DE1953189A1 - An Cellulosederivate chemisch gekuppelte Amylasen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

An Cellulosederivate chemisch, gekuppelte Amylasen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft die Modifikation bestimmter Enzyme durch Anlagerung an eine feste Matrix. Insbesondere betrifft die Erfindung an Cellulosederivate chemisch gekuppelte Amylasen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. -

Die Erfindung strebt an, Enzyme, wie Amylasen, in Wasser dadurch unlöslich zu machen, daß man sie chemisch an Cellulosederivate kuppelt, wodurch Enzympräparate erhalten werden, die häufig wieder-verwendet werden können und gegenüber einem Erhitzen stabiler sind als die entsprechenden löslichen Enzyme.

In Wasser unlösliche Derivate der ot-Amylase (Diastase) wurden bereits durch chemisches Kuppeln des Enzyms (a) an nitrierte Copolymere von Methacrylsäure, Methaerylsäure-m-fluoränilid und Divinylbenzol (G. Manecke und G. Gunzel, Makromolekulare Chem., Bd. 51, (1962), Seite 199 und G. Manecke, Pure Appl. Chem., Bd. 4· (1962), Seite _t5O7) und (b) an nitrierte Copolymere von Methacrylsäure, 4— oder 3-Fluorstyrol und Divinylbenzol (G. Manecke und H. J. Förster, Makromolekulare Chem., Bd. 91 (1966), Seite 136) hergestellt. Die Enzymaktivität des

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gebundenen Proteins in diesen Präparaten überstieg nicht 3 $ der Aktivität des freien Enzyms in wässriger Lösung. Die Stabilität dieser Präparate soll nur in der gleichen Grössenordrfung wie diejenige von wässrigen Lösungen von cL·-Amyläse liegen, die unter ähnlichen Bedingungen gelagert wurden.,

Es ist bekannt, dass beim Binden eines Enzyms an einen unlöslichen Träger die Enzymstabilität durch die andersartige Mikroumgebung erheblich beeinflusst wird, Durch hydrophile Eigenschaften des Trägers wird die Stabilität des daran gebundenen Enzyms erhöht, während hydrophobe Eigenschaften eine gegenteilige Wirkung zeigen. Trägerstoffe aus Polysacchariden, wie fe Cellulosefasern (M.A. Mitz und L.J. Summaria, Nature, London, Bd. 189, (1961), Seite 576 und W.E. Hornby, M.D. Lilly und E.M. Crook, Biochem» J-.,' Bd. 98, (1966), Seite 420) sowie aus vernetzten! Dextran (R. Axen und J. Porath, Nature, London, Bd. 210, (1966), Seite 367) wurden als besonders wirksame Stabilisatoren für das daran gebundene Enzym nachgewiesen.

Im Handel wurden im Februar 1968 Proben von wasserunlöslichen Formen von Trypsin, Chymotrypsin, Ribonuclease, Glucose-oxidase und Fiein angeboten. Diese Präparate waren durch Umsetzen des entsprechenden Enzyms mit Carboxymethylcellulose-hydrazid erhalten worden.

Fast gleichzeitig (Januar 1968) wurden wasserunlösliche Formen von Trypsin, Chymotrypsin und Papain im Handel angeboten, bei denen die Enzyme an einen Trägerstoff aus einem Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Oopolymerisat gebunden waren.

Gemäss R. Axen und J. Porath, Nature Bd. 210 (1966), Seite gelang es, aktive wasserunlösliche Präparate von Chymotrypsin ^; und Trypsin durch umsetzen der Enzyme mit einem vernetzten p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyldextran ("Sephadex") herzustellen. Nach diesem Verfahren gelang es jedoch nicht, eine aktive, wasserunlösliche ß-Amylase herzustellen.

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Gegenstand .der Erfindung ist die Schaffung von wasserunlöslichen Präparaten von A-Amylase * ß-Amylase und ^-Amylase, wobei das Enzym an die p-Diazophenoxy-hydroxypropyl- und p-Isothiocyauatophenoxy-hydroxypropyläther von mikrokristalliner Cellulose chemisch gekuppelt ist.

Die erfindungsgemässen Wasserunlöslichen Amylasepräparate bestehen aus chemisch an p-Diazöphettoxy-hydroxypröpyl- oder p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose gebundener Imylase.

Insbesondere sind erfindungsgemässe wasserunlösliche Amylasepräparate solche» bei denen ol-, ß- und ^-Amyiase an p-Diazophenoxy-hydroxypropyl-eellulose und «.- und ß-Amylase an p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose chemisch gekuppelt öind.

Die erfindungsgemässe wasserunlöslichen Amylasepräparate werden gemäss einer Ausführungsform der Erfindung dadurch hergestellt, dass man in einer Pufferlösung in einem pH-Wertbereich von 6,3 bis 8,6 gelbste Amylase bei 0 bis 5°C mit dem p-Diazophenoxyhydroxypropyl- oder p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropy"¹ äther von Cellulose umsetzt.

Wasserunlösliche Präparate von oL-, ß- oder^-Amylase können durch Umsetzung der in einem Puffer in einem pH-Wertbereich von 6,3 bis7,7, vorzugsweise 7,6 bis 7,7 gelösten Amylase mit dem p-Diazophenoxy-hydroxypropylather von Cellulose bei 0 bis 5⁰C hergestellt werden. Nicht umgesetzte Diazogruppen des Cellulosederivate werden durch Umsetzen mit ß-Naphthol oder mit Phenol unwirksam gemacht. Zur Herstellung des Celluloseäthers wird vorzugsweise mikrokristalline Cellulose verwendet. Der Substitutionsgrad der Äthergruppen in der Cellulose kann 13 bis 56,2 Mikroäquivalente, vorzugsweise 13 Mikroäquivalente, p-Diazpphenoxy-hydroxypropyläthergruppen je g Cellulose betragen. Aktive, wasserunlösliche Präparate von --L-Amylase, ß-Amylase und Glucamylase ( ^-Amylase) können nach diesem Verfahren erhalten werden, die wärmestabiler sind, wenn sie in einer

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wässrigen Pufferlösung (0,02 m) suspendiert sind, als dies "bei den entsprechenden löslichen Enzymen der Fall ist. Vorzugsweise sollte der Puffer einen pH-Wert besitzen, bei dem das Enzym eine maximale Enzymaktivität gegenüber diesem Substrat aufweist.

