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Verfahren zum Reinigen von Streptokinase Streptokinase ist ein Fermentationsprodukt
von haemolytischen Streptokokken Es wurde vor einiger Zeit festgestellt, daß sie
eine Rolle bei der Auflösung von Blutgerinseln und von Exsudaten spielt, die an
Fibrinkomponenten reich sind. Je nach der Art und Größe dieser Gerinsel bewirkt
Streptokinase in Abwesenheit oder Gegenwart von menschlichem Plasminogen die Auflösung
solcher Gerinnsel. Die Ver-Wendung von Streptokinase (und aus Plasminogen und Streptokinase
hergestelltem Plasmin) war jedoch bis jetzt dadurch begrenztj daß- Streptokinase
so, wie sie aus der Fertnentationsflüssigkeit gewonnen wurde, mit Streptokokkenprotein-Nebenpro
dukten verunreinigt war, die torische Reaktionen im Körper hervorriefen, wie Erhöhung
der Körpertemperatur, Abfall des Blutdruckes, Schüttelfrostj Sauerstoffmangel oder
Cyanose.
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Nach bekannten Verfahren wird nämlich Streptokinase durch l'ermentation
von Streptococctis haemolyticus erzeugt und durch Adsorption aus der Fermentationsflüssigkeit
gewonnen. Bei der Fermentation läßt man das Bakterienwachstum 8 bis 10 Stunden fortschreiten,
worauf man die Fermentation durch Hindurchleiten der Fermentationsflüssigkeit durch
Kühtschlangen unterbricht und die Baktetienzellen abzentrifugiert oder abfiltriert.
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Gemäß der USA.-Patentschrift 2666729 erfolgt die Gewinnung der Streptokinase
aus der Fermentationsflüssigkeit durch Adsorption an Diatomeenerde und Eluieren
mit einem Boratpuffer bei pSÍ-Werten von 7 bis 8.
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Nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2784 145 erfolgt die Gewinnung
der Streptokinase aus der Fermentationsflüssigkeit durch Adsorption an aktiviertem
Magnesiumsilicat bei pH-Werten von 6 bis 7,5 und anschließendes Eluieren mit verdünnter
wäßriger Alkalilösung bei pH-Werten zwischen 9,5 und 11.
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Bei diesen beiden bekannten Gewinnungsverfahren können zwar hohe
Gewinnungsgrade der in der Fermentationsflüssigkeit enthaltenen Streptokinase erzielt
werden; jedoch werden bei diesen bekannten einfachen Adsorptions- und Elutionsverfahren
die oben ertvähnten stickstoffhaltigen Verunreinigungen ebenfalls weitgehend adsorbiert
und zusammen mit der Streptokinase eluiert, so daß das nach diesen Verfahren erhaltene
Produkt erhebliche Mengen an Verunreinigungen, wie Streptodornase und andere Eiweißabbauprodukte,
enthält. Berechnet man die Reinheit der Streptokinase in diesen unmittelbar aus
der Fermentationsflüssigkeit gewonnenen Lösungen in Streptokinaseeinheiten je y
Stickstoff, so ergeben
sich Reinheitswezte für die nach den genannten Patentschriften
gewonnene Streptokinase in der Größenordnung von 130 bis 500, was einem Reinheitsgrad
von etwa 15 bis 60°/o entspricht.
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Die Erfindung betrifft nun die Reinigung der so gewonnenen Streptokinase.
