DE1768512C3

DE1768512C3 - Verfahren zur Herstellung von in Wasser unlöslichen, chemisch oder biologisch wirksamen Derivaten von Proteinen, Peptiden und Derivaten derselben

Info

Publication number: DE1768512C3
Application number: DE1768512A
Authority: DE
Inventors: Jerker Olof Porath
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1967-05-23
Filing date: 1968-05-21
Publication date: 1985-01-10
Also published as: SE337223B; DE1768512A1; DK120109B; CH501695A; IT1052959B; GB1223281A; BE715523A; FR1584535A; NL158502B; DE1768512B2; NL6807239A; US3645852A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in Wasser unlöslichen, chemisch oder biologisch wirksamen Derivaten von Proteinen, Peptiden und Derivaten derselben mit einer oder mehreren Gruppen -YH, wobei -YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe bedeutet, durch Kupplung der Proteine, Peptide und Derivate derselben mittels Brücken über kovalente Bindungen an wasserunlösliche Polymere mit einer oder mehreren Gruppen -XH, wobei -XH eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt.

.Sowohl die Gruppe -XH des Polymeren als auch die Gruppe -YH der Proteine, Peptide und Derivate derselben, die hier auch als Biopolymere bezeichnet werden, enthält somit ein reaktionsfähiges Wasserstoffatom.

Derartige Kupplungsverfahren sind bereits bekannt. Zum Beispiel wird in der dänischen Patentschrift 1 03 287 ein Kupplungsverfahren beschrieben, bei dem Enzyme an wasserunlösliche Polymere gebunden werden. Als Mittel zum Erzielen der Bindung wird gemäß dieser Patentschrift Natriumnitrit verwendet, wobei zwischen dem Protein und dem Träger eine Brücke aus einer Azogruppe gebildet wird.

Aus Chemical Abstracts 64, 1966. 18 360 g ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzymen, gemäß welchem das Enzym an Bromacetylcellulose gebunden wird, bekannt.

In einem Obersichtsartikel in Annual Review of Biochemistry Vol.35, (1966), 873-908 wird die Kupplung von Enzymen und anderen Proteinen an wasserunlösliche Polymere durch brückenbildende Mittel, welche kovalente Bindungen bilden, beschrieben.

Die früher benutzten Verfahren weisen Nachteile verschiedener Art, wie eine umständliche Herstellung des Derivates des Polymeren oder eine schlechte Ausbeute bei der Kupplung auf. Darüber hinaus haben diese Verfahren den Nachteil, daß das Biopolymere seine spezifische Aktivität, z. B. Enzymaktivität oder Antikörperaktivität, verliert oder daß die Verfahren nicht allgemein anwendbar, sondern hinsichtlich der A uswu hl möglich -keil der Polymeren und/oder Biopolymeren beschränkt sind.

Die vorstehend erörterten Nachteile der bekannten Verfahren werden erfindungsgemäß dadurch beseitigt, daß man die Kupplung mit einem Halogencyan in alkalisch-wäßrigem Medium durchfuhrt.

Durch die Verwendung eines Halogencyans werden zahlreiche Vorteile erzielt So erfordert das erfindungsgemäße Verfahren keine umständliche Herstellung von komplizierten Zwischenprodukten des polymeren Trä gers. Die Herstellung des reaktionsfähigen Polymerde rivats wird sehr einfach und erfolgt unter schonenden Bedingungen. Die Eigenschaften des Trägerpolymeren verändern sich nur äußerst unerheblich. Biopolymere können dann erfindungsgemäß ohne

ίο weitere Zwischenstufe mit dem reaktionsfähigen Polymerderivat unter Erzielung einer hohen Ausbeute bei der Kupplung gekuppelt werden.

Die Kupplung von Biopolymeren an das Polymere kann erfindungsgemäß unter sehr schonenden Bedin gungen vorgenommen werden, was von besonderer Be deutung ist wenn es sich um die Verwendung von empfindlichen Biopolymeren handelt, welche in vielen Fällen in nur kleinen Mengen zugänglich sind.

Erfindungsgemäß wird mit nur geringen Veränderun-

gen der chemischen und biologischen Eigenschaften des Biopolymeren gekuppelt

Die Reaktion kann technisch gesehen sehr einfach durchgeführt werden. Die verwendeten Halogencyane können, da sie wasserlöslich sind, leicht gehandhabt werden.