Andererseits können wasserunlösliche Präparate von <kr- oder ß-Amylasen durch Umsetzen von cU- oder ß-Amylase in einer Pufferlösung, vorzugsweise einem 0,05 m-Boratpuffer vom pH-Wert 8,6, mit dem p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyläther von Cellulose bei 0 bis 5°C erhalten werden. Zur Herstellung des „ Celluloseäthers wird vorzugsweise mikrokristalline Cellulose verwendet. Der Substitutionsgrad der Äthergruppen in der Cellulose kann 13 bis 56,2 Mikroäquivalente, vorzugsweise 13 Mikroäquivalente p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyläthergruppen je g Cellulose betragen. Aktive, wasserunlösliche Präparate von cl-Amylase und ß-Amylase, aber nicht von Glueamyläse ( y-Amylase) können nach diesem Verfahren erhalten werden, die wärmestabiler als die entsprechenden löslichen Enzyme sind', wenn sie in einem wässrigen Puffer (0,02 m) suspendiert vorliegen. Vorzugsweise sollte der Puffer einen pH-Wert besitzen, bei dem das Enzym eine maximale Enzymwirkung gegenüber seinem Substrat aufweist.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemässen wasserunlöslichen Amylasepräparate besteht darin, dass sie ein Produkt darstellen, dass eine hohe Aktivität behält, berechnet als Prozentsatz der Aktivität, die das an das Cellulosederivat gebundene Enzymprotein in der ursprünglichen, löslichen Form besitzen würde. Ein zweiter Vorteil liegt darin, dass das erfindungsgemässe Verfahren besonders vorteilhaft für Exoenzyme, wie ß- und %-Amyläse angewendet werden kann, während die wasserunlöslichen Präparate von ß-Amylase, die durch Umsetzen mit dem p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyläther eines vernetzten Dextrans (Sephadex) erhalten werden gemäss Axen und Porath, Nature, Iondon,Bd. 210 (1966) Seite 367 enzymatisch inaktiv sind. Ein dritter Vorteil der erfindungsgemässen Präparate ist darin

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zu sehen, dass bei der Verwendung von mikrokristalliner Cellulose iäur Herstellung des Äthers ein dichter, hydrophiler Träger in • feinverteilter Form erhalten wird, bei dem ein Maximum an Öberflächenstellen reaktiv ist, der jedoch nach der Verwendung leicht durch Zentrifugieren oder Filtrieren zurückgewonnen werden kann» Ein vierter Vorteil besteht in der viel grösseren Wärmestabilität der wasserunlöslichen Enzyme, die erfindungsgemäss erhalten werden können, verglichen mit den entsprechenden löslichen Enzymen, wodurch eine grössere Lagerstabilität, ein geringerer Aktivitätsverlust bei den Anwendungstemperatüren und eine maximale Wiederverwendbareit des Enzyms erzielt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert»

Beispiel 1

Es wurden 69,5 g (0,5 Mol) p-Nitrophenol in 25 g (Ö,6 Mol) einer Natriumhydroxidlösung in 400 ml Wasser suspendiert» Bas Gemisch wurde zur Lösung auf 70⁰G erhitzt. Beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur unter heftigem Rühren schied sich feinverteiltes Natrium-p-nitrophenoxid aus. Es wurden 46 g (0,5 Mol) Epichlorhydrin zugesetzt. Die Lösung wurde vorsichtig 6 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die ausgefallene Substanz wurde abfiltriert und auf dem Filter mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis kein leuchtend gelbes p-Nitrophenoxid mehr vorhanden war. Die fast weisse, feuchte Substanz wurde unmittelbar in 500 ml Äther gelöst. Die gebildete Wasserschicht wurde verworfen» Die Ätherschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Es kristallisierte eine sehr blassgelbe Substanz aus» Nach dem Umkristallisieren aus ietroläther (40/6O⁰O) wurden 25 g (25#5 #) reiner p-Nitrophenylglycidyläther vom F. 67⁰G erhalten (vgl. E. Marl, J. Ghern» Soc», (1912) Seite 305).

Es wurden Proben von je 10 g mikrokristalliner Cellulose (Sigmaeel 38) in vier Rundkolben von 50 ml mit Stopfen gebracht. Die Kolben wurden evakuiert, eine Stunde stehen gelassen und mit Stickstoff gefüllt. Nachdem jeder Kolben auf 5O⁰C aufgewärmt

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war, wurden jeweils 20 ml einer vorgewärmten 10 ^igen LÖstüig von p-Nitrophenylglycidyläther und 10 ml einer 10 #igen Natrituahydroxidlösung zugegeben. Der Kolbeninhalt wurde gut gemischt und die Kolben wurden verschlossen. Alle Arbeitsgänge erfolgten unter Stickstoff. Die Kolben wurden auf 50⁰C gehalten. Nach 12, 24, 48 und 96 Stunden wurde jeweils das Reaktionsgemisch in einen Mörser überführt und leicht mit 2 η-Essigsäure verrieben, bevor es in 0,5 1 des gleichen Lösungsmittels suspendiert und eine halbe Stunde gerührt wurde. Die erhaltenen p-Nitrophenoxyhydroxypropylcelluloseäther wurden gesammelt, mit Aceton gewaschen und leicht verrieben und danach eine halbe Stunde mit 0,5 1 Aceton gerührt» Nach drei Wäschen mit 1 1 destilliertem Wasser und einem weiteren Auswaschen mit 0,5 1 Aceton wurden die blassgelben Äther auf einem Filter gesammelt und getrocknet.

Die Reduktion des p-Nitrophenoxy-hydroxypropylcelluloseathers wurde durchgeführt, indem Proben ven 2 g in eine 5 S&Lge Lösung von Titan-IlI-chlorid in 200 ml βη-Salzaäure bei 100⁰C 5 Minuten suspendiert wurden» Die p-Amino-phenoxy-hydroxypropyleellulosehydrochloride wurden abfiltriert und mit 2n-Salzsäure gewaschen, bis die Substanz kein überschüssiges Titan~III~chlorid mehr enthielt* Die Proben wurden leicht in einem Mörser mit destilliertem Wasser verrieben, dreimal mit 0,5 1 destilliertem Wasser und schliesslich mit 500 ml Aceton gewaschen, filtriert und getrocknet.

