DE2823573A1 - Immobilisierte restrictions-endonucleasen und verfahren zum immobilisieren von restrictions-endonucleasen - Google Patents
Immobilisierte restrictions-endonucleasen und verfahren zum immobilisieren von restrictions-endonucleasenInfo
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Description
Bethesda Research Laboratory
South Stone Street Avenue, Rockville, Maryland, USA
Immobilisierte Restrictions-Endonucleasen
und Verfahren zum Immobilisieren von Restrictions -Endonucleasen
809850/0819
Die Erfindung befaßt sich mit biochemisch aktiven, immobilisierten
Restrictions-Endonucleasen-Derivaten. Die Derivate umfassen Verbindungen
der Formel:
worin R einen biochemisch aktiven Restrictions-Endonucleasen-Rest
nach der Reaktion dieser Restrictions-Endonuclease mit X oder A darstellt, wobei X den Rest eines multifunktionellen Vernetzungsreagens nach der Reaktion mit R und A darstellt und wobei A ein
wasserunlöslicher Rest eines Polymeren nach der Reaktion mit R oder X ist, und worin m eine ganze Zahl von Null bis Vier und
η eine ganze Zahl von Eins bis zu der Zahl funktioneller chemischer Gruppen ist, die bei A für die Ankupplung an R und X zur Verfügung
stehen. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Immo-
bilisieren von Restrictions-Endonucleasen. Die Produkte gemäß der
Erfindung sind nützlich bei der Strukturaufklärung von Genomen und
bei der Sequenzanalyse von Desoxyribonucleinsäuren.
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2afe3573
Die Erfindung bezieht sich ganz allgemein auf die Immobilisierung von
Enzymen und betrifft im besonderen die Immobilisierung von angriffestellenspezifischen
Restrictions-Endonucleasen und ihre Verwendung für das Erkennen und Spalten spezifischer Sequenzen von Basenpaaren
(Palindrome) innerhalb der Desoxyribonucleinsäure in duplex.
Es ist ausreichend bekannt, daß Restrictions-Endonucleasen wirksame
Werkzeuge bei der Gen-Manipulation, der DNA-Sequenzanalyse und
in der Molekularbiologie sind. Diese Enzyme, die durch verhältnismäßig einfache biochemische Fraktionierung aus bakteriellen Extrakten
erhalten werden, sind mit der Fähigkeit ausgestattet, Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Sequenzen zu erkennen und zu spalten.
Diese Sequenzen (Palindrome) sind die Signale für die Angriffs stellen der Aufspaltung für die besonderen Enzyme. Zurzeit sind über 90 Restrictions-Endonucleasen
bekannt.
Vor dieser Erfindung wurden Restrictions-Endonucleasen physikalisch
spezifischen Desoxyribonucleinsäureproben in vitro angefügt. Die sich hieraus ergebende Reaktion wurde dann gestoppt. Bei umfangreichen
Darstellungen, bei denen Desoxyribonucleinsäurefragmente zurückgewonnen
werden mußten, mußten zuerst die Endonucleasen aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden, bevor die Desoxyribonucleinsäurefragmente
fraktioniert werden konnten. Obgleich diese Verfahrensschritte für sich gesehen keine Beschränkung darstellen, bedeuten sie
zusammengenommen eine Ansammlung von langwierigen Schritten, von denen jeder potentiell zu dem Verlust von Desoxyribonucleinsäuresubstraten
führt, welche schwer zu ersetzen sein können. Diese Probleme werden verstärkt, wenn sekundäre Spaltungen vorgenommen
werden sollen. Beispielsweise kann in vielen Fällen entweder ein Blockieren der Angriffs stellen für die Spaltung durch Proteine von
dem ersten Rohextrakt oder die Inhibierung der Spaltung durch ver-
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schiedene unbestimmte Faktoren eintreten, die in den Extrakten der
ersten oder nachfolgenden Verdauungen bzw. Andauungen vorhanden sind.
Durch die Verwendung der Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung
kann die zu verdauende bzw. anzudauende Desoxyribonucleinsäure mit einer spezifischen Restrictions-Endonuclease inkubiert werden und das
Verdauungsprodukt kann quantitativ zusammen mit der gleichzeitigen
Entfernung der Endonuclease und anderer störender Proteinmaterialien zurückgewonnen werden. Die Restrictions-Endonucleasen und Desoxyribonucleinsäure
können in Chargen oder in einer Mikro-Säule inkubiert werden und die Verdauungsfragmente können leicht von der Restrictions-Endonuclease
durch Zentrifugieren getrennt werden, falls chargenweise Verdauung ausgeführt wird oder sie können bei einem
niedrigen Salz-Puffer aus der Mikro-Säule eluiert werden. Auf diese
"Weise können Desoxyribonucleinsäurefragmente in einem Medium mit relativ niedrigem Salzgehalt erhalten werden, und zwar frei von
Proteinen und bereit, um einem nächsten Schritt in der Studienplanung unterworfen zu werden. '
Die Erfindung bezieht sich auf ein biochemisch aktives, immobilisiertes
Restrictions -Endonuclease-Derivat, umfassend eine Verbindung der
Formel:
t RH-X )m In A
worin R einen biologisch aktiven Restrictions -Endonucleasen-Rest
nach der Reaktion dieser Restrictions-Endonuclease mit X oder A darstellt, wobei X den Rest eines multifunktionellen Vernetzungsreagene
nach der Reaktion mit R und A darstellt und wobei A ein
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Rest eines wasserunlöslichen Matrix-Mate rials nach der Reaktion mit R
oder X ist und worin m eine ganze Zahl von Null bis Vier und η eine
ganze Zahl von Eins bis zu der Zahl funktioneller chemischer Gruppen ist, die bei A für die Ankupplung von R und X zur Verfügung stehen.
Der Ausdruck "biochemisch aktiv" , der in der Beschreibung und den
Ansprüchen verwendet wird, bedeutet, daß die Derivat-Verbindung in der gleichen Weise, wie dies bei der entsprechenden ursprünglichen
Restrictions-Endonuclease der Fall ist, in der Lage ist, Palindrome
zu erkennen und in Desoxyribonucleinsäuren und Fragmente hiervon
zu spalten.
Der Ausdruck "immobilisiert" bedeutet, daß der Restrictions-Endonucleasen-Rest
der Derivat-Verbindungen der vorliegenden Erfindung an den verbleibenden Rest der Verbindung chemisch gebunden ist.
Der Ausdruck "Restrictions-Endonuclease" wird hier in seinem allgemein
akzeptierten Sinne gebraucht und bedeutet eine angriffsspezifische Endodesoxyribonuclease und Isoschizomere hiervon. Die chemische
Struktur dieser Verbindungen wurde noch nicht aufgeklärt und ihr Gebrauch und ihre Reaktionen werden empirisch ausgeführt.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind geeignet, Palindrome von
Desoxyribonucleinsäuren und Fragmenten davon an spezifischen Angriffs stellen zu erkennen und zu spalten. Diese Verbindungen sind besonders
nützlich als Reaktionsmittel bei der Strukturaufklärung von Genomen und bei der Sequenzanalyse von Desoxyribonucleinsäuren (nachfolgend
als "DNA" bezeichnet).
Matrixgebundene Restrictions-Endonucleasen bieten verschiedene praktische
Vorteile gegenüber ihren löslichen Gegenstücken. Die unlöslichen
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Enzyme können entweder in Form einer Säule gepackt oder schnell aus
den Lösungen durch Zentrifugieren tablettiert werden. Diese Verfahren erlauben ein schnelles und vollständiges Entfernen der Restrictions Endonucleasen
aus den Reaktionsgemischen. Diese wiedergewonnenen Enzyme sind mehrmals wiederverwendbar und gestatten die Spaltung
von großen Mengen von DNA mit relativ wenig Einheiten des Enzyms. Das schnelle und vollständige Entfernen der Enzyme verhindert auch
die Inhibierung, die häufig nach einer nachfolgenden Andauung durch eine zweite Endonuclease beobachtet wird. Weiterhin ist keine Phenol-Extraktion
erforderlich, was zu einer erhöhten Rückgewinnung von Verdauungsprodukten und die Vermeidung von beschwerlichen und
zeitraubenden Vorgängen führt. Diese verfahrensmäßigen Vorteile zusammen mit einer gesteigerten Stabilität machen in eindeutiger
Weise die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu einer wertvollen Klasse von Reagenzien.
