行った場合のアセトールへの変換率が、そ
れぞれ４％、３１％、および５５チであった。 実施例１３ 実施例１゛と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ
−・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算４０Ｉｖ）
を５重量％の２，３−ブタ／ジオール水溶液０．５ｍ１
Ｋけん濁し、これに４重量％のアルギン酸ソーダ水溶液
１−を加え、よく攪拌混合した。 この混合液全０．１モルの塩化カルシウム水溶液中へ滴
下することにより、直径０．５〜１非のビーズ状の固定
化菌体を得た。これを内容積３０−（直径１８　ｍｒａ
　）の耐圧反応管に入れ、５重量％の２，３−ブタンジ
オール水溶液１０ゴを添加し、２７℃、５時間、毎分１
５０回の往復振盪下、反応を行った。反応後の結果は、
空気で常圧下行った場合、酸素で４に９／ｃＩ／ｌ−Ｇ
の圧力下で行った場合、および酸素で８　ｋｇ　／　ａ
ｉｒ・Ｇの圧力下で行った場合のアセトインへの変換率
が、それぞれ１１％、４２％、および７／７チであった
。 実施例１４ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算４０■）を５
重量％のグリセリン水溶液０．５　ｔｎｔにけん濁し、
これに４重量−のアルギン酸ソーダ水溶液１−を加え、
よく攪拌混合した。この混合液を０．１モルの塩化カル
シウム水溶液中へ滴下することＫより、直径０．５〜１
１１１１のビーズ状の固定化菌体を得た。これを内容積
！１０ｄ（直径１８１１）の耐圧反応管に入れ、５重量
％のグリセリン水溶液１０−を添加し、２７℃、５時間
、毎分１３０回の往復振盪下、反応を行った。反応後の
結果は、空気で常圧下行った場合、酸素で４に９／ｃｍ
・Ｇの圧力下で行った場合、および酸素で８ｋｇ／ｄ−
Ｇの圧力下で行った場合の２，５−ジヒドロキシアセト
ンへの変換率が、それぞれ４％、５０％、および９２チ
であった。 実施例１５ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算４０〜）を５
重量％のＬ−アドニトール水溶液０．５−にけん濁し、
これに４重量％のアルギン酸ソーダ水溶液１−を加え、
よく攪拌混合した。この混合液を０．１モルの塩化カル
シウム水溶液中へ滴下することによシ、直径０．５〜Ｉ
　ｎ１１のビーズ状の固定化菌体を得た。これを内容積
３０−（直径１８１１ｍ）の耐圧反応管に入れ、５重量
％のＬ−７ドニトール水溶液１１′艷を添加し、２７℃
、５時間、毎分１３０回の往復振盪下、反応を行った。 反応後の結果は、空気で常圧下行った場合、酸素で４ｋ
ｙ／ｃｄ−Ｇの圧力下で行った場合、および酸素で８　
ｋｐ／ｃ＋＋！−Ｇの圧力下で行った場合のＬ−アトノ
ースへの変換率が、それぞれ１３％、４２％、および７
５％であった。 実施例１６ 実施例１と同様にして培養、集菌したグルコノバクタ−
・サブオキシダンス生菌体（乾燥重量換算４ＧＩｎ９）
を５重量％のＤ−マンニトール水溶液０．５−にけん濁
し、これに４重量％のアルギン酸ソーダ水溶液１−を加
え、よく攪拌混合した。この混合液を０．１モルの塩化
カルシウム水溶液中へ滴下することにより、直径０．５
〜１１１１１のビーズ状の固定化菌体を得た。これを内
容積３０−（直径１Ｂ＋＋ｎ）の耐圧反応管に入れ、５
重量％のＤ−マンニトール水溶液１０−を添加し、２７
℃、５時間、毎分１３０回の往復振盪下、反応を行った
。 反応後の結果は、空気で常圧下行った場合、酸素で４ｋ
ｐ／ｃｒｔｔ−ｃの圧力下で行った場合、および酸素で
８　ｋｇ／７・ＧＯ圧力下で行った場合のＤ−フルクト
ース−＼の変換率が、それぞれ２１チ、５０チ、および
８８チであった。 」 手続補正書 昭和５７年１２月９日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １　事件の表示 ％願昭５７−１１０６７４号 ２　発明の名称 糖質の酸化法 ５　補正をする者 事件との関係・特許出願人 （０４６）　　旭ダウ株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
６　補正の内容 明細書の記載を次のとお勺補正する。 （１）特許請求の範囲の記載を下記のとおり訂正する（
第２〜４項を削除］ 「　酸化発酵菌でアルコールおよび糖質の酸化を行うに
当シ、該菌体を高分子ゲルで包括固定化したものを酸素
加圧状態下で反応させることを特徴とする糖質の酸化法
。」 （２）第３頁１６行の 「食品や」を 「グリセリンから食品や」と訂正する。 （３）第７頁４行の 「添加しても微量」を 「添加しても極く微量」と訂正する。 （４）第１０頁１８行の 「酸化に進行」を 「酸化は進行」と訂正する。 （５）第１２頁１９行の ［ヘノ変換、アスペルギルス・ニガーＪを「への変換、
およびアスペルギルス・ニガー」ト訂正する。 （６）第１２頁２０行〜第１３頁２行の「、およびペニ
シリウム・・・・・・・・・への変換」を削除する。 （７）第１６頁下から８行〜第１８頁表２の実施例３を
削除する。 （８）第１８頁下から１４行の 「実施例４」を 「実施例３」と訂正する。 （９）第１９頁６行の 「真室で」を 「真空で」と訂正する。 ＜１（ｌ　　第２０頁１０行の 「表３」を 「表２」と訂正する。 ａυ　第２０頁１２行の 「表３」を 「表２」と訂正する。 （１２１第２１頁１行の 「実施例５」を 「実施例４」と訂正する。 ａ謙　第２１頁１７行の 「空気雰囲気で常圧下で」を 「空気雰囲気で常圧下、」と訂正する。 ０荀　第２２頁２行の 「実施例６」を 「実施例５」と訂正する。 ａ９　　第２２頁１８行の 「実施例７」を 「実施例６」と訂正する。 αｅ　第２３頁１４行の 「実施例８」を 「実施例７」と訂正する。 （７）第２４頁１４行の 「実施例９」を 「実施例８」と訂正する。 ａ８　　第２５頁１３行〜第２６頁１１行の実施例１０
を削除する。 α１　昭和５７年１１月３０日付の手続補正書第２頁４
行の１実施例１１」を 「実施例９」と訂正する。 （イ）同第３頁１行の 「実施例１２」を 「実施例１０」と訂正する。 （２υ　同第５頁１８行の 「実施例１５」を １−実施例１１」と訂正する。 （２４同第４頁１５行の 「実施例１４」を 「実施例１２」と訂正する。 （ハ）同第５頁１２行の 「実施例１５」を 「実施例１６」と訂正する。 ０４　　同第６頁９行の 「実施例１６」を 「実施例１４」と訂正する。 Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酸化発酵菌でアルコールおよび糖質の酸化を行うに
   轟シ、該菌体を高分子ゲルで包括固定化したものを酸素
   加圧状態下で反応させることを特徴とする糖質の酸化法
   。 乳酸化発酵菌として酸素耐性変異株を用いる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ６、酸化発酵菌として、アセトバクター属、グルコノバ
   クタ−属、シュードモナス属、アスペルギルス属および
   ペニシリワム属の菌゛体を用いる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ４、酸化発酵菌の固定化用高分子ゲルとして、天然多糖
   類のアガロース、Ｋ−カラギーナンおよびアルギン酸を
   用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。