DE2440529B2 - Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta - Google Patents
Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher PlazentaInfo
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Description
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Hyaluronidase ist eine Gruppe von Enzymen, die Hyaluronsäure spaltet. Dieses Enzym kommt in der
Natur verbreitet vor, beispielsweise in Testikeln von Säugetieren, Leber und Milz, Schlangengiften und
bestimmten Bakterien. Es ist bekannt, daß dieses Enzym insbesondere in Testes von Säugetieren in verhältnismäßig großen Mengen vorliegt, und gewöhnlich werden zu
seiner Gewinnung Testes verwendet; vgl. Ulimanns Enzyklopädie der technischen Chemie, 3. Auflage, Bd. 7
(1956), S. 402-403.
Hyaluronidase wirkt als Ausbreitungsfaktor (»spreading factor«) in Haut und Bindegewebe. Hyaluronidase
wird in der Human- und Veterinärmedizin zur Erleichterung und Beschleunigung der subkutanen
Infusion auch größerer Flüssigkeitsmengen (Salz- oder Glucoselösungen, Plasma) verwendet Auch andere
Injektionen weiden erleichtert und oft in ihrer Wirksamkeit gesteigert, z. B. bei Anaesthetics Antibiotica, Antiseren und Röntgenkontrastmitteln. Auch die
Wirkung von Aerosolen zur Inhalation wird oft durch «> Hyaluronidasezusatz verstärkt.
Hyaluronidase Präparate aus den vorgenannten Quellen können bei ihrer Verabfolgung durch Injektion
erhebliche Nebenwirkungen infolge ihres Gehalts an heterogenen Proteinen hervorrufen. ρ
>
Über die Gegenwart von Hyaluronidase in menschlichem Plazentagewebe sowie die physiologische Bedeutung und die klinische Roiie des Enzyms ist bis jetzt noch
wenig veröffentlicht worden; VgL F. Scarpa, A. Panazzolo, M. Tanferna und P. F. Pavetto,
BoIL Soc. ItaL BioL Sper, Bd. 45 (1969), Seiten 217 bis
220, L P. Homenyuk, Pediatr. Akush. HinekoL, Bd. 34
(2) (1972), Seiten 44 bis 46, und N. P. Rudyuk,
Nekotorye, Vopr. PatoL Beremennosti i Rodov, Vinnitsk, Med. Inst Vinnitsa, 1960, Nr. 2, Seiten 251 bis
258. Bis jetzt sind keine Veröffentlichungen über die Isolierung oder Gewinnung von Hyaluronidase aus
menschlicher Plazenta bekanntgeworden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta zu
schaffen, das bei parenteraler Verabfolgung an Menschen keine störenden Nebenwirkungen infolge eines
Gehaltes von heterogenen Proteinen hervorruft, insbesondere besser verträglich ist, eine verstärkte Diffusion
im Gewebe und eine verringerte Schockgefahr besitzt Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß menschliche Plazenta Hyaluronidase in verhältnismäßig großen Mengen enthält und
leicht aus Plazentagewebe isoliert werden kann.
Die Erfindung betrifft somit den in den vorstehenden Patentansprüchen bezeichneten Gegenstand
In der Praxis wird das Hyaluronidase-Präparat folgendermaßen hergestellt:
Frische oder gefrorene menschliche Plazenta wird gegebenenfalls nach dem Waschen zur Entfernung von
Blut im Fleischwolf zerkleinert und mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5
homogenisiert Alle Arbeitsgänge werden vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 5° C durchgeführt.
Unlösliche Stoffe werden abfiltriert oder abgeschleudert Man erhält einen klaren Extrakt Durch die
Extraktion mit der wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 wird die Hyaluronidase
in maximaler Ausbeute gewonnen, und in diesem pH-Bereich ist das Enzym während der Extraktion
stabiler als in saurem Medium.
Als Base für die wäßrig-alkalische Lösung können Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Tris-(hydroxymethylj-aminomethan, verschiedene Salze der Borsäure
und vorzugsweise alkalische Puffersubstanzen verwendet werden, die die vorgenannten basisch reagierenden
Verbindungen enthalten.