Die Erfindung bezieht sich auch auf das Verfahren zur Immobilisierung
angriffsstellen-spezifischer Restrictions-Endonucleasen, während ihre
biochemische Aktivität beibehalten bleibt, d.h. ihre Fähigkeit, spezifische Palindrome von Desoxyribonucleinsäuren und deren Fragmente
zu erkennen und zu spalten.
Restrictions-Endonucleasen sind ebenso wie ihre Herstellungsverfahren
bekannt; vergl. beispielsweise Roberts, Critical Reviews in Biochemistry,
November 1976, Seiten 123 bis 164. Vertreter der Restrictions-Endonucleasen,
welche durch das Verfahren nach der Erfindung immobilisiert werden können, um Verbindungen der oben angegebenen Formel I herzustellen,
sind Alu I, Ava I, Ava II, BaI I, Bam HI, Bei I, BgI I,
Bst E II, Eco R I, Hae II, Hae III, Hinc II, Hind II, Hind ΙΠ, Hinf I,
Hha I, Hpa I, Hpa II, Hph I, Hin 3891, Κρη Π, Pst I, Rru I, Sau 3A,
Sal I, Sma I, Sst I, Sst II, Tac I, Taq I, Xba I, Xho I und ähnliche,
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viele von ihnen sind im Handel erhältlich (Bethesda Research Laboratories
Inc., 411 N. Stonestreet Avenue, Rockville, Maryland 20850). Andere Restrictions-Endonucleasen, welche zur Anwendung kommen
können, sowie deren Darstellung sind in Roberts, siehe oben, Seiten 127 bis 130, angegeben.
Wasserunlösliche Matrices, die den Rest A in den oben angegebenen
Verbindungen der Formel I bilden, sind ebenso im allgemeinen bekannte Verbindungen. Sie weisen funktioneile chemische Gruppen auf, die In
der Lage sind, ein Kuppeln oder ein Verbinden mit funktionellen chemischen
Gruppen der Reste X der Formel I und/oder der oben beschriebenen Restrictions-Endonucleasen herbeizuführen. Die gebildete Bindung
oder die gebildeten Bindungen beeinflussen nicht in nachteiliger Weise
die biochemische Aktivität des Restrictions-Endonucleasen-Restes.
Die Matrices können organischer oder anorganischer Natur sein. Vertreter von anorganischen Matrices, welche den Rest A der Formel I
bilden können, sind Keramiken, Glas, Quarz, Polysulfone und ähnliche. Vertreter von organischen Matrices sind wasserunlösliche Polymere
wie Polyacrylamide, Polyaminostyrene, Polysaccharide oder Derivate hiervon, die Hydroxyl-Gruppen enthalten, und ähnliche. Beispiele für
wasserunlösliche Polysaccharide oder deren Derivate, die Hydroxyl-Gruppen enthalten, sind natürliche Pflanzenfasern, wie Baumwolle,
Leinen, Jute oder Manilahanf; Cellulosefasern wie regenerierte
Fasern (z.B. Viscose Rayon); Cellulose-Derivate wie Carboxymethylcellulose,
Phosphocellulose, Sulfomethyl-Cellulose, Sulfoetbyl-Cellulose, Para-Aminobenzyl-Cellulose. Aminoethyl-Cellulose, Diethylaminoethylcellulose,
Triethylaminoethyl-Cellulose; vernetzte Gele von Dextran-Epichlorohydrin
(nachfolgend als "Dextran-«Gel" bezeichnet); Dextran-Gel-Derivate
wie Carboxymethyl-Dextran-Gel, Diethylaminoethyl-Dextran-Gel
oder Sulfoethyl-Dextran-Gel, andere Polysaccharide wie
Chitin, Agar, Agarose (neutrales Galactose-Polymeres kommt in Agar
vor) und ähnliche.
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Weitere Vertreter von organischen Polymeren sind wasserunlösliche
Derivate der oben erwähnten Polysaccharide, wie z.B. Baumwolle, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, regenerierte Cellulose
und ähnliches, die oxidiert wurden, so daß einige der Glucosid-Einheiten umgewandelt sind zu Dialdehyd-Gruppen, d.h. Gruppen
der Formel:
CH2OH
γ '
(ID
worin Y eine ganze Zahl von ungefähr 1000 bis ungefähr 100 000 ist.
Die Dialdehyde bilden leicht covalente Bindungen mit einer Amino-Gruppe
an der Restrictions-Endonuclease, ohne die biochemische
Aktivität der Endonuclease zu inaktivieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das in der Immobilisierung der Restrictions-Endonucleasen besteht, wird vorzugsweise dadurch durchgeführt,
daß man Restrictions-Endonucleasen mit einer Verbindung der
nachstehenden Formel reagieren läßt:
-f-X-^A
. (III)
worin X, A und η der weiter oben gegebenen Definition entsprechen,
d.h. man führt die Reaktion mit einer Verbindung durch, welche ein wasserunlösliches Matrix-Material enthält, wie es weiter oben beschrieben
wurde, worin ein Vernetzungsmittel zwischengeschaltet ist, um eine Bindung mit der Restrictions-Endonuclease zu bewirken. Das
Vernetzungsmittel, dargestellt durch X in den Formel I und III, kann
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eines der multifunktionellen Vernetzungsmittel sein, die üblicherweise
zur Anwendung kommen, um Enzyme an die oben beschriebenen Matrix-Reste A zu binden. Solche Vernetzungsmittel können tri- und tetrafunktionell,
vorzugsweise jedoch bi-funktionell sein. Die Auswahl eines gegebenen Vernetzungsmittels hängt selbstverständlich von der
Natur des wasserunlöslichen Matrix-Reagens ab, welches bei der Darstellung
der Verbindungen der Formel I verwendet wird. Der auf diesem Gebiete tätige Fachmann wird die am besten geeigneten Vernetzungsmittel
erkennen, die angewandt werden könnten. Wenn beispielsweise poröses Glas als Matrix-Material verwendet wird, kann 4,4' -Bi
(2-Methoxybenzoldiazonium-Chlorid) verwendet werden, um die Restrictions
-Endonuclease und den Glasträger miteinander zu kuppeln. Die Technik des Anbindens bzw. Anhängens von Vernetzungsmittel an
Glas ist beispielsweise aus der US-PS 3 930 951 bekannt.
In ähnlicher Weise ist der Gebrauch von V ernetzungs mitteln oder sogenannten
"Aktivatoren" bekannt, um die Bindungskapazität der Polysaccharide als Enzymträger zu erhöhen. Beispielsweise können die
oben beschriebenen Polysaccharid-Verbindungen durch Reaktion mit einer Epoxy-Verbindung, wie z.B. 1,4- Bis-(2, 3-Epoxypropoxy) -Butan
aktiviert werden. Die am meisten verbreitete Technik zur Aktivierung wasserunlöslicher Polysaccharide ist wahrscheinlich die Reaktion mit
einem Zyan-Halogenid; vergl. US-PS 3 914 183.
Im wesentlichen werden also wasserunlösliche Matrices, sowohl organischer
als auch anorganischer Art, bei dem Verfahren nach der Erfindung zur Immobilisierung von Restrictions-Endonucleasen verwendet.
Die Matrix wird so ausgewählt, daß sie entweder geeignete Reaktionsgruppen enthält oder mit diesen versehen werden kann, wie z.B. Aminogruppen,
Hydroxylgruppen und Carboxy -Gruppen, um in einfacher Weise die Bindung der Restrictions-Endonuclease an dem Polymeren·
mit covalenten Bindungen möglich zu machen. Besonders vorteilhaft
809850/0819 "10"
ist die Auswahl von polymeren Teilchen, die aus dreidimensionalem Netzwerk bestehen und durch covalente Bindungen zusammengehalten
sind. Solche Partikel sind, obgleich sie in Wasser quellen, in diesem
vollständig unlöslich und sind deshalb nicht in der Lage, irgendein Matrix-Material oder eine Substanz, die durch covalente Bindungen
hieran gebunden ist, beispielsweise während des Auswaschverfahrens, freizusetzen.Beispiele solcher polymerer Teilchen sind Körnerpräparate
von Copolymeren, die durch Vernetzung von Substanzen erhalten werden,
welche eine Vielzahl von Hydroxyl-Gruppen, wie z.B. Kohlehydraten und Zuckeralkoholen, wie Dextran, Stärke, Dextrin und andere Polysaccharide,
die oben beschrieben wurden, undPolyvinylalkoholm.it
einer bi-funktioneilen Substanz enthalten, z.B. bi-funktioneile Vernetzungsmittel
nach der Formel:
(IV)
worin X der obigen Definition entspricht und R' und R" jeweils aus
der Gruppe ausgesucht sind, die aus Halogenen und Epoxy-Gruppen
bestehen.,· Der Ausdruck "Halogen" , der hier benutzt wird, umfaßt
Chlor, Brom und Jod. Vorzugsweise ist X der Rest eines aliphatischen Kohlenwasserstoffes mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, einschließlich
solchen wie Butan, Hexan Decan und ähnliche.