Erfindungsgemäß ist es möglich, die verunreinigenden Proteine aus dem Streptokinasepräparat
zu entfernen und hochgereinigte Streptokinase zu erhalten, so daß Patienten nunrnehr
unterschiedslos mit Streptokinase oder mit durch Streptokinase aktiviertem Plasminogen
behandelt werden können. Diese Behandlung ist von großer Bedeutung bei einer Reihe
von Erkrankungen, wie Thrombophlebitis, Phlebothrombose, Lungenembolie, Coronarthrombose
und cerebraler Thrombose.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Reinigung der rohen
Streptokinase durch Säulen-oder Chargenchromatographie an Cellulose-Ionenaustauscherharzen
der von PetersonundSob er (Journal of the American Chemical Society, 1956, Bd. 78,
S. 751) beschriebenen Art.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Reinigen von Streptokinase durch
Adsorption der Streptokinase und der Verunreinigungen aus einer rohen Streptokinaselösung
an einem Cellulose-Ionenaustauscher, Eluieren der Verunreinigungen von dem Ionenaustauscher
und anschließendes Eluieren und Gewinnen der gereinigten Streptokinase ist dadurch
gekennzeichnet,
daß man die rohe Streptokinaselösung mit einem Phosphatpuffergehalt
von 0,005 bis 0,015 Mol/l an dem Cellulose-Ionenaustauscher adsorbiert, die Verunreinigungen
mit 0,02- bis 0,06molaren und die reine Streptokinase mit 0,06- bis 0,15molaren
Phosphatpufferlösungen eluiert.
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Es hat sich gezeigt, daß die Fraktionen mit Phosphatpufferkonzentrationen
von 0,06 bis 0,08 MoVl die größten Mengen an Streptokinase enthalten.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden viele der Verunreinigungen
bei der niedrigen Ionenstärke adsorbiert und fest an das Harz gebunden, so daß die
erhaltene Streptokinase-Elutionslösung frei von solchen Substanzen ist. Andere Verunreinigungen
werden überhaupt nicht adsorbiert und finden sich im Durchlauf.
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Durch richtige Wahl der Phosphatpufferkonzentrationen und der geeigneten
Fraktion ist es möglich, in ausgezeichneter Ausbeute und in einfacher Weise eine
hochgereinigte Streptokinase zu erhalten, die hohe therapeutische Wirksamkeit besitzt
und von Nebenreaktionen hervorrufenden Verunreinigungen frei ist. Vorzugsweise verwendet
man als Phosphatpuffer Natrium- oder Kaliumphosphat.
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Vorzugsweise führt man das erfindungsgemäße Verfahren mit Phosphatlösungen
von steigender Stärke durch indem man durch die Adsorptionsmittelsäule zu Anfang
eine 0,01molare Phosphatpufferlösung leitet und allmählich eine 0,15molare Phosphatpufferlösung
zumischt. Auf diese Weise wird die Konzentration des Elutionspuffers fortschreitend
erhöht. Der bis zu einer Konzentration von 0,06 Molil durch die Säule gehende Teil
wird verworfen, und der Teil mit einer Konzentration über 0,06 und bis zu 0,15 Mobil
wird gesammelt. Statt in dieser Weise mit einer fortlaufend steigenden Pufferkonzentration
zu arbeiten, kann man auch das Harz nacheinander mit gesonderten Pufferlösungen
steigender Konzentration eluieren. So kann beispielsweise zuerst mit einer 0,02molaren
Lösung, dann mit einer 0,04 molaren Lösung und schließlich mit einer 0,06molaren
Pufferlösung eluiert werden, die alle verworfen werden. Die nächsthöheren Konzentrationen,
0,07-, 0,09- und 0,15molar, werden gesammelt, da sie die größten Mengen Streptokinase
enthalten.
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In der ersten 0,06molaren Elutionspufferlösung findet sich etwas
Streptokinase, und demzufolge kann ein zweites Waschen bei der gleichen Konzentration
durchgeführt und das Eluat gesammelt werden, da es eine merkliche Menge Streptokinase
enthält. Es ist auch möglich, die Verunreinigungen mit einer einzigen 0,06molaren
Pufferlösung zu eluieren und die Streptokinase mit einer einzigen, etwa 0,08molaren
Pufferlösung zu sammeln, doch ist dann die Ausbeute an Streptokinase geringer.