Der Veratherungsgrad wurde durch Sitration der p-Aminö-phenoxyhydroxypropylcellulose-hydrochioride mit wässriger Natriumhydroxidlösung bestimmt. Es wurden folgende Werte erhalten:

Substitutionsgrad der p-Aminophenoxy-hydroxypropylcellulose ' Reaktionsdauer von p-Nitro- uA'q p-Amino-phenoxyphenylglycidyläther mit hydroxypropyläth,er je g

Cellulose (Std.) Cellulose

12 13,0

24 20,7

48 31,3

96 56,2

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Es wurden je 100 mg der vier Cellulosederivate in Reagensgläser mit Stopfen zusammen mit je 5 ml η-Salzsäure eingebracht. Sie Höhrohen wurden in ein Eisbad gesetzt und 15 Minuten magnetisch gerührt. Es wurden je 4 ml eiskalter Natriumnitritlösung zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurden die Röhrchen abzentrifugiert... Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Es wurden je 15 ml eiskalter Phosphatpuffer (0,075 m, pH-Wert 7,6 bis 7,7) zugefügt. Die Röhrchen wurden 15 Minuten magnetisch gerührt. Das Waschen wurde dreimal wiederholt. Anschliessend wurde nach dem Abdekantieren der .Waschflüssigkeit je 1 ml einer 0,5 folgen cC-Amylaselösung (kristallin, aus Bacillus subtilis) in einer Phosphatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 7,6 bis 7,7) zugefügt. Die Röhrchen wurden magnetisch bei 0 bis 5⁰C 18 Stunden gerührt. Anschliessend wurden je 5 ml einer eiskalten ß-Naphthollösung (0,1 #) in gesättigter Natriumac&tatlösung zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten wurden die wasserunlöslichen cL-Amylas.epräparate fünfmal mit 15 ml eines Phosphatpuffers (0,02 m, pH-Wert 6,9), und 15 ml einer 0,5 m-Natriumchloridlösung im gleichen Puffer gewaschen. Die d-Amylasepräparate wurden anschliessend zweimal mit Phosphatpuffer <0,02 m, pH-Wert 6,9) gewaschen. Bei den vier Ansätzen«wurden folgende Messwerte erhalten.

Präparat Nr*

1 2 3 4

j aktive funktioneile Gruppen/g«^ . Cellulose

13,0

20,7

- 31,3

56,2

mg gebundene s Protein
100 mg
Derivat

1,04
1,09
1,46
1,66

Enzym-Einheiten +
/mg gebundenes Protein

54,0
40_r8
33,7
33,3

fo Restaktivität im Enzym

nach dem

Kuppeln

60 53 38 37

+ eine d-Amylase-Einheit ist die Menge, die reduzierenden Zucker in einer Menge entsprechend 1 mg Maltose in 3 Minuten bei 20⁰C freisetzt.

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Beispiel 2

Es wurden je 100 mg der gemäss Beispiel 1 hergestellten vier Cellulosederivate in verschlossene Reagensgläser zusammen mit 5 ml n-SaI ζ säure gebracht.* Sie Röhrchen wurden in ein Eisbad gesetzt und 15 Minuten magnetisch gerührt. Es wurden je 4 ml eiskalte Natriumnitritlösung zugesetzt. Nach weiteren 15 Minuten wurden die Röhrchen zentrifugiert. Me überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Es wurden je 15 ml eiskalter Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert 6,3 bis 6,4) zugefügt. Die Röhrchen wurden Minuten magnetisch gerührt. Das Waschen wurde dreimal wiederholt. Nach dem Abdekantieren der restlichen Waschflüssigkeit wurde je 1 ml einer 0,5 $igen cC-Amylaselösung (kristalline Amylase aus ' Bacillus subtilis) in einem Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert. 6,3 bis 6,4). zugefügt. Die Röhrchen wurden 18 Stunden magnetisch bei 0 bis 5⁰C gerührt. Anschliessend wurden je 5 ml einer eiskalten ß-Naphthollösung (0,01 %) in gesättigter Natriumacetatlösung zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten wurden die wasserunlöslichen oC-Amylasepräparate fünfmal mit 15 ml Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert 6,9) und 15 ml einer 0,5 m Natriumchloridlösung im gleichen Puffer gewaschen. Die <*-Amylasepraparate wurden schliesslich zweimal mit Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert 6,9) gewaschen. Es wurden folgende Messwerte erhalten.

Präparat
Nr. .

5
6
7
8

μ Äq aktive funktioneile Gruppen/g Cellulose

13,0
20,7
31,3
56,2

mg gebundenes Protein/ 100 mg Derivat

0,79 0,83 1,47 1,50

Enzym-Ein- f> Restakheiten / tivität mg gebundenes im Enzym Protein

45,7 31,5 15,9 14,5

nach dem Kuppeln

51 35 18 16

Beispiel 3

Es wurden je 100 mg der vier p-Amino-phenoxy-hydroxypropylcelluloseäther, die gemäss Beispiel 1 hergestellt worden waren, mit je 0,5 ml Phosphatpuffer (3,5 m, pH-Wert 6,8) zu einer Aufschlämmung magnetisch verrührt. Je 0,2 ml einer 10 jSigen

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— Q —

Thiophosgenlösung in Tetrachlorkohlenstoff wurden zugegeben. Es wurde weitere 20 Minuten gerührt und es wurden nochmals je 0,2 ml Thiophosgenlösung zugefügt. Nach weiteren "20 -Minuten wurden die erhaltenen p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropylcelluloseäther einmal mit 15 ml Aceton, zweimal mit 15 ml 0,5 m-Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 15 ml 0,05 m-Boratpuffer (pH-Wert 8,5) gewaschen. Nach dem Abdekantieren der Waschflüssigkeit wurden je 1 ml einer 0,5 #igen d-Amylaselösung (kristallin, aus Bacillus subtilis) in einem Boratpuffer (0,05 m, pH-Wert 8,5) zugefügt. Die Röhrchen wurden 18 Stunden bei 0 bis 5⁰G magnetisch gerührt. Die o6—Amylasepräparate wurden fünfmal mit 15 ml Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert 6,9) und 15 ml einer 0,5 m-Natriumehlöridlösung im gleichen Puff er gewaschen. Die cC-Amylasepräparate wurden schliesslich zweimal mit einem Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert 6,9) gewaschen. Es wurden folgende Messwerte erhalten.