Die somit in wäßrig-alkalischem Medium vorzunehmende Kupplung wird zweckmäßigerweise in einem schwach alkalischen Medium durchgeführt Die Temperatur ist variabel, d. h. liegt beispielsweise im Bereich von 0 bis 50° C Die Umsetzung beruht auf der Bildung von Brücken mit Kovalenz-Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Biopolymeren. Untersuchungen haben gezeigt daß die Brücken die Konstitution

A —X —C—Υ—Β

haben, wobei A der Rest des Polymeren und B der Rest des Biopolymeren und Z eine Imincgruppe (= NH) oder Sauerstoff {- O) ist. Die Tatsache, daß Z auch Sauerstoff sein kann, beruht darauf, daß die Iminogruppe in bestimmten Fällen durch Hydrolyse in Sauerstoff umgewandelt werden kann.

Gemäß der Erfindung kann die Umsetzung in einer oder mehreren Stufen, in der Regel jedoch in zwei Stufen, durchgeführt werden. Die erste dieser Stufen wird gewöhnlich in der Weise durchgefühlt, daß das in Wasser unlösliche Polymere, welches eine oder mehrere

so Gri'ppen der Formel -XH enthält, mit einem Halogencyan in Berührung gebracht wird, wobei das letztere in Form der reinen Substanz oder in Lösung vorliegt. Als Halogencyan kann gewöhnlich die Jod-, Chlor- oder Bromverbindung oder wahlweise ein Gemisch dersel ben verwendet werden. Die Umsetzung wird unter alka lischen Bedingungen durchgeführt, was durch die Zugabe einer geeigneten alkalischen Verbindung, beispielsweise Natriumhydroxid, gewährleistet wird. Geeignete pH-Werte sind in erster Linie Werte im Bereich von 8

ω bis 13. Ist -XH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, so ist es möglich, in einem schwächer alkalischen Medium /u arbeiten, als wenn -XH eine Hydroxygruppe ist. Der Fachmann kann durch einfache Vorversuche leicht den entsprechenden pH-Wert oder pH-Intervall ermitteln. Die Umsetzung kann bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise im Bereich von 0 bis 5O⁰C, durchgeführt werden. Man arbeitet in einer wäßrigen Lösung, wobei jedoch gewisse Verluste

an Halogencyan dadurch eintreten, daß ein Teil des letzteren durch Hydrolyse verbraucht wird. Durch die Umsetzung werden reaktionsfähige Derivate des Polymeren erhalten, die dann unmittelbar, wahlweise nach der Isolierung, weiter mit einem Biopolymeren umgesetzt werden können. Das reaktionsfähige Derivat kann auch unter geeigneten Bedingungen gelagert und später mit dem Biopolymeren umgesetzt werden. Vor der Bindung an das Biopolymere kann das reaktionsfähige Derivat, beispielsweise durch Waschen des in Wasser unlöslichen Polymeren, gereinigt werden. Die Struktur des reaktionsfähigen Zwischenprodukts wurde nicht sicher bestimmt Es ist jedoch nicht erforderlich, die Struktur des Zwischenprodukts zu kennen, da das endgültige Ergebnis der Umsetzung von Interesse ist

Die zweite Verfahrensstufe wird vorzugsweise in einer schwach alkalischen Lösung bei einer Temperatur durchgeführt die beispielsweise im Bereich von 0 bis 50"C, z. B. bei Raumtemperatur, liegen kann. Ein Vorteil besteht darin, daß diese Stufe in wäßriger Lösung durchgeführt wird.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können auch empfindliche Biopolymere, die eine oder mehrere —YH-Gruppen enthalten, beispielsweise Proteine und Peptide, an Polymere der vorstehend beschriebenen Art gebunden werden, ohne daß das Biopolymere zerstört wird oder irgend einer unerwünschten Veränderung unterliegt Es ist möglich, Proteine und Peptide zu binden, ohne daß die Peptidbindungen gelöst werden. Gemäß der Erfindung ist es also möglich, beispielsweise Enzyme an Polymere zu binden, ohne daß ein wesentlicher Verlust der Enzymwirksamkeit eittritt un-J einen Antikörper an das Polymere zu binden, ohne daß die Fähigkeit des Antikörpers, sein Antigen zu binde.. verlorengeht. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher ein überraschend leichtes und einfaches Verfahren zur Bindung von Biopolymeren an Polymere der vorstehend angegebenen Art dar.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Polymere ein in Wasser unlösliches Derivat eines Polysaccharide sein, das Hydroxylgruppen und/oder primäre und/ oder sekundäre Aminogruppen enthält. Beispiele für Polysaccharide sind: Dextran, Zellulose, Stärke, Dextrin oder eine Hydroxylgruppe enthaltende Derivate derartiger Polysaccharide, wie Hydroxyäthylzellulose, oder eine Aminogruppe enthaltende Derivate, wie p-Aminophenoxyhydroxypropyldextran, sowie Agars.