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In den folgenden Beispielen wird DEAE-Cellulose verwendet, doch kann
das erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen gleichwertigen Celluloseharzen,
wie TEAE-Cellulose oder ECTEOIiA-Cellulose, die von Peterson und Sober (a.a.O.)
beschrieben sind, durchgeführt werden. Ebenso können die verschiedensten bekannten
Phosphatpuffer verwendet werden.
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Beispiel 1 DEAE-Celluloseharz wird vorzugsweise vor der Verwendung,
wie folgt, behandelt. Man suspendiert 400 g Cellulose in 81Wasser, stellt den pH-Wert
mit
n-Salzsäure auf 2 ein und setzt Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von
5D/o zu. Das Gemisch wird durch ein Filtertuch filtriert und mit 81 5e/iger Natriumchloridlösung
gewaschen. Man suspendiert das Material in Wasser, stellt den pH-Wertmitn-Natronlauge
auf 10,5 ein, bringt die Natriumchloridkonzentration auf 5/4 filtriert und wäscht
mit 8 1 56/oiger Natriumchloridlösung. Das Celluloseharz wird erneut suspendiert
und der pE-Wert mit n-Salzsäure auf 3 eingestellt. Man bringt die Konzentration
wieder auf 5f°/e und wäscht das Harz mit 81 56/einer Natriumchloridlösung. Anschließend
wird das Celluloseharz mit 20 1 pyrogenfreiem Wasser gewaschen und filtriert.
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Das Celluloseharz wird in 0,01molarer Phosphatpufferlösung suspendiert
und mehrmals aufgerührt und absitzen gelassen, um feine Bestandteile zu entfernen.
Zur Herstellung von Säulen mit einer geeigneten Durchflußgeschwindigkeit ist es
wesentlich, daß die feinen Bestandteile zunächst entfernt werden.
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Die hier beschriebene Säule besitzt eine Durchflußgeschwindigkeit
von etwa 500 ml/Stunde. Es ist zweckmäßig, die Säule unmittelbar vor der Verwendung
aufzurühren, um ein Loslösen der Festsubstanz von der Glasoberfläche zu verhindern.
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Eine 30 cm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 52 mm wird
mit in 0,01molarer Phosphatpufferlösung suspendiertem Celluloseharz beschickt.
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Es wird genügend Cellulose zugegeben, so daß sich nach Absitzen eine
Säule von 6 bis 7 cm bildet.
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Die rohe Streptokinaselösung wird gegen eine Phosphatpufferlösung
der folgenden Zusammensetzung (0,005- bis 0,015 molar, vorzugsweise 0,01-molar)
dialysiert: Mononatriumphosphat NaE2PO4 H20 27,6 gel ..............
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Dinatriumphosphat Na2HPO4 28,4 gil . .. . . .. .. .... LösungB
| mit destilliertem Wasser auf 200 mol |
| 16 ml von A zu einer 0,1molaren Lösung (pH 7,5) |
| 84 mi von B ( verdünnt, die dann weiter auf |
| J 0,01 Mol/l verdünnt wird. |
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Nach Einstellung des Gleichgewichtes ist die Streptokinase zur Reinigung
fertig. Die Einstellung des Gleichgewichtes kann durch Messung des elektrischen
Widerstandes der Lösung überwacht werden.
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Als Streptokinase, die an das Harz adsorbiertwerden soll, kann eine
handelsübliche verwendet werden.
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Die in einer Konzentration von 106 Einheiten pro Milliliter oder einer
Gesamtmenge von 100 106 Einheiten in 100ml Wasser gelöste Streptokinase wird 16
bis 18 Stunden bei 30C gegen 21 0,01molare Phosphatpufferlösung vom pH 7,5 dialysiert.