Präparat
Nr.

10
11
12

μ Äq aktive mg gebundenes Enzym-Einfunktionelle Protein/ . heiten/mg

Gruppen/g
Cellulose

13,0
20,7
31,3
56,2

100 mg Derivat

1,36 1,42 1,49 1,50

gebundenes Protein 47,4 36,6 21,1 22,4

i* Restaktivität des Enzyms nach dem Kuppeln

53 42 23 25

Beispiel 4

Es wurden 100 mg von gemäss Beispiel 1 hergestelltem p-Aminophenoxy-hydroxypropylcellulose-hydrochlorid (20,6 /jÄ'q Ätherbindungen/g) in ein verschlossenes Reagensglas gebracht und mit 0,5 ml eines Phosphatpuffers (3,5 m, pH-Wert 6,8) magnetisch zu einer Aufschlämmung verrührt. Es wurden 0,2 ml einer 10 $igen Thiophosgenlösung in Tetrachlorkohlenstoff zugefügt. Es wurde 20 Minuten weiter gerührt, wonach weitere 0,2 ml Thiophosgenlösung zugefügt wurden. Nachdem weitere 20 Minuten gerührt worden war, wurden 15 ml Aceton zugefügt. Die feste p-Isothiocyanatophenoxy-hydroxypropy!-cellulose wurde abzentrifugiert. Es wurde

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- ίο -

zweimal mit 15 ml 0,5 m-Natriumbicarbonat^ösung und zweimal mit 15 ml 0,05 m-Boratpuffer (pH-Wert 8,6) gewaschen. Nach dem Abdekäntleren der Waschflüssigkeit wurde eine Lösung von 5 mg ß-Amylase (kristallin, aus Süsskartoffeln) in 1 ml 0,05 m-Boratpuffer vom pH-Wert 8,6 zugefügt. Es wurde unter leichtem magnetischen Rühren 48 Stunden bei 0 bis 5⁰C gekuppelt. Das wasserunlösliche ß-Amylasepräparat wurde fünfmal hintereinander mit 15 ml 0,02 m-Acetatpuffer (pH-Wert 4,8) und 15 ml einer Lösung von m-Natriumchlorid im gleichen Puffer gewaschen. Anschliessend wurde noch zweimal mit 15 ml Acetatpuffer gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde abdekantiert. Das ß-Amylasepräparat wurde erneut in 10 ml des gleichen Puffers suspendiert.

Beispiel 5

Es wurde gemäss Beispiel 4 hergestellte p-Isothiocyanatophenoxy-hydroxypropyl-cellulose zweimal mit 15 ml einer 0,5 m-Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 15 ml eines 0,05 m-Boratpuffers vom pH-Wert 8,6 gewaschen. Nach dem Abdekantieren der Waschflüssigkeit wurde eine Lösung von ^-Amylase (Glucamylase aus Aspergillus riiger , 5 mg Protein, partiell gereinigt gemäss Cameron in Proc. Ciba Foundation Symposium J. und A. Churchill Press, London 1967, Seite 177) in 1 ml 0,05 m-Boratpuffer vom pH-Wert 8,6 zugefügt. Das Kuppeln wurde unter sanftem magnetischen Rühren 48 Stunden bei 0 bis 5 C durchgeführt. Das erhaltene, wasserunlösliche ^-Amylasepräparat wurde fünfmal hintereinander mit 15 ml Acetatpuffer (0,02 m, .pH-Wert 4,5) und 15 ml einer m-Natriumchloridlösung im gleichen Puffer gewaschen. Nach zwei weiteren Waschen mit 15 ml 0,02 m-Acetatpuff er (pH-Wert 4,5) und Abdekantieren der Waschflüssigkeit wurde das j'-Amylasepräparat in 10 ml des gleichen Puffers suspendiert. Es wurden folgende Messwerte erhalten, Hierbei ist eine Amylaseeinheit die Menge, die reduzierenden Zucker in einer Menge entsprechend 1 mg Maltose bei 20⁰C (ß-Amylase) oder 1 mg Glucose bei 45⁰C ( ^-Amylase) in 3 Minuten freisetzt.

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- Ii -

Präparat mg gebundenes Enzym-Ein- Enzym-Ein- $> Restaktivität. Nr. Protein/ heiten/mg heiten/ mg des Enzyms nach

	100 mg Derivat	gebundenes Protein	freies Protein	dem Kuppeln
13 · (Beisp.4)	1,75	126,0	499,9	25,1
14 (Beisp. 5)	0,96	inaktiv	28,2	inaktiv
Beispiel 6

Es wurden 100 mg gemäss Beispiel 1 hergestelltes p-Aminophenoxy-hydroxypropyl-eellulose-hydrochlorid (20,7 uÄ'q. Ätherbindungen/g) bei O⁰C mit 5 ml η-Salzsäure magnetisch gerührt. Se wurden 4 ml einer 2 #igen Natriumnitritlösung, die auf 0 C vorgekühlt war, zugefügt und es wurde 15 Minuten weiter gerührt. Die erhaltene p-Diazo-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose wurde viermal mit 15 ml 0,075 m-Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6 bis 7,7) bei 0⁰C gewaschen. Nach dem Dekantieren der Waschflüssigkeit wurde eine Lösung von 5 mg ß-Amylase (kristallin , aus Süsskartoffeln) in 1 ml.0,075 -m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 bis 7,7 zugefügt. Es wurde unter sanftem magnetischen Rühren 48 Stunden bei 0 bis 5⁰C gekuppelt. Anschliessend wurden 5 ml einer Lösung von 0,01 # Phenol in gesättigter wässriger Natriumacetatlösung von O⁰C zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten Rühren wurde das wasserunlösliche ß-Amylasepräparat abzentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Das Präparat wurde gemäss Beispiel 4 gewaschen und in 10 ml 0,02 m-Acetatpuff er vom pH-Wert 4,8 suspendiert.

Beispiel 7 .

