DE1767389A1 - Verfahren zur Abtrennung von Pyrogenen aus Rohpraeparaten von L-Asparaginase - Google Patents
Verfahren zur Abtrennung von Pyrogenen aus Rohpraeparaten von L-AsparaginaseInfo
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Description
LEVEllKUSEN-fciytnmk 3· Mai I968
Patent-AbttUuai Si/RBg
Verfahren zur Abtrennung von Pyrogenen aus Rohpräparaten von L-Asparaginase
L-Asparaginase, ein Enzym* welches die Amidgruppe des
L-Aaparagins hydrolytisch spaltet, hat zur Bekämpfung des malignen Wachstums in der Medizin große Bedeutung
bekommen.
Die für chemotherapeutische Zwecke geeignete L-Asparaginase wird nach Methoden« die von Campbell et al /Biochemistry
§, (1967)* Seite 7217 beschrieben worden sind, aus E» coil
hergestellt. Hierbei werden Fyrogene der Colizellen in das
Endprodukt eingeschleppt. "
Ebenso ist es möglich, daß während der Aufarbeitung, die
sun größten Teil im wäßrigen Medium geschehen muß, Verunreinigungen
In die L-Asparaginasepräparation gelangen, die
pyrogen wirken. Trotz vieler Bemühungen ist es bisher nicht
Γ
gelungen, pyrogenfreie L-Aeparaginaae zu erhalten* Auch die
Le A 11 »JJ3
109836/1184
6AD
üblichen Methoden zur Entfernung der Pyrogene, wie die
Filtration über Klärschichten, Adsorptionsmethoden mit Hydroxylapatit, Aluminiumhydroxyd, Silikaten, ferner mit
Kunstharzen, führten zu keinem Erfolg. Selbst die Chromatographie an Dextrangelen ohne ionisierte Gruppen oder an
Diäthylaminoäthyl-Cellulose nach Campbell war vergeblich.
Es wurde nun gefunden, daß man die Pyrogene aus rohen L-Asparaginasepräparaten mit Hilfe von Diäthylaminoäthyldextrangelen (DEAE-Dextrangel) entfernen kann, indem man
das Enzym in Puffern niedriger Ionenstärke löst, die so erhaltene Lösung entweder nach der chromatographischen Methodik auf eine Säule des gequollenen und mit demselben Puffer
äquilibrierten Dextrangels gibt und die L-Asparaglnase durch steigende Salzkonzentration fraktioniert und eluiert oder sie
nach der Batoh-Methode mit dem Dextrangel versetzt, die Suspension filtriert oder zentrifugiert und das an das OeI
gebundene Enzym mit geeigneten Puffern höherer Salzkonzentration eluiert.
Bei dem chromatographischen Verfahren löst man das rohe Enzympräparat in etwa 0,02 M-Puffern, vorzugsweise Ammoniumacetat- oder Pormiat-Puffern, im neutralen oder leioht
alkalischen Bereich, etwa pH 7 bis 8,5» auf, wobei dl·
entstehende Lösung nicht zu konzentriert sein darf. Vorzugsweise werden 1- bis 2-£ige Lösungen des Enzyme verwendet .
,- » 11 Vn
-Z- 109836/1H*
BAD ORIGINAL
Das Dextrangel wird zuvor in demselben Puffer gequollen und durch mehrmaligen Wechsel des Puffers äquilibriert. Es wird"
hierauf in Chromatographiesäulen gefüllt, wobei das Verhältnis von Durchmesser zu Betthöhe 1 : J bis 1 : 30 beträgt.