Ein anderes Beispiel eines Polymeren, das Hydroxylgruppen enthält, ist Polyvinylalkohol.

Das durchschnittliche Molekulargewicht des ausgewählten Polymeren, das eine oder mehrere —YH-Gruppen enthält, kann innerhalb weiter Bereiche schwanken. Vorzugsweise sollte es jedoch über etwa 1000, beispielsweise über etwa 10 000 liegen.

Gemäß der Erfindung ist das Polymere unlöslich in Wasser. Es kann jedoch in Wasser quellbar sein. In diesem Fall kann es aus einem vernetzten dreidimensionalen, Hydroxylgruppen enthaltenden Netzgefüge bestehen, das in Wasser unlöslich, jedoch quellbar ist. Als Beispiel können Polymere, erhalten durch Vernetzung von Dextran mit einer bifunktionellen Verbindung, wie Epichlorhydrin, erwähnt werden, die durch eine variierende Fähigkeit, Wasser zu absorbieren, gekennzeichnet sind. Polymere anderer Polysaccharide oder anderer Hydroxylverbindungen, welche durch Vernetzung der letztgenannten mit bifunktionellen Verbindungen erhalten worden sind, können in Frage kommen, z. B. Polymere, welche durch Vernetzung von Saccharose und Zuckeralkoholen, beispielsweise Sorbit Mannit und Polyvinylalkohol erhalten worden sind. Zu derartigen Polymeren gehören auch solche, die durch primäre oder sekundäre Aminogruppen, wie p-Aminophenoxyhydroxypropylgruppen, substituiert sind.

Als Biopolymere, die eine oder mehrere Gruppen der Formel -YH enthalten, und die gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem reaktionsfähigen Derivat umgesetzt werden sollen, sind hier Proteine und Peptide so- wie Derivate derselben zu verstehen. Beispiele für derartige Biopolymere sind Enzyme oder Derivate von Enzymen, Antikörper oder Derivate von Antikörpern, Antigene oder Derivate von Amigenen, Protein- und/oder Pepiidhonnone oder Antigenproteine. Die in Wasser unlöslichen Verfahrensprodukte sind von großem Interesse. Ein Enzym, das erfindungsgemäß an ein unlösliches Polymeres gebunden wird, kann daher in eine Schicht eingebettet werden, und diese Schicht kann als Reaktor für chemische Umsetzungen verwendet werden. So kann z. B. eine Lösung eines Substrats durch die Enzymschicht geführt werden, um dieses Substrat in ein wertvolles Produkt umzuwandeln. Die Umsetzung wird automatisch unterbrochen, wenn die Lösung die Schicht verläßt Das feste Enzym kann während langer Zeit in einem kontinuierlichen Verfahren verwendet werden.

Ein anderes Beispiel besteht darin. Antikörper nach dem erfindungsgemäßen Verfahren an Polymere zu binden. Derartige Produkte können besonders mit dem entsprechenden Antigen, beispielsweise zur analyti sehen Bestimmung des letzteren, vereinigt werden.

Beispiel 1

Binden von Chymotrypsin an mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran

A. Aktivierung des Polymeren durch Umsetzung mit Bromcyan

-to 200 mg mit Epichlorhydrin vernetzt·* Dextran in Form von Teilchen eines in Wasser quellfähigen Produktes, erhalten durch Vernetzung des Dextrans in alkalischem Medium mit Epichlorhydrin, wobei die Teilchen in nicht gequollenem Zustand einen Durchmesser von 40— 120 μ hatten und imstande waren, 20 g Wasser pro 1 g Trockensubstanz durch Quellung aufzunehmen, wurden mit 8 cm³ einer wäßrigen Lösung aus 25 mg Bromcyan je cm^J Waster gemischt. Die Umsetzung wuTde bei 23° C unter Rühren durchgeführt, und der

so pH-Wert des Gemisches wurde bei 11,5 gehalten, wobei ein automatisches Titriergerät für die Zugabe einer 2 M Natriumhydroxidlösung verwendet wurde. Die Reaktionszeit betrug 6 Minuten. Das Produkt wurde schnell mit kaltem Wasser durch Absaugen auf einem Glasfilter gewaschen und für die nächste Reaktionsstufe verwendet.