Gemäss Beispiel 6 hergestellte p-Diazo-phenoxy-hydroxypropylcellulose wurde viermal mit 15 ml eines Phosphatpuffers (0,075 m, pH-Wert 7,6 bis 7,7) bei O⁰C gewaschen. Nach dem Abdekantieren der letzten Waschflüssigkeit wurde eine Lösung von ^-Amylase (aus Aspergillus niger, teilweise gereinigt, 5 mg Protein) in 1 ml Phosphatpuffer (0,075 m, pH-Wert 7,6 bis 7,7) zugefügt.

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BAD ORIGINAL

Es wurde unter sanftem magnetischen Rühren 48 Stunden bei O bis 5⁰C gekuppelt. Anschliessend wurden 5 ml einer 0,01 ?Sigen Phenollösung in gesättigter Natriumacetatlösung von 0 C zugefügt. Nach 15 Minuten Rühren wurde das wasserunlösliche /-Amylasepräparat abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Das Präparat wurde gemäss Beispiel 5 gewaschen und in 10 ml Acetatpuffer (0,02 m, pH-Wert 4,5) suspendiert. Es wurden folgende Messergebnisse erhalten.

Präparat
Nr.

15 ·
(Beisp.6)

16
(Beisp.7)

Enzym-Einheit en/mg
freies
Protein

499,9
28,2

mg gebundenes Protein/ 100 mg Derivat

4,24 1,25

Enzym-Ein heiten/ mg gebun denes Protein	% Restaktivität des Enzyms nach dem Kuppeln
83,3
5,01
16,6
17,7

Beispiel 8

Es wurden 20 mg des wasserunlöslichen it-Amylasepräparats 2 gemäss Beispiel 1 in 2 ml Phosphatpuffer (0,02 m, pH-Wert 6,9) suspendiert und bei 45⁰C inkubiert. Nach 0, 0,125, 1, 2, und 7 Tagen wurden Proben genommen und direkt in eine magnetisch gerührte Stärkelösung (10 ml, 1 fi) in Phosphatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 6,9) bei 45⁰C einpipettiert. Die Aktivität des wasserunlöslichen Λ-Amylasepräparats wurde durch periodische Probenahme und Prüfung des Abbaus mit Dinitrosalicylsäureester gemäss Bernfeld, Methods in Enzymology (1955), Seite 149 bestimmt. Hierdurch wurde der Prozentsatz der ursprünglichen Aktivität, die im wasserunlöslichen λ-Amylasepräparat zurückblieb, gemessen.

Ein Vergleichsversuch wurde durchgeführt, wobei anstelle des wasserunlöslichen dl-Amylasepräparats eine Lösung einer äquivalenten Menge freier ^-Amylase in Phosphatpufferlösung (2 ml, 0,02 m, pH-Wert 6,9) verwendet wurde.

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Eine Probe des suspendierten ß-Amylasepräparats 15 gemäss Beispiel 6 wurde 7 Tage bei 40⁰C aufbewahrt und die Aktivität in . Zeitabständen gegen magnetisch gerührte Stärkelösung wie oben bestimmt. Ein Vergleichsversuch wurde durchgeführt, wobei anstelle der wasserunlöslichen ß-Amylasesuspension eine Lösung von freier ß-Amylase in Acetatpuffer (0,02 m, pH-Wert 4,8) verwendet wurde. Die Prozentsätze der nach verschiedenen Zeiträumen verbliebenen Restaktivität wurde berechnet. Der Versuch wurde bei 50⁰C wiederholt bei einer Inkubationsdauer von 4 Tagen.

Schliesslich wurde die Stabilität eines ^-Amylasepräparats 16 (Beispiel 7) in ähnlichen Versuchen ermittelt, wobei eine Inkubationsdauer von 4 Tagen bei 50 C und 60 C und von 2 Tagen bei 70⁰C angewendet wurde. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten»

Enzym	Kupplungs art	Tempe ratur	3 Std,	ι Eestaktivitat 1 Tag 2 Tage	48 73	4 7 Tage Tage
ß- Amylase	keine Diazo-	40 40	88 91	59 81	-	31 12 57 41
	keine	50	40	20	25	- -
	Diazo-	50	74	44	46	- -
	keine	50	- 85	63	55	36 -
Amylase	Diazo-	50	89	68	19	44 -
	keine	60	45	29	24	VJl
	Diazo	60	60	33	. -	17 -
	keine	70	7	—	11	— —
	Diazo-	70	22	15		— —
	keine	45	18	0-

Amylase

Diazo-

45

33 21

Beispiel 9 ^!

Es wurden Suspensionen von 10 mg/ml wasserunlöslichen oC-Amylasepräparaten Nr. 1, 2, 3 und 4 (Beispiel l) in Phosphatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 6,9) 4 Monate bei 0 bis 5⁰C aufbewahrt,

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Die Aktivität der Präparate wurde bestimmt und die Bestaktivität berechnet. Es wurden folgende Restaktivitäten gefunden:

Präparat Nr. 1 2 3 4

Kupplungsart

Diazo-

$> der ursprünglichen Aktivität nach 4 Monaten

66 62 73 71

In einem ähnlichen Versuch wurden Suspensionen von wasserunlöslichen ß-Amylasepräparaten Nr. 13 und 15 (Beispiele 4 und 6) in Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,8) und eines ^/-Amylasepräparats Nr. 16 (Beispiel 7) in einer Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,5) 3 Monate bei 0 bis 5⁰C aufbewahrt. Die Aktivität der Präparate wurde bestimmt und deren Restaktivität berechnet. Es wurden folgende Werte erhalten:

Enzym	Präparat	-	15	Kupplungs	$> Restaktivität	nach
	Nr.	16	art	3 Monaten bei 0	- 50C
ß-Amylaee	13		Isothio-
	cyanato-	89
ß-Amyläse	Diazo-	100
γ-Amylase	Diazo-	100
Beispiel 10
Herstellung	von 1,2-Epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propan
(Glycidyl-p-nitrophenyläther)

Es wurden 695 g (5 Mol) p-Nitrophenol in einer Lösung von 250 g (6 Mol) Natriumhydroxid in 4 Litern Wasser suspendiert. Das Gemisch wurde bis zum Lösen auf 70⁰C erhitzt. Beim langsamen j Kühlen auf Raumtemperatur unter heftigem Rühren fiel feinverteiltes Natrium-p-nitrophenoxid aus. Es wurden 460 g(5 Mol) Epichlorhydrin zugefügt. Die Lösung wurde in einem 5-Liter-Kessel aus rostfreiem Stahl bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde die ausgefallene Substanz gesammelt und in einer Kugelmühle (160 U/Min) mit destilliertem Wasser gewaschen,

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■ - 15 - .

bis sie kein leuchtend gelbes Natrium-p-nitrophenoxid mehr enthielt. Die fast weisse feuchte Substanz wurde unmittelbar in 400 ml Äthanol gelöst und eingeengt. Es wurden 350 g einer sehr blasegelben Verbindung kristallin erhalten.