Die Enzymlösung wird auf die Säule gegeben, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 2 bis 4 ml/Stunde und pro cm Querschnitt
der Säule beträgt. Die Elution wird mit steigendem Salzgehalt des Puffers durchgeführt, am besten mit einem linearen Qradienten; es ist jedoch ebenso möglich, die Konzentration des
Elutionsmittels stufenweise zu erhöhen. Das Enzym wird von ™
Die Reinigung läßt sich auch im Batch-Verfahren durchführen, indem man die Enzymlösung zu dem gequollenen DEAE-Dextrangel
gibt und das pH auf 7*5 einstellt. Das Enzym wird hierbei von
dem QeI absorbiert und kann nach gründlichem Auswaschen des QeIs auf einer Nutsche oder mit Hilfe einer Zentrifuge von
Salzlösungen geeigneter Konzentration eluiert werden. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber dem Säulenverfahren 1st, μ
dafi man einfach mit großen Mengen arbeiten kann. Der Nachteil besteht in der weniger exakt möglichen Trennung von Begleitsubstanzen und der zur Elution nötigen größeren Flüssigkeitsmenge.
Di· Isolierung der L-Asparaginase aus der Lösung In fester Form
kann nach bekannten Methoden, wie z. B. der Qefriertrooknung,
gegebenenfalls nach Dialyse oder durch Fällung mit
1L , 109836/1184
Le A 11 4*3 - 3 -
BAD ORIGINAL
Polyäthylenglycol oder Aceton geschehen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man, ausgehend
von Präparaten mit etwa 20 bis 100 U/mg Reinpräparate mit 18O bis 220 U/mg Protein, die frei von pyrogenen Begleitstoffen
sind. Diese Präparate sind zur Anwendung in der Chemotherapie geeignet.
109836/1184
La A 11 443 - 4 -
30 g DEAE-Dextrangel (Diäthylaminoäthyldextrangel = DEAE-Sephadex
A 50 * Handelsprodukt der Aktiebolaget Pharmacia,
Uppsala, Schweden) wird in der üblichen Weise vorbehandelt, mit 0,02 M-Glycin, 0,02 M-Ammoniumformiatpuffer pH 7,8 äquilibriert
und in eine Säule mit 3*2 cm Durchmesser eingefüllt.
Betthöhe: 90 cm. 500 mg rohe L-Asparaginase mit 100 U/mg werden
in 50 ml obigen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen.
Anschließend wird das Enzym mit einem linearen Gradienten von 2 Litern des obigen Puffers zu 2 Litern 0,02 M-Glycin,
1 M-Ammoniumformiat pH 7*5 eluiert. Die Asparaginase-haltlgen
Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute:
1,03 g mit 27 800 U - 83 % der eingesetzten Aktivität. Die
spezifische Aktivität, auf Protein bezogen, beträgt 210 U/mg.
Pyrogentest am Kaninchen: 5 Kaninchen wurden 200 U/kg Tier gegeben. Der Mittelwert der Temperaturerhöhung betrug
0,480C.
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen
eine Temperaturerhöhung um 1,60C.
30 g DEAE-Dextrangel werden in der üblichen Weise vorbehandelt
und mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7#5 äquilibriert und in eine Säule mit 3,2 cm Durchmesser eingefüllt. Bettle
* 11 H3 -5- 109836/1 1 8A
höhe: 95 cm. 500 mg rohe L-Asparaginase mit 39,7 U/mg werden
in 50 ml 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 gelöst und auf die
Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt mit einem linearen Gradienten von 2 Litern 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 zu
2 Litern 1 M-Ammoniumacetat pH 7,5. Die Asparaginasehaltigen
Fraktionen werden vereinigt. Ausbeute 18 600 U » 94 % der eingesetzten Aktivität. Spezifische Aktivität:
200 U/mg Protein.
Pyrogentest am Kaninchen: Bei 300 U/kg Tier betrug der
Mittelwert der Temperaturerhöhung 0,4°c.
Die Ausgangssubstanz zeigte bei 200 U/kg Tier eine Temperaturerhöhung
um 1,60C.