Die Restrictions-Endonucleasen können an den monovalenten Rest
(V)
unter gemäßigten Bedingungen gebunden werden, so daß die biochemische
Reaktionsfähigkeit des Enzyms nicht abnimmt. Die covalente Bindung des Enzyms an dem wasserunlöslichen Reagens kann sich nicht lösen,
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und es ist deshalb nicht möglich, daß das Enzym abgewaschen wird. Die Polymer-Matrix, die vernetzt oder aktiviert ist, kann in vorteilhafter
Weise mit der Restrictions-Endonuclease in einem inerten,
polaren Lösungsmittel, wie z.B. Wasser mit pH-Werten zwischen
4 und 14 zur Reaktion gebracht werden. Vorteilhafterweise wird die
Reaktion in einer gepufferten wässerigen Lösung durchgeführt, wobei jeder inerte Puffer verwendet wird, der geeignet ist, einen pH-Wert
innerhalb des gewünschten Bereiches aufrechtzuerhalten. Beispielsweise kann ein pH-Wert zwischen 4 und 5 mit 0, 005 bis 0, 5 M, vorzugsweise
0, 05 M Acetat-Puffer gepuffert werden, während ein pH-Bereich von 5 bis 8 mit einem Phosphat-Puffer der gleichen Konzentration
aufrechterhalten werden kann. Für den pH-Bereich von 7 bis sind geeignete Puffer Triethanolamin, TRIS, z.B. tris- (Hydroxymethylaminomethan)
oder Borsäure/Borax-Puffer der gleichen Konzentration und für den pH-Bereich von 9 bis 11 ist ein Carbonat/
Bicarbonat-Puffer geeignet. Es können auch andere wirksame Puffer für die angegebenen pH-Bereiche verwendet werden, da die Beschaffenheit
des Puffers nicht kritisch ist, so lange er inert und innerhalb des gewünschten pH-Bereiches ist. Viele solcher Puffersysteme können
in der Literatur gefunden werden. Die Bindungstemperaturen liegen
selbstverständlich unterhalb den Deaktivierungstemperaturen der besonderen Enzyme, die hier verwendet werden und vorzugsweise im
Bereich zwischen 0 und 37 C. Der Ausdruck "inert" , der hier verwendet wird, bedeutet, daß der Puffer nicht in den Ablauf der gewünschten
Reaktion eingreift.oder diese in anderer Weise beeinflußt.
Das Mengenverhältnis zwischen der aktivierten Polysaccharid-T rager Matrix
und der Restrictions-Endonuclease beträgt vorzugsweise zwischen
5 : 1 bis 1 : 5 und besonders bevorzugt 2:1. Aus Gründender Reaktion
kann die Restrictions-Endonudease in einer gepufferten wässerigen
Lösung vorgesehen und der Matrix-T rager kann in diese Lösung hinein-
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gerührt werden. Es ist ebenfalls möglich, die anzubindende Endonuclease
vorzugsweise in Form einer gepufferten wässerigen Lösung in eine Trägersuspension
einzurühren. Das Reaktionsgemisch kann außerdem konventionelle
Stabilisatoren enthalten, z.B. geeignete Protein-Stabilisatoren wie Cystein oder Mercaptoethanol und/oder Mg ++ ionen. Nachfolgend
wird das Reaktions gemisch während einer Reaktionszeit von ungefähr
5 Minuten bis ungefähr 48 Stunden, normalerweise während einer Stunde, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 14 gehalten. Optimale pH-Werte für
die Kupplung bei einem gsgebenenSystemkaimleichtdurch einen einfachen
Versuch bestimmt werden. Hierauf wird das Reaktions produkt von der
Suspension in üblicher Weise getrennt. Normalerweise wird das unlösliche Produkt in üblicher Weise gefiltert und ausgewaschen, um den
absorbierten, aber nicht angekuppelten Rest der Restrictions-Endonuclease
zu entfernen. Gewaschen wird vorzugsweise mit einem Puffer oder einer Salzlösung mit einer Molarität bis zu ungefähr 3 und einem
pH-Wert von zwischen 4 bis 14, wie dies für die besonderen Enzyme angemessen ist. Geeignete Salze sind besonders leicht lösliche und
stark dissoziierte Alkalimetallsalze, z.B. NaCl oder Na^SO, . Es ist
aber auch möglich, Pufferlösungen in optimaler Weise mit diesen Alkalimetallsalzlösungen zu verwenden.
Wegen ihrer vielen vorteilhaften Eigenschaften können entsprechend der
Erfindung immobilisierte Restrictions-Endonucleasen in den verschiedensten
Weisen verwendet werden. Beispielsweise können sie in Reaktionen als Säulenpackungen verwendet werden, da sie gute mechanische
Eigenschaften haben und hohe Durchlauf geschwindigkeiten erzielt werden. Insbesondere können die Verbindungen der obigen Formel I
in Form einer ummantelten Säule gepackt werden und eine Lösung von einer Desoxyribonucleinsäture wird darüber geleitet und an der Säule
auf der Inkubationstemperatur von ungefähr 37 C gehalten. Nach einer Zeitspanne von 1 bis 16 Stunden wird das an die Träger-Matrix (Formel I)
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gebundene Enzym die DNA angedaut haben (unter der Annahme, daß die richtigen Palindrome anwesend sind). Der fragmentierten, d.h. in
Fragmente zerlegtenDNA wird es dann ermöglicht, die Säule für weitere Untersuchungen usw. zu verlassen. Die DNA-Fragmente verlassen die
Säule frei von Enzym-Beimengungen. Die Säule kann in wiederholte r Weise für längere Zeit, z.B. für zumindest einen .Monat, benutzt werden,
wenn sie zwischen den Gebrauchs ab schnitt en bei Raumtemperatur gelagert
wird.
Wahlweise können die Verbindungen der Formel I gemäß der Erfindung
in einfacher Weise den Lösungen von DNA bei Inkubationstemperaturen für Zeitabschnitte von einer bis 24 Stunden zugemischt und danach von
der verdauten bzw. angedauten DNA durch einfachen Filtervorgang getrennt werden.
Die nachfolgenden Beispiele und Darstellungen beschreiben die Art und
das Verfahren zur Verwirklichung und Benutzung der Erfindung und legen
die vom Erfinder als am besten geeignete Methode zur Durchführung der Erfindung dar, sollen aber nicht einschränkend ausgelegt werden.
Alle Teile sind in Gewichtseinheiten angegeben, es sei denn, daß etwas anderes vermerkt ist.
Darstellung 1
Oxidation von Baumwolle mit Perjod-Säure
Oxidation von Baumwolle mit Perjod-Säure
Baumwollevorgespinst (80 g) geschnitten in 2, 5 cm lange Stücke, wird
in einer 0,1 %igen Lösung eines Addukte von Dodecylphenol und 10
Molen Ethylenoxid plus einer 0,1 %igen Natriumcarbonat-Lösung (2000 ml) für ungefähr 5 bis 10 Minuten durch Rühren von Hand gewaschen.
Die sich ergebende Trübe wird dann über einer Büchner-Trichter gefiltert «und die Baumwollfasern werden wieder gewonnen.
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Die wiedergewonnenen Baumwollfasern werden dann fünfmal mit 4000 Milliliter Aliquot von destilliertem Wasser bei unterbrochenem Rühren
abgespült und nach jedem Spülvorgang .gefiltert und dann dreimal mit
2000 Milliliter Aliquot von Aceton wiederum bei unterbrochenem Rühren
und Filtern nach jedem Spülvorgang abigespült, um das Wasser zu entfernen. Schließlich wird die gewaschene und gespülte Baumwolle unter
einer Abzughaube luft getrocknet.