Herstellung der 2-Hydroxy-3-(p-nitrophenoxy)propyläther und 3-(p-Amino-phenoxy)-2-hydroxypropyl-äther-hydrochloride von Cellulose _m

Eb wurden 150 g mikrokristalline Cellulose (Sigmacell 38) in einen 1-Liter-Rundkolben gebracht. Der Kolben wurde evakuiert, mit Stickstoff gefüllt und verschlossen. Der Kolben wurde auf 50⁰C angewärmt. Es wurden 300 ml vorgewärmte Lösung von 10 $> p-Nitrophenyl-glycidylather in Toluol und 150 ml 10 #ige wässrige Natriumhydroxidlösung zugegeben. .Der Kolbeninhalt wurde gut vermischt mid der Kolben verschlossen. Alle Arbeiten wurden unter Stickstoff durchgefUhr-fr. Der Kolben wurde auf 5O⁰C gehalten. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgemisch in eine Kugelmühle gegeben und 10 Hinuten bei 160 U/Hin, mit 2n-Essigsäure gemahlen, bevor es in 1 Liter des gleichen Lösungsmittels suspendiert und gerührt wurde. Der erhaltene p-Nitro-phenoxy-hydroxylpropylcelluloseäther (2-Hydroxy-3-(p-nitrophenoxy)propyläther) wurde gesammelt, mit Aceton gewaschen und eine halbe Stunde mit Aceton gerührt. Nach drei Wäschen mit destilliertem Wasser und einer Acetonwäsche wurde der blassgelbe Äther gesammelt und getrocknet.

Zur Reduktion wurden 120 g p-Nitro-phenoxy-hydroxypropylcellulose in einer 1 : 1-Lösung von Titan-III-chlorid (12,5 #) in 2400 ml 6 n-Salzsäure bei 100⁰C 10 Minuten suspendiert. Das erhaltene p—Amino-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose-hydrochlorid (3-(p-Aminophenoxy)-2-hydroxypropyl--äther-hydroehlorid der Cellulose) wurde auf einem Filter gesammelt und mit 2n-Salζsäure gewaschen, bis kein Titan-III-chlorid mehr vorhanden war. Die Probe wurde dreimal mit destilliertem Wasser und zuletzt mit Aceton gewaschen, bevor sie auf einem Filter gesammelt und getrocknet wurde.

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SAD OHiGiNAt

Herstellung eines wasserunlösuchen ^-Amylasepräparats durch Kuppeln von ^-Amylase mit diazotiertem 3-(p-Aminophenoxy)-2-hydroxypropyläther von Cellulose ~

Es wurden Proben von je 25 g der erhaltenen Cellulosederivate in Bechergläser zusammen mit 1250 ml 2n-Salzsäure gegeben. Sie Bechergläser wurden in ein Eisbad gesetzt und 15 Minuten gerührt. Es wurde je ein Liter einer eiskalten 2 #igen Natriumnitritlößung zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten wurde der Becherinhalt zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit verworfen und je ein Liter einer eiskalten Phosphatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 7,6 bis 7,7) zugefügt. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt. Es wurde dreimal gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurden je ml handelsüblicher y-Amylasepräparate zugefügt:

Gruppe A - dialysiertes Enzym, Aktivität 71 Einheiten/mg Protein (Agidex, Glaxo)

Gruppe B - wie Gruppe A, Aktivität 132,2 Einheiten/mg Protein Gruppe C - nichtdialysiertes übliches Enzym (Novo), Aktivität 88,4 Einheiten/mg Protein.

Von jeder Gruppe wurden Lösungen mit verschiedenem Proteingehalt in Acetatpuffer (0,075 m,pH-Wert 4,5) hergestellt, so dass Proteinkonzentrationen von 210 bis 2040 mg Protein/200 ml erhalten wurden. Sie Suspensionen wurden 48 Stunden magnetisch bei 0 bis 5⁰C gerührt. Es wurde je 1,25 1 einer eiskalten ß-Naphthollösung (0,01 i») in 10 #iger Natriumacetatlösung zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten wurden die erhaltenen wasserunlöslichen J'-Amylasepräparate fünfmal mit 1 Liter Acetatpuffer (0,02 m, pH-Wert 4,5 und Natriumchloridlösung (1 m, 1 Liter) im gleichen Puffer gewaschen. Sie Präparate wurden schliesslich zweimal mit Acetatpuffer gewaschen (0,02 m, pH-Wert 4,5). Es wurden folgende Ergebnisse erhalten·;

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	Protein konzen tration, mg	-	gebundenes Protein mg/g Derivat	17 -	1953189
	1275	6,3	Enzym-Ein heit en/mg gebundenes - Protein
Präparat Nr. Gruppe A	1624	16,75	17,6	Eestaktivität
17	2040	7,05	20,6	23
• 18			13,4	28,4
19	210	18,45		17,4
Gruppe B	324	15,8	13
20	508	18,45	17	11,7
21			21	15,3
22	503	16		19
Gruppe C	1085	17,25	10,8
23	1810	8,3	14,4	• 12,2
24			19,6	16,3
25	22,2

Eine Einheit ^-Amylase setzt reduzierenden Zucker entsprechend 1 uMol Glucose in 1 Minute bei 45°C frei.