Zum Vergleich sei ein Reinigungsversuch mit Diäthylaminoäthyl-Cellulose
angeführt:
30 g DEAE-Cellulose wurden mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7#5
äquilibriert und in eine Säule eingefüllt. 500 mg rohe L-" Asparaginase (34 U/mg) wurden in 50 ml des obigen Puffers
gelöst, auf die Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 1 Liter 0,05 Ammoniumacetat pH 7,5 zu 1
Liter 0,5 M-Ammoniumacetat pH 7,5 eluiert. Ausbeute: 14 000 U = 82 % der Aktivität mit 89 U/mg Protein.
Pyrogentest am Kaninchen: Eei 200 U/kg Tier betrug der
Mittelwert der Temperaturerhöhung 1,O0C.
L. A 11 44, -6- 109836/118*
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen
eine Temperaturerhöhung um 1,8°C.
Auch andere Versuchsbedingungen erbrachten keine weitergehende Entfernung der Pyrogene, woraus die Überlegenheit
des erfindungsgemäßen Verfahrens klar hervorgeht.
490 g DEAE-Dextrangel wurden wie üblich vorbehandelt und
mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert, dem Merthiolat in einer Konzentration von 20 mg/Liter zugesetzt war. Die
Suspension wurde in eine auf 4°C gekühlte Säule mit dem Durchmesser von 20 cm gegeben. Betthöhe: 65 cm. 9,8 g einer
Rohasparaginase mit 46 U/mg wurden in 88O ml 0,02 M-Ammoniumacetat
pH 7,5 gelöst und auf die Säule gegeben. Elution mit linearem Gradienten von 10 Litern 0,05 M-Ammoniumacetat
pH 7,5 zu 10 Litern 0,5 M-Ammoniumacetat pH 7,5- Die Asparaginase-haltigen
Fraktionen wurden vereinigt. Ausbeute: 365 000 U = 81 % der eingesetzten Menge.
Spezifischer Pyrogentest am Kaninchen: Bei 200 U/kg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 0,330C.
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,8°C.
Zu 10 g DEAE-Dextrangel, äquilibriert in 0,05 M-Ammoniumacetat· Lösung pH 7,5, wird eine Lösung von 100 mg L-Asparaginase mit
Le A 11 44, -7-
39,7 U/mg in 100 ml 0,05 M-Ammoniumacetat-Lösung pH 7., 5
gegeben. Der Ansatz wird 15 Minuten gerührt und dann abgesaugt. Der Rückstand wird nacheinander mit Puffern verschiedener
Ionenstärke eluiert (s. Tabelle). Die bei niedriger Ionenstärke bereits eluierten L-Asparaginaseanteile sind
pyrogenhaltig, während die mit stärkeren Puffern eluierten
Anteile pyrogenfrei sind. Die Ausbeuten sind aus der Tabelle zu ersehen.
Puffer Aktivität Ausbeute Pyrogenität
U % Δ T/Tier (6C)
0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 0,10 M-Ammoniumacetat pH 7,5 0,20 M-Ammoniumacetat pH 7»5
0,40 M-Ammoniumacetat pH 7,5 0,80 M-Ammoniumacetat pH 7,5
5010 | 24 | 1,1 |
3820 | 18 | 1,2 |
7850 | 37 | 0,9 |
4o6o | 19 | 0,3 |
520 | 2 | 0,3 |
109836/1184
Le A 11 443 - 8 - .
Claims (1)
- PatentanspruchVerfahren zur Abtrennung von Pyrogenen aus Rohpräparaten von L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym in Puffern niedriger Ionenstärke löst, die so erhaltene Lösung entwedera) auf eine Säule gequollenen und mit demselben Puffer äqullibrierten Diäthylaminoäthyldextrangels gibt, das Enzym durch steigende Salzkonzentration fraktioniert und eluiert oderb) mit Diäthylaminoäthyldextrangel versetzt, die Suspension filtriert oder zentrifugiert und das an das Gel gebundene Enzym mit Puffern höherer Salzkonzentration eluiert.10 9836/1184Le A 11 443 - 9 -
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