Die getrocknete Baumwolle (50 g) wird in einen 4 Liter Erlenmeyer-Kolben
eingebracht und eine wässerige, ungefähr 0,11 MPerjodsäure
lösung (2,5 Liter; pH 1,4) hinzugefügt. Der Kolben wird dann verschlossen,
wobei ein Polyethylen-beschichteter Stopfen verwendet wird, welcher der Oxidation widersteht und das Äußere des Kolbens wird
mit Aluminiumfolie bekleidet, um eine Lichteinwirkung auszuschließen.
Hierauf wird der Kolben auf einen Plattformschüttler aufgesetzt und für ungefähr 5 Tage bei 25° C geschüttelt.
Die Baumwoll-Per jodsäure -Aufschlemmung wird dann auf einem Büchner Trichter
gefiltert,fünfmal mit 3 oder 4 Liter Aliquot von Wasser bei unterbrochenem
Rühren und Filtern nach jedem Waschen gewaschen, viermal mit 2 Liter Aliquot von Aceton bei unterbrochenem Rühren und
Filtern nach jedem Spülvorgang gespült und nachfolgend auf einer Aluminiumfolie angeordnet und unter einer Abzugshaube luftgetrocknet.
Eine 0,096 N-Natrium-Arsenitlösung, standardisiert durch 0,104 M
Kalium-Permanganatlösung, wird vorbereitet und benutzt, um Aliquots von der Perjodsäurelösung zu titrieren, und zwar vor und nach der
Baumwoll-Oxidation. Von dem Titerwert wird berechnet, daß ungefähr 57,8 Atome Sauerstoff auf 100 Glucosid-Einheiten verbraucht worden
sind, d.h. ungefähr 57,8 % der Glucosid-Ringe in der Baumwolle
sind geöffnet und zu Dialdehyden oxidiert.
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Die in der oben beschriebenen Weise dargestellte Dialdehyd-Baumwolle
ergibt eine starke Blaufärbung, wenn sie in einer wässerigen Lösung
zugegeben wird, die 0,4 M Natriumcarbonat (5 Milliliter) und verdünnt (3 s 1 )raitFolin-Reagens (1 Milliliter) , wodurch ein positiver Test
für die Anwesenheit von reduzierenden , d.h. Aldehyd", Gruppen gegeben
wird. Die Dialdehyd-Baumwolle kann als Träger-Matrix bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendet werden.
Darstellung 2 Aktivierung eines Polysaccharides
Ein Mengenverhältnis (10 Gramm) von substituiertem Sephadex G-25
(Pharmacia) ist zusammen mit 50 ml Wasser in einen Zweihals-Kolben
eingebracht. Das Produkt Sephadex G-25 (hochfein) ist Dextran vernetzt mit Glycerin-Ätherbrücken. Es ist substituiert mit p-Nitrophenoxy-Hydroxy-Propyl-Äther-Gruppen
bis zu einem Substitutionsgrad von ,umol Nitrogruppen pro Gramm von trockener Substanz durch Reaktion
mit 2, 3-Epoxy-l-(4-Nitrophenoxy)-Propan in alkalischem Milieu. Die
Charge wird bis auf 35 C erhitzt und gerührt, während zur gleichen Zeit 25 ml von 5 N-wässerigem Natrium-Hydroxid und 6 Gramm von
Natrium-Dithionit zur Reduzierung der Nitrogruppen in Aminogruppen beigefügt wird. Nach ungefähr 30 Minuten werden weitere 5 Gramm
des Natrium-Dithionit zugefügt. Der Reduktionsprozeß wird nach ungefähr einer Stunde unterbrochen, worauf eine Neutralisierung mit verdünnter
Salzsäure stattfindet, wobei feste Substanzen durch Filtern entfernt und mit destilliertem Wasser auf einem Saugfilter gewaschen
werden.
10 Gramm des oben erhaltenen Sephadex-Produktes substituiert mit
p-Amino-Phenoxy-Hydroxy-Propyl-Gruppen wird dann in den Reaktionskolben
zusammen mit 100 ml von einer 10 %-Lösung von Thiophosgen
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in Tetrachlorkohlenstoff eingeführt. Der Kolben wird dann mit einem
Stopfen verschlossen und die Mischung für ungefähr 2 Stunden gerührt.
Die erhaltene Mischung wird dann in einem Eisbad gekühlt, worauf der Kolben geöffnet und der Inhalt gefiltert wird. Der Rest der Filtrierung
wird mit einer 0,1 Mol wässerigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat
destilliertem Wasser und Aceton gewaschen. Der Rest wird dann in einem Trocknungsofen bei 60 bis 80 C getrocknet. Das Sephadex-Produkt,
das entsprechend der obigen Verfahrensweise erhalten wird, und mit p-Isothiocyanato-Phenoxy-Hydroxypropyl-Gruppen substituiert
ist, wird in 30 ml von einer 0,1 M wässerigen Lösung von Natriumhydro gencarbonat
gequollen, um einen Matrixträger zu erhalten, der zur Immobilisierung von Restrictions-Endonucleasen verwendet werden
kann.
Darstellung 3 Aktivierung von Agar öse
Ein geeigneter Behälter wird mit 10 ml destilliertem Wasser beschickt
und dann werden 100 Gramm Agarose-Kügelchen (Sepharose 4-B, Pharmacia)
in dem Wasser aufgeschlemmt. Zu der Aufschlemmung wird dann unter Rühren i 00 mg fein verteiltes festes Bromcyan hinzugefügt.
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung wird auf 11 durch Hinzufügen
von 8 N-Natrium-Hydroxid unter heftigem Rühren eingestellt. Der pH-Wert wird dann kontinuierlich kontrolliert. Das eingestellte Reaktionsgemisch
wird dann bei einer Temperatur von 20 C während 10 Minuten gehalten und dann werden 200 ml von einem kalten 1 M-Phosphat-(Ki} Puffer
(pH 7,2) unter ständigem Rühren hinzugefügt. Die erhaltene Suspension wird dann gefiltert und der Rest auf einer gesinterten
Glastülle mit 20 bis 30 Volumenteilen des kalten Puffers gewaschen. Der gewaschene Rest ist CNBr-aktivierte Agarose, die bei 4 C in
einem gleichen Volumen des Puffers für einen Gebrauch innerhalb von 48 bis 72 Stunden gespeichert werden kann.
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QSL
Darstellung 4 Glas-Matrix
Poröse Glaskügelchen (Potter Industries, Inc., Hasbrouck Heights, N.J.)
werden durch Wässern in 1,2 M-Salzsäure über 30 Minuten lang gereinigt.
Die Kügelchen werden dann in einen Ofen gebracht und die Temperatur wird langsam auf 550 C angehoben und auf dieser Temperatur
für 3 Stunden gehalten. Nach dem Abkühlen wird das Glas über Nacht eingetaucht in und equilibriert gegen einen 0,1 M Acetat-Puffer mit
pH 5,0.
Darstellung 5
Eine Lösung von 100^ug/ml Lambdaphagen-DNA wird in 20 mM Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan,
7 mM Magnesiumchlorid, 2 mM 2-Mercaptoethanol und lOOyug/ml von im Autoklaven behandelten
Gelatin bereitet.
Darstellung 6
Eine Lösung von lOOyug/ml von SV-40-DNA ist in 100 mMTris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan,
5 mM Magnesiumchlorid und lOOyug/ml Autoklaven-Gelatin
bereitet.
Darstellung 7
Eine Lösung von lOOyug/ml von DNA des Adenovirus Typ 2 wird in
100 mM Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan, 5 mM-Magneeiumchlorid
und 100yug/ml Autoklaven-Gelatin bereitet.
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Ein Teil der faserigen Dialdehyd-Baumwolle (ungefähr 2,5 Gramm),
die entsprechend dem Verfahren der Darstellung 1 bereitet ist, wird in ein Röhrchen aus Edelstahl mit einem Innendurchmesser von 1,9 cm
und einer Länge von 3,8 cm gepackt. Geschäumte Polyethylen-Scheiben werden an jedem Ende des gepackten Röhrchens angebracht, um die
Fasern zurückzuhalten und das Röhrchen wird dann an beiden Enden mit Edelstahlkappen verschlossen, die mit 0,158 cm (l/l6 Inch) Einlaßbzw.
