DE2028588A1

DE2028588A1 - Verfahren zur Gewinnung von Thymidin-Kinase

Info

Publication number: DE2028588A1
Application number: DE19702028588
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl.-Chem.Dr. 3406 Boveden; Lezius Axel Dipl.-Chem.D. 3400 Göttingen Rohde
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1970-06-10
Filing date: 1970-06-10
Publication date: 1971-12-16
Also published as: US3791928A; GB1305679A; FR2096206A5

Description

DlI¹L. - ING. «-, *V EICiCi,- AN"N. '

Dipl.- Ing. H.Teickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke ■D1PL.-INÖ. F. A.WeiCKMANN, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN HZW POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22

Max-Planck-Geaellsohaft £5ur Förderung der /Wissenschaften E.Y,_} München 1, Residenzstr. 1a

Verfahren zur Gewinnung von Thymidin-Kinase

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung von Ehyciidin-Kinase aus wässrigen Lösungen, insbesondere aus den durch andere Proteine verunreinigten Lösungen.

Ihymidin-Kinase ist ein im Tier- und Pflanzenreich weit verbreitetes Enzym und läßt sich aus den durch Aufschluß des Zellmaterials gewonnenen Lösungen gewinnen. Nach einem bekannten Verfahren wird die Thymidin-Xinase aus E. coli gewonnen durch Aufschluß bei pH 7, Hitzeschritt bei 70 bis 72⁰C, StreptomycinV fälliing, zweimalige Aminoniumsulfatfraktionierung und Chromatographie ⁿ"ber DEAE-Cellulose (R. Okazaki und A. Kornberg in J.Biol.Chem. 2£9, (1964) S. 269 ff.). Der Nachteil dieses Verfahrens becteht darin, daß es verhältnismäßig umständlich ist und nur eine Ausbeute von etwa 7 $ ergibt.

Nunmehr wurde ein Verfahren gefunden, welches auf äußerst einfache Weise in einem einzigen Schritt eine außerordentlich starke Anreicherung und Reinigung der Thyraidin-Kinase bei Ausbeuten von über 90 fo ermöglicht.

Das erfinaungsgemaße Verfahren zur Reinigung bzw. Gewinnung von Thymidin-Einase besteht darin, daß man eine Thymidin-Kinase enthaltende wässrige Lösung mit einem vernetzten Polymer oder Gel,

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welches 5'- oder 3'-Aminothymidin oder ein N-mono-(o>-Aminoalkyl) -Derivat davon gebunden enthält, behandelt, das Polymer oder Gel abtrennt und die Thymidin-Kina.se eluiert.

Die Erfindung beruht auf der überraschend aufgefundenen Tatsache, daß 3'-Aminothymidin und. 5'"Aminothymidin sov/ie deren am Aminostickstoff durch eine w-Aminoalkylgruppe monosubstituierte Derivate bei vergleichsweise hohen Konzentrationen von 10 M eine schwache Inhibierungswirkung für die Thymidin-Kinase aufweisen. Die weitere Untersuchung ergab, daß ein mit diesen Verbindungen belegtes Polymer oder Gel von poröser Struktur die Thymidin-Kinase aus ihren wässrigen Lösungen praktisch quantitativ und selektiv zurückzuhalten vermag«. Als besonders geeignet erwies sich hierbei eine für Chromatographiezwecke handelsübliche vernetzte Dextrose»

Die Herstellung des für das Verfahren der Erfindung bevorzugten substituierten Deztrans erfolgt in für derartige Umsetzungen an sich bekannter Weise durch Aktivierung des Dextrans mit Bromcyan und nachfolgende Kopplung des aktivierten Dextrans mit dem oben erwähnten Aminothymidin.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen ^-sich grundsätzlich alle wässrigen Lösungen^ die Thymidin-Kinase enthalten, unter der Voraussetzung₉ daß keine mit dem Gel bzw. Polymer reaktionsfähigen Stoffe darin enthalten sind₀ Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Gewinnung und Reinigung von Thymidin-Kinase aus den durch Aufschluß von tierischen »und pflanzliche^ insbesondere von mikrobiologischen Ausgangsmaterial erhaltenen Lösungen« Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch dazu» bei Verfahren zur Gewinnung anderer Proteine an beliebiger Stelle eingeschaltet zu werden, da andere Enzymaktivitäten hierdurch nicht beeinträchtigt werden,,

Ba E. coli ein "besonders geeignetes Ausgangsmaterial für die Gewinnung der Thymidin-Kinase darstellt ρ wird vorzugsweise eine

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duxclL Aufschluß von E. coil erhaltene Lösung verwendet; Es können Jedoch aucl» aus anderen Ausgangsmaterial gewonnene oder MinstXicli hergestellte Lösungen -verwendet werden.