Beispiel 11

Es wurden 100 mg p-Diazo-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose, die gemäss Beispiel 1 hergestellt worden war, viermal mit 15 ml Phosphatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 4,5) bei O⁰C gewaschen. Nach dem Abdekantieren der letzten Waschflüssigkeit wurde eine Lösung von ^-Amylase aus Aspergillus niger . (handelsübliches Präparat, 0,04 ml) in 1 ml Acetatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 4,5) zugegeben. Es wurde unter sanftem Rühren 12 bis 72 Stunden gekuppelt. Die Zugabe von ß-Naphthol und das anschliessende Waschen erfolgten gemäss Beispiel 10. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten. ■

Präparat	Ku
Nr.	da
26	12
27	24
28	48
29	72

Kupplungsdauer StI

Aktivität Enzym- gebundenes Protein, Einheiten/mg gebun- Konzentration in

denes Protein mg/g Substanz

4,10 17,4

5,O 18,0

5,0 . ^: 19,35

3,6 15,65

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Beispiel 12

Es wurden 100 mg p-Diazo-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose,«die gemäss Beispiel 10 hergestellt worden war, viermal mit 15 ml Phosphatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 4,5) bei O⁰O gewaschen. Nach dem Abdekantieren der letzten Waschflüssigkeit wurde eine Lösung von ^-Amylase aus Aspergillus niger (rohes handelsübliches Präparat, 0,04 ml) in a) I ml einer Phosphatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 7,6) und b) 1 ml einer Acetatpufferlösung (0,075 m, pH-Wert 4,5) zugegeben und unter sanftem Rühren gekuppelt. Sie Zugabe von ß-Naphthol und das Waschen erfolgten gemäss Beispiel 10. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten.

Aktivität Enzym- gebundenes Einheiten/mg Protein mg/g gebundenes Substanz Protein

4,6 14,9

6,4 11,45

Es wurde gemäss Beispiel 11 gearbeitet und 48 Stunden gekuppelt. Jedoch wurde eine p-Diazo-phenoxy-hydroxypropyl-cellulose verwendet, bei deren Herstellung die Reduktion der p-Nitro-phenoxyhydroxypropyl-cellulose (1 g dieser Verbindung) in Suspension in 30 ml einer Citratpufferlösung (0,65 m, pH-Wert 5,8) mit 25 ml Titan-III-chloridlösung (12,5 #) 48 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Ss wurden folgende Ergebnisse erhalten.

Präparat Reduktionsverfahren Aktivität Protein

Nr. Enzym-Ein- mg/g Substanz

heiten/mg

gebundenes

Protein

32' Beispiel 11 (HCl) 5,0 18,75

33 Beispiel 13 (Citrat) 2,8 18,9

Präparat Nr.	Pufferlösung	13
30 31	Phosphat pH 7,6 Acetat pH 4,5
Beispiel

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Biispiel 14

Es wurden Proben eines wasserunlöslichen ^-Amylasepräparats (Gesamtaktivität 100 Einheiten, 12,5 mg Protein/g Derivat) in 10 ml Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,5) suspendiert und zu verschiedenen Maltoselösungen in auf 60⁰C konstant erhitzten Behältern gegeben. Die Maltosekonzentrationen betrugen 0,005 m bis 0,5 m in 250 ml Lösung in einem Acetatpuffer. Die Anfangsgeschwindigkeit der Bildungsreaktion für Glucose wurde unter Messung der Glueoeekonzentrationen gemäss Dalqvist, Biochem. J., Bd. 80 (1961), Seite 547 verfolgt. Es wurden folgende Messwerte erhalten:

Ansatz Maltose, Anfangs- Reaktionsgeschwindigkeit,

konzentration (Mol) anfangs, in mg Glucose/ml/Stl

1,9 2,7 3,2 3,3 4,4 5,7 5,1 6,0

6,7

Es wurden Suspensionen von wasserunlöslichen ^-Amylasepräparaten (Präparat Nr. 22, 21,0 Einheiten/mg gebundenes Protein, 18,45 mg Protein/g Derivat) in Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,5) in verschiedener Konzentration zu Suspensionen von Weizenstärke (20 Gew.-H) in 300 ml Acetatpufferlösung in einem mit einem Heizmantel auf 60⁰C erhitzten Behälter gegeben. Die Bildung von reduzierendem Zucker wurde nach der Hagedorn-Jenson-Methode durch Ferricyanid-Reduktion verfolgt. Die Ergebnisse, die aus der Kurvenneigung beim Zeitpunkt null erhalten wurden, sind im folgenden aufgeführt.

a	0,005
b	0,01
C	0,01
d	0,02
e	0,05
f	0,1
β	0,1
h	0,2
i	0,5
Beispiel 15

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Ansatz	Enzym-Konz entr at i on	Aktivität,	Heaktionsgeschwindigkeit	-
	gebundenes	Einheiten	bei Beginn in mg reduz.
	Protein mg	. 84	Zucker/ml/Std.
j	4	168	8
k	8	338	9
1	15,5	494	17
m	23,5	662	22
η	31,5	830	39
0	39,5		42
Beispiel 16

Es wurden Suspensionen mit 1,5 g unlöslicher ^-Amylase (Präparat Nr. 17, 17,6 Einheiten je mg Protein, 6,3 mg Protein/g Derivat) in 20 ml Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,5) zu Suspensionen von Weizenstärke (10, 20 und 30 #) in 280 ml Acetatpufferlösung in einen mit einem Heizmantel versehenen, auf 60 C erhitzten Behälter gegeben. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Ansatz Enzym- Stärke-Konzen- Reaktionsgeschwindigkeit Aktivität tration Gew.-^ bei Beginn in mg reduz.

Zucker/ml/StA

P 155 10 3

q 155 20 20

r 155 30 35

Beispiel 17

Es wurden Suspensionen mit 0,43 g unlöslicher ^-Amylase (Präparat Nr. 22) in 20 ml Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,5) bei 6O⁰C zu Suspensionen von Weizenstärke gegeben, die vorher mit Säure zu einem Dextrose-Äquivalent von 12 $ hydrolysiert, neutralisiert und in 280 ml Acetatpufferlösung (0,02 m, pH-Wert 4,5) gelöst worden waren. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

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Ansatz Stärkekonzen- Reaktionsgeschwin- Zeit bis 96 ^ tration, vor digkeit, mg reduz. Dextrose-Äqui-Hydrolyse Grew.-# Zucker/ml/Std. valenten, Std.