Auslaß-Fittings versehen sind.
Eine Lösung wird bereitet, die aus 4000 Einheitender Restrictions-Endonuclease
Bam HI (Endo R · Bam HI, Bethesda Research Laboratories,
Inc.) in 20 m M TRIS-HCl- [Tris-(Hydroxymethyl)-Aniinomethan-Hydrochlorid]
(pH 7,5), 7 m M Magnesiumchlorid, 2 m M 2 Mercaptoethanol und 100 mg/ml Autoklaven-Gelatin besteht. Die Endonucleasen-Lösung
wird durch das vorbereitete Dialdehyd-Baumwoll-Reaktor-Bett
mit einer Geschwindigkeit von 13 ml/Minute während ungefähr 6 Stunden
im Kreislauf hindurchgeleitet. Während dieser Rezirkulation beträgt
die Temperatur des Reaktor-Bettes ungefähr 26 C. Am Ende dieser
Zeitspanne wird der Umlauf beendet und das Reaktor-Bett wird mit einer Pufferlösung von 2OmM Kalium phosphat (pH 7,5), 0, 5 m M1
Edetin-Säure, 1 m M-Dithiothreitol und 50 % Glycerin gewaschen, das
mit 13 ml/Minute während 15 Minuten hindurchgepumpt wird um eine Säulenpackung von Bam HI Restrictions-Endonuclease gebunden an
Dialdehyd-Baumwolle zu erhalten.
Zu 20 Teilen der Matrix, die entsprechend der Darstellung 2 bereitet
wurde, wird unter Rühren 2000 Einheiten der Restrictions-Endonuclease
809850/0819 "19~
Eco RI (Endo R* Eco RI, Bethesda Research Laboratories, Incl.) in
10OmM Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan-Hcl (pH 7,2), 5 m M
Magnesiumchlorid und lOO^ig/ml Autoklaven-Gelatin bei Raumtemperatur
hinzugefügt. Die Mischung wird während 5 Minuten gerührt und dann für 15 Minuten stillgestellt. Die sich ergebende Mischung wird
dann auf ein Vakuumfilter gegeben und mit einer Pufferlösung von 1OmM Kalium-Phosphat (pH 7,5), 200 m M Natriumchlorid, 0,15 %
eines wasserlöslichen Phenol-Derivats des Polyethylen-Glycols, Molekulargewicht ungefähr 100 (Triton X-100, Rhom und Haas Company),
ImM Dithiothreitol und ImM Hinatrium-Edetat gewaschen. Das
gewaschene Produkt ist eine Verbindung innerhalb der obigen Formel I,
worin Eco RI in covalenter Weise an ein aktiviertes Polysaccharid gebunden ist.
10 Gramm der entsprechend der Darstellung 4 vorbereiteten Glaskügelchen
werden in einen geeigneten Behälter gefüllt und der Behälter wird dann in ein Wasserbad mit 26 C eingetaucht. Zu den Kügelchen werden
dann unter sanftem Rühren 2000 Einheiten der Restrictions-Endonuclease
Eco RI (Endo R · Eco RI, Bethesda Research Laboratories, Inc.) in 10OmM Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan (pH 7,2), 5 m M Magnesiumchlorid
und 100/ig/ml Autoklaven-Gelatin bei Raumtemperatur
hinzugefügt. Die Mischung wird für 5 Minuten lang gerührt und dann für 15 Minuten stehen gelassen. Die sich ergebende Mischung wird
auf ein Vakuumfilter gegeben und mit einer Pufferlösung von 1OmM
Kaliumphosphat (pH 7,5), 200 m M Natriumchlorid, 0,15 % eines
wasserlöslichen Phenol-Derivats des Polyethylen-Glycols, Molekulargewicht ungefähr 100 (Triton X-100, Rhom and Haas Company), 1 m
M Dithiothreitol und 1 mM Dinatrlum.-Edetat gewaschen. Das Produkt
ist eine Verbindung innerhalb" der oben angegebenen Formel 1, worin die
Restrictions-Endonuclease Eco RI chemisch an das Glas gebunden ist.
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-20-
as
Ungefähr 250 Teile von gef rier-getrocknetem Bromcyanid aktivierten
Agarose-Kügelchen (CNBr-aktivierte Sepharose 4B, Pharmacia Fine Chemicals Incorporated, Piscataway, New Jersey) werden gewaschen
und mit ImM Salzsäure wieder aufgequollen und dann mit destilliertem
Wasser gewaschen. Ein geeigneter Behälter wird dann mit 100 Teilendes so erhaltenen gewaschenen Gels gefüllt. Diesem Gel werden
dann unter Rühren 2000 Einheiten der Restrictions-Endonuclease Eco RI
(Endo R * Eco RI, Bethesda Research Laboratories Inc.) in einer Kupplungsmischung von 1OmM Phosphat-(K ) (pH 7,2), 0, 5 m M-Edetinsäure
und 50 % Glycerin bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die
Mischung wird für ungefähr 5 Minuten gerührt und dann für ungefähr 15 Minuten abgestellt. Die sich ergebende Mischung wird auf einen
Vakuumfilter gegeben und mit einer Pufferlösung von 1OmM Kaliumphosphat
(pH 7,5), 200 m M Natrium chlorid, 0,15 % eines wasserlöslichen
Phenol-Derivats des Polyethylen-Glycols, Molekulargewicht
etwa 100 (Triton X-100, Rhom and Haas Co., Phil., Pa.) ,ImM
Dithiothreitol und 1 mM Din atrium -Edetat gewaschen. Das Produkt ist eine Verbindung gemäß der obigen Formel I, worin die Restrictions-Endonuclease
Eco RI in covalenter Weise an die CNBraktivierte Sepharose 4B gebunden ist.
In ähnlicher Weise erhält man durch Wiederholen des allgemeinen Verfahrens,,das
im Beispiel 4 dargelegt wurde, jedoch durch Ersetzen der Restrictions-Endonuclease Eco RI, wie sie hier verwendet wird,
durch eine Vielzahl anderer Restrictions -Endonucleasen und durch Anwendung einer Mischung von 10 m M-Phosphat-(K ) (pH 7,2),
0,5 m M Edetinsäure und 50 % Glycerin als Kupplungs mischung und
durch Waschender gekuppelten oder immobilisierten Enzym-Materialien
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mit einer Pufferlösung von 0, 5 M Natriumchlorid, 25 m M TRIS-(Hydroxymethyl)-Aminomethan-Hydrochlorid
(pH 7,5), 10 % Glycerin, und ImM von Dithiothreitol, Verbindungen der obigen Formel I,
welche biochemisch aktiv in dem Erkennen und Spalten spezifischer Palindrome aus der DNA sind. Die angewendeten Restrictions-Endonucleasen,
die bei ihrem Gebrauch angewendeten Lösungsmittel-Mischungen (Verdauungslösungen) und die für die Lagerung verwendeten
Lagerlösungen sind in Tabelle I weiter unten aufgezeigt.
-22-
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Restriction-Endonuclease
Alu I
Hae II
Hae III
Verdauu.;.gslösung
.X)
6 mM Tris-HCl (pH 7, 5)
6 mM MgCl2
6 mM 2-Mercaptoethanol
100 Aig/ml Autoclaven-Gelatin
50 mM Natriumchlorid
| Bam HI | 20 mM Tris HCl (pH 7,4)' ' | |
| 7 mM MgCIp | ||
| 7 mM 2-Mercaptoethanol | ||
| O | 100/ig/ml Autoclaven-Gelatin | |
| co | ||
| co | Pst I | 2OmM Tris-HCl (pH7,5p |
| O | 10 mM MgCl | |
| O | 50 mM (NH ) SO4 | |
| co |
100/ig/ml Autoclaven-Gelatin
6 mM Tris-HCl (pH 7,5)*' 6 mM MgCl2
1 mM Dithiothreitol lOO^ug/ml Autoclaven-Gelatin
1 mM Dithiothreitol lOO^ug/ml Autoclaven-Gelatin
50 mM Tris-HCl (pH 7,5)*^ 5 mM MgCl2
1 mM Dithiothreitol 100/ag/ml Autoclaven-Gelatin lagerfähige
Lösung
1 mM Dithiothreitol 100/ag/ml Autoclaven-Gelatin lagerfähige
Lösung
0.05M Phosphat (K+) (pH 7,3)
2 mM 2-MercaptoetHanol
1 . 0 mM Na EDTA**.) 50 % Glycerin gelagert bei -20 C.