Wärmen durch AufSchluß von E. coil erhaltene Lösungen verwendet, so ist es zweckmäßig, eine Streptomycinfällung vorzuschalten. Falls kein Wert auf die Erhaltung anderer in der Lösung vorhande^ei· Iktsymalrfcivitäten gelegt wird, kann zusätzlich eine weitere Türreinigung auch durch einen Hitze schritt bei etwa 7O⁰C erfolgen« Ein solcher Hitzesehritt hat den Torteil, daß hierdurch die BintoogEÜrapazität des Gels oder Polymers erhöht wird.

Die selektive Adsorbtion der Thymidin-Kinase hängt sowohl von der Salzkonzentration der Lösung als auch von den sonstigen Verfakrensvariablen, insbesondere der Vorbehandlung des substituierten Bextrans ab« Eine vollständige Bindung der Thymidin-Kinase wird im allgemeinen erzielt, wenn die Lösung eine SaIzkonEeiitration von weniger als 0,1 M aufweist. Um eine Schädigung der Aktivität des Enzyms auszuschließen, wird bei neutralem oder schwach, basischem pH-Wert, vorzugsweise zwischen pH 7 und 8,5 gearbeitet. Die jeweils zulässige Salzkonzentration läßt sich in äußerst einfacher Weise feststellen, indem nach Zugabe tHs Dextrans zur Lösung die Restaktivität im Überstand bestimmt und gegebenenfalls weiteres Wasser hinzugefügt wird.

Das substituierte Dextran wird nach dem Aufziehen der Thymidin-Kinase äsweckiasLßig gewaschen. Hierzu eignen sich besonders Salzlösungen ait einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und 0,25 iä. Unter Umständen lassen sich jedoch auch wesentlich höhere SaIskonzenträtionen für die Waschung verwenden, beispielsweise bei Verwendung einer Dextransäule, die mit verdünntem Triäthanolamin-Acetatpuffer pH 7,5 äquilibriert wurde. In diesem EaIl kann FreMdprotein noch mit 1 m Säurelösungen, beispielsv;eise solchen von liatriuEiacetat, ohne Beeinträchtigung der Enzymaktivität ausgewaschen werden.

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Die Rückgewinnung der gebundenen Thymidin-Kinase (im Rahmen der Erfindung "wird hierunter sowohl Ihymidin-Kinase als auch Desoxythymidin-Kinase verstanden) erfolgt durch Elution des Dex~ trans mit höheren Salzkonzentrationen, zweckmäßig mit Salzlösungen von mindestens 0,3 m. Als besonders geeignet erwies sich eine 0,4 bis 1,0 M, insbesondere 0,5 M NaCl-Lösung von Ph 7 bis 9, insbesondere pH 8.

Das Zusammenbringen der wässrigen Lösung der Thymidin-Kinase mit dem substituierten Dextran kann auf jede beliebige Weise erfolgen. Zweckmäßig wird entweder das Dextran mit der lösung verrührt und dann abfiltriert oder die Lösung über das Dextran filtriert. Im letzteren Falle wird vorzugsweise nach Art einer Säulenchromatographie gearbeitet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht bei Ausbeuten von 90 $> und darüber eine Anreicherung der Thymidin-Kinase in einem einsigen Schritt bis zum 1000-fachen. Abgesehen von diesen hohen Ausbeuten und der außerordentlichen Reinigungswirkung zeichnet sich das Verfahren auch durch seine allgemeine Anwendbarkeit sowie durch die einfache Herstellbarkeit des substituierten Dextrans und dessen gute Stabilität aus, die eine wiederholte Verwendung ohne Kapazitätsverlust ermöglicht.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung weiter.

A. Herstellung des substituierten Dextrans

Im Handel erhältliches vernetztes Dextran von Chromatographiequalität (Sepharose 4B) wird mit Wasser angeteigt und dann mit 100 mg Bromcyan / ml Dextran, gelöst in einem gleichen Volumen Wasser, versetzt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von Natronlauge sofort auf etwa 11 eingestellt und nach etwa 8 Minuten wird die wässrige Lösung abgesaugt und das Dextran mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung gewaschen.

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950 ml so vorbehandelter Sepharose werden in 0,1 m Phosphat- puffer pH 9 mit 1,3 g 5'-Aminothymidin versetzt. Das so erhaltene Produkt kann direkt verwendet v/erden.