Dieses 0,01molare Präparat wird in die Celluloseharzsäule gegossen, worauf die Verunreinigungen
aus der Säule mit 0,02- bis 0,06molaren Phosphatpufferlösungen eluiert werden. Hierauf
wird mit Hilfe einer 0,06- bis 0,07molaren Phosphatpufferlösung der Hauptteil der
Streptokinase in hoher Reinheit eluiert und erscheint in der durchlaufenden Flüssigkeit.
Die Fraktionen werden auf ihren Streptokinasegehalt und auf Protein geprüft, und
die Reinheit der einzelnen Fraktionen wird durch Berechnung der spezifischen Aktivität,
Einheiten Streptokinase pro yStickstoff, bestimmt.
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Die an Streptokinase reichen Fraktionen können lyophilisiert oder
zur Umwandlung von Plasminogen in Plasmin verwendet werden.
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Beispiel 2 Es wird eine Aufschlämmung von 1,5 g DEAE-Cellulose in
30ml 0,005molarer KaliumphosphatpufferIösung vom pH 7,0 hergestellt. Die Aufschlämmung
wird in eine chromatographische Säule (30 cm Höhe, 1 cm lichte Weite) gegossen,
die mit einer DichtungsscheibeundeinemKapillarsiphon ausgestattet ist.
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Man läßt das Harz absitzen und packt es durch Anwendung von Druckluft
(gefilterte Luft, etwas über Atmosphärendruck) zu 15 cm Höhe. Eine dünne Schicht
Watte wird über dem Harz in der Säule angebracht, um es vor mechanischer Störung
zu schützen. Die Packung der Säule verlangsamt die Durchflußgeschwindigkeit auf
10 bis 20 ml/Stunde.
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Rohe Streptokinase mit etwa 250 mg Protein wird in 15 ml Wasser gelöst
und die Lösung in der Kälte (2 bis 50 C) gegen 0,005molare Phosphatpufferlösung
dialysiert. Dann wird die Lösung in die Säule gegossen. Man läßt die rohe Streptokinaselösung
(unter dem gleichen geringen Druck, der zum Packen verwendet wurde) durch die Säule
hindurchsickern, bevor Pufferlösung von steigender Ionenstärke zugesetzt wird.
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Man führt der Säule Kaliumphosphatpufferlösung vom pH 7 mit kontinuierlich
steigender Konzentration zu. Der Konzentrationsanstieg wird dadurch erzielt, daß
man in den 250 ml fassenden Vorratsbehälter, aus dem die Säule mit Phosphatpufferlösung
gespeist wird und der anfänglich 0,005molare Pufferlösung enthält, ständig unter
Rühren 0,3molare Phosphatpufferlösung vom pH7,0 mit einer durch die Strömungsgeschwindigkeit
der Flüssigkeit durch die Säule gesteuerten Geschwindigkeit einfließen läßt, so
daß die Pufferkonzentration in dem Vorratsbehälter ständig ansteigt. Dabei kann
der die Pufferlösung durch die Säule treibende hydrostatische Druck durch
Heben oder
Senken des Vorratsbehälters verändert werden.
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Das Eluat wird in Mengen von je 10 ml in gesonderten Sammelgläsern
aufgefangen. Die Prüfung des Streptokinasegehaltes der Proben in den Sammelgläsern
zeigt, daß sich die Hauptmenge an reiner Streptokinase unter diesen Bedingungen
in dem 100. bis 150. Milliliter des Eluates befindet, in denen die Phsophatkonzentration
von 0,07 bis 0,12 Molil ansteigt. Bei niedrigeren Phosphatkonzentrationen wurden
Verunreinigungen der rohen Streptokinase eluiert.
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Beispiel 3 Das Verfahren des Beispiels 2 wird unter Verwendung von
Natriumphosphatpuffer an Stelle des Kaliumphosphates durchgeführt. Die Hauptmenge
der reinen Streptokinase befindet sich, wie im Beispiel 2, in dem 100. bis 150.
Milliliter des Eluates.