0, 05 Phosphat (K+) (pH 7,4) 0, 5 mM Dithiothreitol
1 mM Na2 EDTA
50 % Glycerin gelagert bei -20 C.
0,05MKCl 0,15% Triton X-100
0,01 M Tris-HCl (pH 7,4)*)
0,1 mM Na2 EDTA 1 mM Dithiothreitol 50 % Glycerin
0 I'M Tris-HCl (pH 7,4) 0,1 mM Na2 EDTA*;*)
1 mM Dithiothreitol 0,05 M KCl
50 % Glycerin Enzym wird bei -20 C gelagert.
0.05 M KCl
0,01 M Tris-HCl (pH 7,4) 0,1 mM Dithiothreitol 50 % Glycerin
Tabelle I (Fortsetzung)
Rest riction-Endonuclease
Hind III
Hpa I
Hpa II
Taq I
Hha I
Verdauungslösung
20 mM Tris-HCl (pH 7,4)*)
7 mM MgC
60 mM NaCl
100yUg/ml Autoclaven-Gelatin
20 mM Tris-HCl (pH 7,4)*)
10 mM MgC
1 mM Dithiothreitol
6 mM KCl
100/ug/ml Autoclaven-Gelatin
20 mM Tris-HCl (pH 7,4)^)
7 mM MgCl2
1 mM Dithiothreitol l00yug/ml Autoclaven-Gelatin
20 mM Tris-HCl (pH 7, 5)*)
10 mM MgCl2
50 mM (NH4LSO4
100yug/ml Autoclaven-Gelatin
50 mM Tris-HCl (pH 7,4)*)
5 mM MgCl2
0, 5 mM Dithiothreitol
lOO jug/ml Autoclaven-Gelatin lagerfähige
Lösung
Lösung
0,2 M NaCl
10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
0, 5 mM Na2 EDTA**'
1 mM Dithiothreitol 50 % Glycerin
0,05 M KCl
0,01 M Tris-HCl 0,1 mM Na2 EDT 1 mM Dithiothreitol
0,01 M Tris-HCl 0,1 mM Na2 EDT 1 mM Dithiothreitol
2OmM Tris-HCl (pH 7, 5) 0, 5 mM Na2 EDTA**)
1 mM Dithiothreitol 50 % Glycerin
20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 5 mM Na, EDTA**) 1 mM Ditliiothreitol
50 % Glycerin
%7'4}
50 mM Phosphat (K+) (pH 7,4) 1 mM Dithiothreitol
50 mMNaCl 50 % Glycerin
Trie-(Hydroxymethyl)-Aminomethan-Hydrochlorid
Dlnatrium-Edetat
Ein geeigneter Behälter wird mit 5 Gramm von mit destilliertem Wasser
gewaschenem Chitin beschickt (feuchte Partikel, 10 bis 50 Maschen,
enthalten etwa 50 Gewichtsprozent Wasser). Zu dieser Beschickung werden unter Rühren bei Raumtemperatur von ca. 26 C 20 Einheiten
der Restrictions-Endonuclease Alu I (Endo R " Alu I. Bethesda Research
Laboratories Inc.) in einer Mischung von 6 m M Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan-Hydrochlorid,
6 m M Magnesiumchlorid, 6 m M 2-Mercaptoethanol, 5OmM Natriumchlorid und 100yug/ml Autoclaven-Gelatin
hinzugefügt. Nach 15 Minuten wird eine wässerige Glutaraldehyd-Lösung
unter ständigem Rühren hinzugefügt, bis das sich ergebende Reaktionsgemisch eine Konzentration von 2 % Glutaraldehyd aufweist. Das sich
ergebende Reaktions gemisch wird dann für 30 Minuten bei 26 C stillgestellt und dann für 8 Stunden bei 5 C. Am Ende dieses Zeitabschnittes
wird das Gemisch auf einem gesinterten Glastrichter gefiltert und der feste Rest mit einer Pufferlösung (50 mM Kalium phosphat, pH 7,3, 1 m M DL-natrium-Edetat,
2 mM 2-Mercaptoethanol und 50 % Glycerin) gewaschen. Die gewaschenen Festkörper sind Chitinteile, die durch Glutaraldehyd
zu der Restrictions-Endonuclease vernetzt sind. Die Bindung der Endonuclease kann zwischen den Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydryl-Gruppen
der Endonuclease und den Hydroxyl- und Amino-Gruppen des modifizierten Chitins und der Aldehyd-Gruppe des Glutaraldehyds sein.
Die folgenden Beispiele zeigen den Gebrauch der Verbindungen gemäß
der Erfindung.
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do-
Ein Teil der Lösung der Lambdaphagen - DNA die gemäß Darstellung
bereitet wurde, wird durch das Reaktor-Bett gemäß Beispiel 1 umgewälzt, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 13 ml/Minute während
ungefähr 15 Minuten und dann gehalten. Das Reaktor-Bett wird auf eine
Temperatur von 3t C für eine Zeitspanne von 15 Minuten erwärmt
und dann wird die inkubierte Lösung entfernt und bei Raumtemperatur abgekühlt. Die gekühlte Lösung wird dann auf einer Agarose-Gel-Platte
durch Elektrophorese fraktioniert, wobei die Methode von Studies, J. Mol. Biology, 79, 237 (1973) bei 175 Volt, 50 mA während 1,25 Stunden
bei Raumtemperatur angewandt wird. Wenn die Platte unter ultravioletter Strahlung betrachtet wird, kann gesehen werden, daß die DNA
an der Sequenz 5' -G GATCC-3' gespalten war (beruhend auf dem
Spaltungsmuster durch Verwendung eines Vergleichs enzyme) .
Zu 10 Teilen der entsprechend Beispiel 2 bereiteten Verbindung werden
100 Teile der Darstellung 5 hinzugefügt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird für eine Stunde bei 37 C inkubiert und dann bei Raumtemperatur
abgekühlt. Das abgekühlte Gemisch wird gefiltert, um die Feststoffteile zu entfernen und das Filtrat wird auf einer Agarose-Gel-Platte
für die Fraktionierung durch Elektrophorese (Methode von Studies) aufgeladen. Wenn die Platte beobachtet wird, ist zu sehen,
daß die DNA ander Sequenz 5' G*AATTC-3' gespalten war (beruhend
auf dem 'Spaltungsmuster durch Verwendung eines Vergleichsenzyms)
In ähnlicher Weise wird durch Wiederholung des obigen Verfahrens, jedoch durch Ersetzen der Darstellung gemäß Beispiel 2, wie es dort
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verwendet wird, durch 5 Gramm der Glaskügelchen, die in Beispiel 3
bereitet werden, die gleichen DNA-Sequenz gespalten.
Wiederum wird das obige Verfahren wiederholt, jedoch wird die Darstellung
des Beispiels 2 durch die Verbindung ersetzt, die in den Beispielen 4 und 5 bereitet ist, und es ist zu sehen, daß die biochemische
Aktivität der Restrictlons-Endnnuclease in der Verbindung gemäß
der Erfindung beibehalten wurde,
Ein geeigneter Behälter wird mit 200 Einheiten (eine Einheit von Enzym Aktivität
ist hier definiert als die Menge von Enzym, die erforderlich ist, um l'iug von Lambda-DNA bei 37 C in 60 Minuten zu verdauen.