B. Durchführung des Verfahrens der Erfindung

E. coli werden in an sich bekannter Weise in 0,05 m Glycylglycinpuffer pH 7 durch Schütteln mit Glaskügelchen aufgeschlossen und zentrifugiert. Der Zentrifugenüberstand wird mit etwa 0,2 Volumen 5$ige Streptomyci.nsulfatlösung versetzt und der gebildete Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird 5 Minuten auf 70 bis 72⁰C erhitzt und vom Unlöslichen abzeiitri· fugiert.

14t7 1 einer auf diese Weise erhaltenen Lösung mit einem Proteingehalt von 8,9 mg/ml und einer spezifischen Aktivität von 0,0201 E/mg werden anschließend über eine Säule gegeben, die mit dem unter A. beschriebenen substituierten Dextran gefüllt ist. Die Säule wird mit Trispuffer pH 8 von der Ionenstärke 0,01 gewaschen und dann mit 0,02 m Trispuffer pH 8,0/0,5 m NaCl eluiert. Die Ergebnisse zeigt Tabelle I.

Tabelle I

Vol. Einheiten <Ein- Protein spez.Akt. An- Ausml pro ml heiten mg/ml E/mg rei- beu-

——__ .__——__—. —_—— eher, te

Ausgangslösung 14700 0,184 2700 8,9 0,0201 Eluat * ' .1790 1,34 2400 0,32 4,2 204- 89 $

fach

Zum Vergleich wurde unter Verwendung der gleichen Ausgangslösung nach dem in J.Biol.Chem. 239 (1964) S. 269 beschriebenen Verfahren eine zweimalige Ammoniumsulfatfraktionierung und anschließend eine Chromatographie an DEAE-Cellulose durchgeführt, Nachstehend sind Ausbeute und Anreicherung nach diesem bekannten Verfahren den Werten des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenübergestellt: 10985 1 /1514

Ausbeute	Anreicherung
9,5 1°	218-fach
89 Io	204-fach

bekanntes Verfahren
(drei Schritte)

erfindungsgemäßes
Verfahren (ein Schritt)

Beispiel 2

Das erfindung3gemäße Verfahren läßt sich auch in äußerst stark verdünnten Lösungen durchführen. So wurde eine wässrige Lösung mit einem Gehalt von etwa 1/100 Einheit Desosythymidin-Kinase, die durch Begleitproteine verunreinigt war, in der oben beschriebenen Weise über eine Säule gleichen Volumens gegeben und wie in Beispiel 1 beschrieben eluiert. Die Werte der Ausgangslösung und des Eluats zeigt die Tabelle II.

Tabelle II

ml Einheiten/ml £s_o Protein spez. Akt. _____ ____ mg/ml E/mg;

Fraktion III 50000 0,0108 (!) 540 3,13 0,0035

Eluat (durch 80 5,83 465 6„7 0,87 IJl traf iltra- . .. . ' ·

tion einkonzentriert)

Ausbeute 86 %

Anreicher. ·249-fach

Die obigen Werte zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung der Thymidin-Kinase auch aus außerordentlich verdünnten Lösungen in äußerst spezifischer Weise gestattet«,

Das obige Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von vernetzten Dextranen, die mit 3ⁱ»Aminothymidin bzw«, N-(^£ -Aminohexamethylen)--amino-(5')-thymidin modifiziert waren. Hierbei wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten.

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Claims

— 7 — P a t e η t a η s ρ r ü c he

1. Verfahren zur Reinigung bzw. Gewinnung von Thymidin-Kinass, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Thymidin-Kinase enthaltende wässrige lösung mit einem vernetzten Polymer oder Gel, welches 5'- oder 3'-Arainothymidin oder ein N-mono-(ω-Aminoalkyl)-Derivat davon gebunden enthält, behandelt, das Polymer oder Gel abtrennt und die Thymidin-Kinase eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymer bzw. Gel'ein vernetztes Dextran verwendet» welches mit Bromcyan in an sich bekannter Weise aktiviert und anschließend mit der Aminothymidinverbindung in alkalischem Medium umgesetzt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch Aufschluß von E. coli erhaltene Lösung verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch Streptomycinsulfat-Pallung und gegebenenfalls Hitze- . schritt bei 7O⁰C vorbehandelte Lösung verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung mit einer Salzkonzentration von nicht mehr als 0,1 m verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution mit einer mindestens 0,3 m Salzlösung durchgeführt wird.

7.' Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer 0,4 m bis 1,0 m NaCl-Lösung, pH 7 bis 9, vorzugsweise pH 8, eluiert wird.

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