B. Umsetzung mit Chymotrypsin

bö Das in Stufe A erhaltene aktivierte Polymere wurde mit 200 mg Chymotrypsin in 2 cm³ einer 0,1 M Natriumhydrocarbonatlösung gemischt, woraufhin man das Gemisch unter Rühren bei 23⁰C während 20 Stunden reagieren ließ. Nach Absaugen des Produkts auf einem Glasfilter wurde es mit einer 0,1 M Natriumbicarbonailösung, 10-^J M Salzsäure, Wasser, einer 0,5 M Natriumchloridlösung, Wasser und Gemischen aus Wasser und Aceton mit steigenden Acetonkonzentrationen und

schließlich mit reinem Aceton gewaschen. Das Produkt wurde dann getrocknet Das nach der Analyse der Aminosäure erhaltene Ergebnis war ein Gehalt von 200 mg Protein je g des getrockneten Endprodukts.

Beispiel 2

Binden von Insulin an ein mit Epichlorhydrin
vernetztes Dextran

A. Aktivierung des vernetzten Dextrans
durch Umsetzung mit Jodcyan

50 mg des in Beispiel 1 angegebenen vernetzten Dextrans wurden mit 2 cm' einer wäßrigen Lösung aus 30 mg Jodcyan pro cm³ Wasser gemischt Die Umsetzung fand bei 23° C unter Rühren statt Der pH-Wert des Gemisches betrug 11 und die Reaktionszeit 25 Minuten. Im übrigen war die Stufenfolge die gleiche wie in Beispiel 1.

10

B. Umsetzung mit Insulin

Das in Stufe A erhaltene aktivierte vernetzte Dextran wurde zu einer 0,5 M Natriumhydrocarbonatlösung gegeben, und der Rückstand wurde durch Absaugen von dem Gel entfernt Letzteres wurde dann mit 11,5 mg Insulin (vom Schwein), dem das Zink entzogen worden war, in 150 μΐ einer 04 M Natriumbicarbonatlösung gemischt Die Umsetzung wurde 5 Stunden bei 23°C durchgeführt Das erhaltene Produkt wurde gewaschen und auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. Das durch Analyse der Aminosäuren erhaltene Ergebnis zeigte einen Gehalt von 24 mg Insulin je g des getrockneten Reaktionsproduktes.

Beispiel 3

Bir den von ^-Globulin (antichoriomisches

Gonadotropin) an Aminogruppen-substituiertes

(p-Aminophenoxyhydroxypropylätber)mit

Epichlorhydrin vernetztes Dextran

A. Aktivierung des p-Aminophenoxyhydroxypropyläihers des vernetzen Dextrans

100 mg p-Aminophenoxyhydroxypropylätlv;r des vernetzten Dextrans, das etwa 250μ-ΜοΙ Aminogruppen je g des Polymeren enthielt, wurden in 3 cm³ Wasser gequollen. 50 mg Bromcyan wurden in 3 cm³ Wasser gelöst und unter Rühren zu dem Gel gegeben. Der pH-Wert wurde auf 8 eingestellt und auf diese Höhe 5 Minuten durch Zugabe von 04 M Natriumhydroxydlösung gehalten. Nach Abschluß der Umsetzung wurde das Gel schnell mit kaltem Wasser und einer 0,1 M Natriumbicarbonatlösung gewaschen und unmittelbar weiterverwendet.

B. Umsetzung mit ^Globulin
(antichoriomisches Gonadotropin)

Antiserum gegen choriornisches Gonadotropin beim Menschen wurde aus Kaninchen nach Injektion der Hormone in einem Freund-Adjuvans isoliert. Die Immunoglobuline werden durch Zugabe des halben Volumens gesättigter Ammo ,liumsulfatlösung bei Raumtemperatur niedergeschlagen, was zweimal wiederholt wurde. Der zuletzt erhaltene Niederschlag wurde in 0,1 M Natriumbicarbonatlösung gelöst und dialysiert

04 cm³ der antichoriomischen Gonadotropin-Lösung, die O^ cm³ Antiserum entsprechen, wurden mit dem aktivierten Polymeren während 5 Stunden bei 23° C urngesetzt. Das Produkt wurde mit 0,1 M Natriumbicarbonatlösung, 0,5 M Natriumchloridlösung, Wasser, 10~⁴ M Salzsäure und Wasser gewaschen. Ein Teil des Produktes wurde eingeengt und für die Analyse getrocknet Es wurde gefunden, daß es etwa 34 mg Protein je g des Polymeren enthielt