Üblicherweise wird enzymatische Aktivität durch fortlaufende Verdünnung des Enzyms in dem linearen Bereich gemessen, um die Minimalmenge
von Enzym zu erhalten, die notwendig ist, um eine vollständige Verdauung zu erhalten.) von Bam HI in 0 5 ml eines Puffers, der
1OmM Phosphat (K ) pH 7,2, 0, 5 m M Dinatrium -Edetat und
50 % Glycerin mit 0,5 ml von gepackter CNBr-aktivierter Agarose aus der Darstellung 3, beschickt. Die sich ergebende Aufschlemmung
wird auf 0,15 M Phosphat-(K ) (pH 7,5) eingestellt, und dann sanft
gemischt und zwar durch "endweises Umstülpen" bei 4 C während 16 Stunden. Verbleibende reaktive Gruppen in der Agarose sind durch
Suspension der Gel-Aufschlemmung in 0,1 M TRIS-HGl' (pH 7 ,5) für
2 Stunden bei 4 C blockiert. Die überschüssige ungebundene Endonuclease
wird aus dem Gel durch Zentrifugieren entfernt, dann wird das Gel wieder in 0,5 NNaCl, 25 m M TRIS-HCl (pH 7, 5), 10%
Glycerin und ImM Dithiothreitol suspendiert und nachfolgend wieder
zentrifugiert. Dieser Wasch Vorgang wird viermal wiederholt. Schließlich
wird das enzym-gekuppelte Gel equilibriert mit 5OmM TRIS-HCl
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(pH 7, 5), 20 % Glycerin und 1 m M Dithiothreitol durch fünfmaliges
Waschen in diesem Puffer. Die endgültige Gel-Auf schlemmung wird
bei 4 C gelagert. Kein Barn-HI-Enzym konnte in irgendeiner von
den Waschvorgängen abgeleiteten Flüssigkeit entdeckt werden, was die quantitative Bindung des Ausgangsmaterials Bam HI anzeigt.
Das ausgewaschene Produkt ist eine Verbindung gemäß der Formel I und zeigt im Assay eine spezifische Aktivität von 3000 Einheiten pro
Gramm (spezifische Aktivität ist definiert als Einheiten pro Gramm von Enzym-gekuppelter Agarose). Das Assay für die Endonucleasen-Aktivität
wird in einem Reaktionsgemisch (40yul) ausgeführt, das
0,4 bis 2 ng Lambdaphagen,Adenovirus Typ 2 oder SV40 DNA,
5OmM NaGl und lOOxig/rnl Autoclaven-Ge latin enthält. Die Assay Mischungen
werden für eine Stunde bei 37 inkubiert, dann zentrifugiert und die Flüssigkeiten entfernt. Zu diesen Flüssigkeiten werden
dann ein Viertel des Volumens einer Lösung hinzugefügt, die 50 %
Glycerin und 0,02 % B rom phenolblau enthält.
Adenovirus Typ 2-oder Lambdaphagen-DNA-Fragmente sind auf einer
1,4 %-Agarose-Gel-Platte (10 cm χ 12 cm) bei 100 Volt während
3 Stunden getrennt, wobei man entsprechend den weiter oben beschriebenen Verfahren folgt (Sharp, et al. (1973) Biochemistry 12, 3055-3063;
Sugden, et al. (1975) Anal. Biochem. 68, 36-46). SV 40 DNA-Verdauungenwerden
auf einer 1,2% Agarose-Gel-PIatte bei 200 Volt während
2 Stunden fraktioniert, wobei TRIS-Borat-EDTA-Puffer (90 m M Tris-Borat,
pH 8 3, 2, 5 m M Disodium-Edetat) benutzt.Die Gele werden, mit
Ethidium-Bromid (1/ug/ml) während 10 Minuten angefärbt und während
einer Beleuchtung mit kurzwelligem ultravioletten Licht fotografiert. Die matrixgebundenen Enzyme, lyophilisiert zuTrοcfcenem, aus Lösungen
die 1 % (w/v) Dextran T70, enthalten, behielten mehr als 90 % ihrer
enzymatischen Aktivität. Solches lyophilisiertes Material kann bei Raumtemperatur ohne wesentlichen Verlust an Aktivität für zumindest
eine Woche gelagert werden.
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Beispiel 9 t
Der Versuch nach Beispiel 8 wird wiederholt, jedoch wird die Bam HI
gegen eine äquivalente Anzahl von Einheiten von Eco RI, einer Verbindung
gemäß der obigen Formel I ersetzt, wobei die Eco RI an CNBraktivierte Agarose gebunden ist. Die Verbindung zeigt im Assay eine
spezifische Aktivität von 11 000 Einheiten/Gramm. Die auf diese Weise bereiteten Verbindungen sind für zumindest 6 Monate stabil und können
zumindest fünfmal wiederverwendet werden ohne bemerkenswertem Verlust an enzymitischer Aktivität.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Kupplung von Restrictions-Endonucleasen
an wasserunlösliche Matrices nicht die enzymatischen Eigenschaften verändert. Ein Satz von 6 Reaktionsbehältern ist vorgesehen. In zwei
der 6 Behälter wird der gleiche Menge von Deoxyribonucleinsäure entsprechend der Darstellung 5 eingegeben. In zwei weitere Behälter wird
die obige Darstellung 6 eingegeben. In die letzten beiden Behälter werden gleicheMengen der Darstellung 7 eingegeben, um zwei Reihen von Behältern
zu erhalten, von denen jede aus drei Behältern besteht und in jedem eine andere Desoxyribonecleinsäure enthalten ist. Jedem Behälter
einer Reihe werden dann 200 Einheiten eines der gebundenen Enzym verbindungen zugefügt, die gemäß dem obigen Beispiel 8 bereitet
sind. Zu den verbleibenden Behältern der zweiten Reihe werden 200 Einheiten ungebundene Bam HI hinzugefügt. Die Behälter werden
bei 37 C für eine Stunde inkubiert und dann zentrifugiert und die Flüssigkeiten werden entfernt. Zu diesen Flüssigkeiten oder zu den
Reaktionsgemischen, die ungebundene Enzyme enthalten, werden ein Viertel des Volumens einer Lösung hinzugefügt, die 50 % Glycerin
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und 0,02 % Bromphenolblau enthält. Die verdaute DNA wurde dann
fraktioniert. Adenovirus Typ 2-und Lambdaphagen-DNA-Fragmente
wurden auf einer 1,4 % Agarose-Gel-Platte (10 cm χ 12 cm) bei 100 Volt
während 3 Stunden entsprechend dem vorher beschriebenen Verfahren getrennt. SV40-DNA-Verdauungsprodukte wurden auf einer 1,2 %
Agsrose-Gel-Platte bei 200 Volt während 2 Stunden fraktioniert, wobei
TRIS-Borat-EDTA-Puffer (90 m M Tris-Borat, pH 8,3, 2,5 m M Dinatrium
-Edetat)verwendet wurde. Die Gele wurden mit Ethidium-Bromid
(1 ^.g/ml) für 10 Minuten angefärbt und während einer Beleuchtung
mit kurzwelligem ultravioletten Licht fotografiert.
Das obige Verfahren wurde dann wiederholt mit Ausnahme der Tatsache,
daß das gebundene Enzym Bam HI des Beispiels 8 ersetzt wurde gegen
einen gleichen Anteil der gebundenen Eco RI des Beispiels 91 und wobei
die ungebundene Bam HI gegen einen gleichen Anteil von ungebundener
Eco RI ersetzt wurde.
Das Spaltungsmuster des Lambdaphagen, Adenovirus Typ 2 oder SV 40 DNA., das durch Inkubation mit den immobilisierten Enzymen erzeugt
wurde, war identisch mit demjenigen, das mit freien Enzymen erzeugt ist. Lambdaphagen-DNA-Verdauung mit Bam HI oder Eco RI erzeugte
das erwartete Muster von 6 Fragmenten. Die DNA des Adenovirus Typ wurde in 4 Fragmente durch Bam. HI und 6 Fragmente durch Eco RI
umgewandelt. Beide Enzyme haben die SV40 DNA von der Superhelix-Komponente
I in die lineare Komponente III umgewandelt. In allen Fällen konnten keine Abweichungen in den Mustern der DNA-Fragmente erkannt
werden, wenn gebundene Endonuclease durch freie Endonuclease in der Reaktion ersetzt wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl lineare
Deoxyribonucleinsäuren als auch Superhelix-Deoxyribonucleinsäuren
durch die Verbindungen nach der Erfindung wirksam verdaut werden können. Außerdem, wenn geeignete Inkubationsbedingungen für die
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RI-gekuppelte Agarose geschaffen werden, wird das Eco RI-Muster
ebenfalls erhalten. Auf diese Weise stört die Kupplung über die Cyan-Bromid-Bindung
offensichtlich nicht die kritischen Elemente der aktiven Angriffs st eile η der Restrictions-Endonucleasen. Dies ist besonders
wichtig» da stereochemische Hinderungen an der Kupplung anderer Enzyme in anderen Systemen dokumentiert sind; vergl. hierzu beispielsweise
Bar-EIi, et al. (1963) J. Biol. Chem. 238* 1690-1698
and Hornby, et al. (1966) Biochem. J. 98, 420-425.