40 '6

50 24

52 . 18

B	18	10
t	20
U	30
Seispiel

Es wurden Suspensionen von Enzympräparaten von «l- und ß-Amylase (Präparate Nr. 3, 15, 11 und 13) abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Es wurden je 5 ml 1 #iger Stärkelösung in dem entsprechenden Puffer zugesetzt. Der Aufschluss wurde kurz magnetisch gerührt und abzentrifugiert. Eine Probe von 1 ml wurde danach in Dinitrosalicylat-Reagens (I'ml) als Vergleiohsprobe beim Zeitpunkt null einpipettiert. Der Auschluss wurde 15 Minuten magnetisch gerührt, abzentrifugiert und ein ¹SeIl von 1 ml der überstehenden Flüssigkeit in 1 ml Dinitrosalicylat-Reagens einpipettiert. Die jeweiligen überstehenden Flüssigkeiten wurden verworfen. Jedes Präparat wurde kurz mit 5 ml des gleichen Puffers gerührt, der vorher verwendet worden war, in welchem die Stärke fortgelassen wurde. Nach dem Abzentrifugieren und Abziehen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Versuch insgesamt achtmal wiederholt. Die überstehende Flüssigkeit vom letzten Aufschluss wurde dann bei 20⁰C inkubiert. Ss war kein weiterer Aufschluss feststellbar, ausser beim Präparat 13. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

0 0 9 8 2 5/1931

1953183

Enzym ·

Präparat Kupplung

Nr. Diaz o-Kupplung

λ-Amylase 3

A O.D.52Onm

Zahl der Verwendungen

£ Restaktivität ß-Amylase 15

Δ 0,D.520nm

Zahl der Verwendungen

# Restaktivität dl-Amylase 11

Δ 0.D.520nm

Zahl der Verwendungen

?£ Restaktivität ß-Amylase 13

Δ O.D.52Onm .

Zahl der Verwendungen

⁰A Restaktivität

Puffer

0,02 m-Phosphat, pH 6,9 *

1,90 1,04 0,92 0,87 0,77 0,71 0,70 0,68

12 3 4 5 6 7 8 55 48,5 46 40,5 37 37 36

0,02 m-Acetat, pH 4,8

Diaz o-Kupplung
0,98 0,53 0,44 0,37 0,32 0,27 0,24 0,22

2 3 4 5 6 7 8 54 45 38 32,5 27,5 24,5 22,5

Isothiocyanat 0,02 m-Phosphat,

pH 6,9

1,65 1,22 1,12 1,01 0,93 0,86 0,81 0,76

1 2 3 4 5 6 7.8 73 67 61 56 52 49 46

0,02 m-Aoetat, pH 4,8

Isothiocyanat
1,49 0,78 0,62 0,54 0,50 0,45 0,40 0,36 12 34 5 67 8 52 42 36 33,5 30 27 24

0 0 9 8 2 S / 1 9 3

Claims (12)

1. - 23 Patentansprüche . ,

   \J Wasserunlösliches Amylasepräparat, bestehend aus einer chemisch an p-Diazo-phenoxy-hydroxypropylcellulose oder an p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropylcellulose gebundenen Amylase.
2. 2. Amylasepräparat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch chemisch an p-Diazo-phenoxy-hydroxypropylcellulose' gebundene <jl-, ß- oder y-Amylase.
3. 3. Amylasepräparat nach Anspruch 1, gekennz e i c h n e t durch chemisch an p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropylcellulose gebundene el- oder ß-Amylase.
4. 4* Verfahren zur Herstellung des Amylasepräparats nach

   Anspruch 1 bis 3 durch Kuppeln von Amylase an ein Cellulosederivat, dadurch gekennzeichnet, dass man die in einer Pufferlösung vom pH-Wert 6,3 bis 8,6 gelöste Amylase bei 0 bis 5 Q Bit dem p-Diazo- phenoxy-hydroxypropyläther oder mit den p-Isothiocyanato-phenoxy-hydroxypropyläther von Cellulose umsetzt.
5. 5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass man die Umsetzung von «t-, ß- oder ^-Amylase mit dem p-Diazo-phenoxy-hydroxypropyläther der Cellulose in einer Pufferlösung vom pH-Wert 6,3 bis 7,7 durchführt.
6. 6· Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung beim pH-Wert 7,6 bis 7,7 durchfuhrt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet , dass man nicht umgesetzte Diazogruppen des Cellulosederivate durch Umsetzen mit ß-Naphthol oder Phenol abfängt.

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8. 8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung vc-nd- oder ß-Amylase mit dem p-Isothiocyanato-jphenoxy-hydroxypropyläther von Cellulose in einer Pufferlösung vom pH-Wert etwa 8,6 durchführt.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Pufferlösung einen 0,05 m-Boratpuffer vom pH-Wert 8,6 verwendet.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Celluloseäther verwendet, der , aus mikrokristalliner Cellulose hergestellt worden ist und einen Substitutionsgrad von 13 bis 56,2 Mikroäquivalenten p-Diazö-phenoxy-hydroxypropyläthergruppen bzw. p-Isothiocyanatophenoxy-hydroxypropyläthergruppen je g Cellulose besitzt.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet , dass man einen p-Diazo-phenoxy-hydroxypropyläther von Cellulose verwendet, der durch Umsetzen von Cellulose mit Glycidyl-p-nitrophenyläther unter Stickstoff in Gegenwart einer alkalischen Verbindung, Reduzieren des erhaltenen 2-Hydroxy-3-(p-nitrophenoxy)propyläthers der Cellulose mit Titan-III-chlorid in Gegenwart einer Säure oder eines Citratpuffers und Umsetzen des erhaltenen 3-(p-Aminophenoxy)-2-hydroxypropyläther-hydrochlorids der Cellulose mit angesäuerter Natriumnitratlösung frisch hergestellt worden ist.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 4 und 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet , dass man einen p-Isothiocyanatophenoxy-hydroxypropyläther von Cellulose verwendet* der durch Umsetzen von Cellulose mit Glycidyl-p-nitrophenyläther unter Stickstoff in Gegenwart einer alkalischen Verbindung, Reduzieren des erhaltenen 2-Hydroxy—3-(p-nitrophenoxy)propyläthers von Cellulose mit Titan-III-chlorid in Gegenwart einer Säure oder eines Citratpuffers und Umsetzen des erhaltenen 3-(p-Aminophenoxy)-2-hydroxypropyläthers von Cellulose mit Thiophosgen in Tetrachlorkohlenstoff erhalten worden ist.

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