Der größte Teil des Produkts wurde für radioimmunologische Bestimmungen von choriomischem Gonadotropin verwendet Das Produkt war zur Bindung des Gonadotropins ausgezeichnet geeignet

Beispiel 4

Bindung von Oxytocin an Zellulose

A. Aktivierung der Zellulose a./rch Umsetzung
mit Bromcyan

Zellulose in Pulverform wurde durch Behandlung mit 17,5%iger Natriumhydroxydlösung bei 0°C während 24 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre mercerisiert 50 mg der mercerisierten Zellulose wurden mit 2 cm³ Bromcyan-Lösung mit einem Gehalt von 25 mg BrCN pro cm³ Wasser bei einem pH-Wert von 11 während 12 Minuten bei 23° C aktiviert. Das Protakt wurde mit kaltem Wasser gewaschen, und 0,1 M Natriumbicarbonatlösung wurden zugegeben. Der Rückstand wurde abgesaugt.

B. Umsetzung mit Oxytocin

Die aktivierte Zellulose wurde mit 10 mg Oxytocin in lern³ 04 M Natriumbicarbonatlösung während 10 Stunden bei 23° C umgesetzt. Das erhaltene Produkt wurde gewaschen und nach Beispiel 1 B eingeengt. Die Analyse zeigte 75 mg Oxytocin je g getrocknetes Reaktijnsprodukt an.

Beispiel 5

Bindung von Glucoseoxydase an Agar

A. Aktivierung von Agar durch Umsetzung
mit Bromcyan

Kugelförmige Agarteilchen, die in Wasser gequollen waren, und deren Trockengewicht 2% betrug, wobei der Partikeldurchrnesser in gequollenem Zustand 60—250 μ war, wurden auf einem Glasfilter abgesaugt. 3,9_W"; (gleich 100 mg geschrumpftes und getrocknetes Agar) wurden mit 4 cm³ einer Bromcyanlösung versetzt, die 25 mg BrCN je cm³ Wasser enthielt. Dann wurde der Aktivierungsvorgang nach Beispiel 1 B bei einem ph-Wert von 11 durch Zugabe von 2 M Natriumhydroxydlösung während 6 Minuten bei 23°C unter Verwendung eines automatischen Titriergeräts bewirkt. Das aktivierte Produkt wurde auf einem Glasfilter mit 1 Liter Eis· wasser gewaschen und schließlich schnei.¹ n,it 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von '/,4 gewaschen.

B. Umse'zung mit Glucoseoxydase

Das aktivierte Polymere wurde mit 24 mg Glucoseoxydase (gereinigtes Material von der Firma Worthington Biochemical Corp.) umgesetzt, die in 1 cm³ eines 0,1 M Phosphatpuffers mii einem oH-Wcrt von 7.4 up-

7 8

löst war. Die Umsetzung fand während 10 Stunden unter langsamer Rotation des ReaktionsgcfäOes statt. Das

erhaltene Gel wurde in eine Kolonne gegeben und mit I \

Liter 0,1 M Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,6, '

der mittels einer Pumpe während 10 Stunden durch die ■> Kolonne geführt wurde, gewaschen. \

Ein Teil des Gels wurde abgetrennt, mit Aceton be- -■

handelt, getrocknet und auf Protein analysiert. Es wurde .·;

dabei errechnet, daß die Menge der gebundenen Gluco- ;

seoxydase 30 mg je g des getrockneten Polymerpro- io ;j

dukts betrug. !

Es wurde gefunden, daß das gebundene Enzym eine .:

beachtliche Aktivität besitzt, und die Kolonne zur Bestimmung von Glucose verwendet werden konnte. Es wurde ferner gefunden, daß die Kolonne gute chroma- is

tographische Eigenschaften besitzt. ;

20

25

30

b0

40

45

50

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von in Wasser unlöslichen, chemisch oder biologisch wirksamen Derivaten von Proteinen. Peptiden und Derivaten derselben mit einer oder mehreren Gruppen -YH, wobei -YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe bedeutet, durch Kupplung der Proteine, Peptide und Derivate derselben mittels Brücken über kovalente Bindungen an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Gruppen -XH, wobei -XH eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kupplung mit einem Halogencyan in alkalisch-wäßrigem Medium durchführt