Repräsentative Mengen der immobilisierten Bam HI, bereitet
gemäß Beispiel 8, wurden auf verschiedene Temperaturen für verschiedene
Zeitspannen erhitzt. In ähnlicher Weise wurden repräsentative Mengenverhältnisse der immobilisierten Eco RI, bereitet gemäß
Beispiel 9, auf verschiedene Temperaturen für verschiedene Zeitspannen
erhitzt» Am Ende der Erhitzungsperiode wurden die Produkte auf die enzymische Aktivität untersucht, wie dies weiter oben beschrieben wurde.
Zu Vergleichszwecken, wurde ein entsprechend ungebundenes Enzym in
ähnlicher Weise einer Wärmebehandlung ausgesetzt und in bezug auf die enzymatisehe Aktivität ausgewertet. Die Zeiten und Temperaturen, die
zur Anwendung kamen , und die beobachteten Verluste an enzymischer
Aktivität sind in Tabelle 2 weiter unten aufgeführt.
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E nzym
ungebundene
Eco RI
(Vergleich)
Wärmebehandlung
| Beispiel 1 O (Bam HI) |
keine 60°C - 2 65°C - 5 |
Minuten Minuten |
| ungebundene Bam HI (Vergleich) |
keine 55°C - 5 60°C - 2 |
Minuten Minuten |
| Beispiel 11 (Eco RI) |
keine 40°C - 5 |
Minuten |
45°C - 5 Minuten
50l
- 5 Minuten
keine
40°C - 5 Minuten
40°C - 5 Minuten
Verlust an Aktivität (%)
kein 0 - 1 0 % 10 - 20 %
kein
80 - 90 % 100 %
kein kein 10 % 20 %
kein 100 %
Die Tabelle 2 zeigt, daß das Verfahren nach der Erfindung die thermische
Stabilität bei zumindest 10 Cfür jedes Enzym erhöht. Setzt man die Lö'sungen der immobilisierten Bam HI einer Temperatur von 65 C
über 5 Minuten aus, so ergibt sich ein geringer Verlust an Aktivität,
während die Vergleichsforai ,die über 5 Minuten bei 55 C behandelt wurde,
nahezu die gesamte Aktivität verlor. Tatsächlich führte die Behandlung
von Bam HI bei 60 C für nur 2 Minuten zu einer vollständigen Inaktivierung
während die Aktivität der immobilisierten Bam HI entsprechend dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, bei einer Inkubation
bei 60° C während 2 Minuten stabil blieb. Wenn freie Eco RI bei 40° C inkubiert wird, verliert sie die gesamte Aktivität, während an Agarose
gebundene Eco RI nur 20 % ihrer Aktivität verliert, wenn die Behand-Iu
ng bei 50 C erfolgt. Die Ergebnisse zeigen deutlich eine verbesserte thermische Stabilität nach der Unlöslichmachung gemäß dem Verfahren
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nach der Erfindung. Dies ist deutlich ein unerwarteter Vorteil, welcher
die Verbindungen gemäß Formel I, die weiter oben beschrieben wurden, besonders nützlich für das Studium der Desoxyribonucleinsäuren bei
hohen Temperaturen macht.
Die Restrictions-Endonucleasen, die eng an die beschriebenen Matrices
gebunden sind, widerstehen einem Auswaschen selbst in Lösungen mit hohem Salzgehalt.
Der Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, daß viele Veränderungen
bei den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne Geist und Umfang der Erfindung zu verlassen.
Beispielsweise können zwei oder mehr Restrictions-Endonucleasen auf einer einzigen wasserunlöslichen Matrix immobilisiert werden, um
eine Verbindung der Formel I zu erhalten, in welcher R der Rest von verschiedenen Restrictions-Endonucleasen ist. Solche Verbindungen
sind nützlich für die Verdauung von Desoxyribonucleinsäuren entsprechend der Vielzahl der Endonucleasen-Aktivitäten. In ähnlicher Weise
kann man eine Restrictions-Endonuclease an einer wasserunlöslichen
Matrix immobilisieren, an welcher vorher oder nachher ein ungleiches Enzym, beispielsweise alkalische Phosphatase, gebunden wird. Solch
eine Verbindung könnte nützlich sein,beispielsweisewie dies aus der
US-PS 4 039 382 hervorgeht.
-Patent ans prüche-
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Claims (32)
1. Biochemisch aktives, immobilisiertes Restrictions-Endonucleasen-Derivat,
umfassend eine Verbindung der Formel:
worin R einen biochemisch aktiven Restrictions-Endonucleasen-Rest
nach der Reaktion dieser Restrictions-Endonuclease mit X oder A darstellt, wobei X der Rest eines multifunktionellen Vernetzungsreagens
nach der Reaktion mit R und A darstellt und wobei A ein Rest eines wasserunlöslichen Matrix-Mate rials nach der Reaktion
mit R oder X ist und worin m eine ganze Zahl von 0 bis 4 und η eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl funktioneller chemischer
Gruppen ist, die bei A für die Ankupplurig an R und X zur Verfügung
stehen.
2. Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Restrictions-Endonuclease
ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alu I, Ava I, Ava II, BaI I, Bam HI, Bei I, BgI I, Bst EII, Eco RI, Hae II,
Hae III, Hinc II, Hind II, Hind III, Hinf I, Hha I, Hpa I, Hpa II, Hph I, Hin 389 I, Kpn II, Pst I, Rru I, Sau 3A, Sal I, Sma I, Sst I,
Sst II, Tac I, Taq I, Xba I und Xho I.
3. Derivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Matrix ein anorganisches Material ist.
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ORIGINAL INSPECTED
4. Derivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische
Material Glas ist.
5. Derivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Matrix ein organisches Polymeres ist»
6. Derivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das organische
Polymere ein Polysaccharid ist.
7. Derivat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid
Agarose ist.
8. Derivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das organische
Polymere ein oxidiertes Polysaccharid ist, bei welchem einige der Glucosid-Einheiten zu Dialdehyd-Gruppen umgewandelt sind.
9. Derivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid
Chitin ist.
10. Derivat nach Anspruch 1, 2 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das
Polymere ein Polysaccharid und das Vernetzungsreagens ein
Cyan-Halogenid ist.
11. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion zwischen
Bam HI und Dialdehyd-Baumwolle.
12. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Eco RI mit einem aktivierten Polysaccharid.
13. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Alu I mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
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14. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Pst I mit Cyan-Bromid-aktivierter Agar öse.
15. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Bam HI mit Cyan-Bromid-aktivierter Agar öse.
16. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Eco RI mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
17. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Hae II mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
18. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Hae III mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
19. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Hind III mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
20. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Hpa I mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Hpa II mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
22. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Taq I mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
23. Derivat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Reaktion von
Hha I mit Cyan-Bromid-aktivierter Agarose.
809850/0819
24. Verfahren zum Immobilisieren von Restrictions-Endonucleasen
unter Beibehaltung ihrer biochemischen Aktivität, gekennzeichnet durch die chemische Bindung der Restrictions-Endonucleasen an
wasserunlösliches Matrix-Material.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix
ein anorganisches Material ist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische
Material Glas ist.
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix
ein organisches Polymeres ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das organische
Polymere ein Polysaccharid ist.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid
Agar öse ist.
30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid
Chitin ist.
31. Verfahren zum Immobilisieren von Restrictions-Endonucleasen
unter Beibehaltung ihrer biochemischen Aktivität, gekennzeichnet durch die Reaktion der Endonucleasen mit Verbindungen der Formel:
( Χή
η
η
worin X einen monovalenten Rest eines multifunktionellen Vernetzungsmittels
nach der Reaktion mit A darstellt, wobei A der Rest eines wasserunlöslichen Matrix-Materials nach der Reaktion
-37-809850/0819
ι i i a δ 7 3
mit X ist und wobei η eine ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl funktioneiler
chemischer Gruppen ist, die bei A für die Ankupplung an X zur Verfügung stehen.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung
ein Cyanhalogenid-aktiviertes Polysaccharid ist.
809850/0819
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