Aus dem erhaltenen klaren Extrakt wird in an sich bekannter Weise durch Fraktionierung die Globulinfraktion gewonnen. Beispielsweise kann die Fraktionierung durch fraktionierendes Aussalzen mit Ammoniumsulfat fraktionierende Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, durch Zinkacetat oder durch Elektrophorese erreicht werden. Auf diese Weise wird eine
Trennung von Hemoprotein, wie Hemoglobin, und gefärbten Proteinen erreicht Das günstigste Fraktionierungsverfahren ist die fraktionierende Fällung mit
Ammoniumsulfat oder mit einem wasserlöslichen Alkohol. Besonders gute Ergebnisse werden mit der
fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat erhalten. Bei der fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat
wird der erhaltene Extrakt auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 eingestellt und mit kristallinem Ammoniumsulfat
oder einer konzentrierten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung unter kräftigem Rühren bis zu 40- bis
50prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird durch Zentrifugieren isoliert. Diese Fällung
bzw. Globulinfraktion enthält nahezu die Gesamtmenge an Hyaluronidase, die in der eingesetzten Plazenta
vorhanden war. Gleichzeitig sind große Mengen an Verunreinigungen, wie Hemoprctcir. im ursprünglichen
Plazentagewebe, wirksam abgetrennt worden. Ferner gelingt es auf diese Weise, das große Volumen des
ursprünglichen Extraktes auf ein kleines Volumen in Form einer Ausfällung zu reduzieren. Die fraktionierende
Ausfällung mit Ammoniumsulfat kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da das Ammoniumsulfat
auf das Enzym eine stabilisierende Wirkung und gleichzeitig eine bakteriostatische Wirkung entfaltet
Zur fraktionierenden Ausfällung mit einem wasserlöslichen Alkohol wird vorzugsweise Äthanol oder
Isopropanol verwendet Bei Verwendung von Äthanol beträgt die Endkonzentration etwa 20 bis 25 Prozent
und der pH-Wert 6,5 bis 8,5. Obwohl die Fraktionierung
mit Äthanol gewöhnlich ziemlich genaue Bedingungen hinsichtlich der Temperatur, des pH-Werts und der
Ionenstärke erfordert, unterscheidet sich das Verfahren hinsichtlich Ausbeute und Reinheit nicht wesentlich von
der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat
Die als Fällung erhaltene Globulinfraktion ist durch blutdrucksenkende Faktoren, blutähnliche Substanzen,
Hemoproteine und andere Substanzen noch erheblich verunreinigt Sie muß daher weiter gereinigt werden.
Zur Abtrennung dieser Verunreinigungen wird die Globulinfraktion mit einem Anionenaustauscher behandelt
an dem die Hyaluronidase selektiv adsorbiert wird. Zu diesem Zweck wird die erhaltene Fällung in einer
geringen Menge Wasser gelöst und das in der Lösung vorhandene Ammoniumsulfat wird durch Dialyse gegen
Wasser abgetrennt Sodann wird das Dialysat mit einem Anionenaustauscher zusammengebracht. Die selektive
Adsorption der Hyaluronidase wird so durchgeführt, daß man das Dialysat mit dem Anionenaustauscher bei
einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 in einer Pufferlösung verminderter Molarität von etwa 0,005- bis
0,01 molar zusammenbringt. Das Dialysat wird also mit
einem etwa 0,005- bis 0,01 molarem Puffer, wie Phosphatpuffer oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer,
bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 äquilibriert und auf eine mit einem Anionenaustauscher
gefüllte Säule gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Hyaluronidase im
Dialysat wird auf diese Weise selektiv am Anionenaustauscher adsorbiert.
Als Anionenaustauscher kann in dieser Stufe beispielsweise ein Polysaccharidgel mit basischen Gruppen,
wie Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-Sephadex) und Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose), ein
Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit basischen Gruppen, wie Dowex 1, d.h. ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat
mit quartären Ammoniumgruppen, oder ein Phenol-Formaldehyd-Kondensat mit basischen
Gruppen, wie Amberlite XE, verwendet werden.
Danach wird der Anionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die zum Äquilibrieren
verwendet wurde, um die nicht adsorbierten Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wird die Hyarulonidase
mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die jedoch eine erhöhte Molarität besitzt beispielsweise 0,02- bis
O.lOmolar, bei gleichem oder niedrigerem pH-Wert,
oder mit einer Pufferlösung mit niedrigerem pH-Wert, beispielsweise 6,5 bis 5,0.
Die eluierte Hyaluronidase-Fraktion wird sodann der Gelfiltration an einem stark vernetzten Polysaccharidgel-Molekularsieb,
wie Sephadex G-150 oder G-200 (ein vernetztes Dextran), oder Sepharose 6-B (Agarosegel)
oder einem Polyacrylamidgel-Molekularsieb, wie Biogel P-IOO oder P-150, oder einem Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Copolymensati
unterworfen. Das Filtrat kann lyophilisiert werden. Man erhält ein Hyaluronidase-Präparat
in Form eines weißen Pulvers.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird ein Hyaluronidase-Präparat mit befriedigenden Eigenschäften
erhalten. Ein Präparat mit höherer Aktivität kann dadurch hergestellt werden, daß man die aus dem
Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst entweder mit einem Kationenaustauscher, der mit einer etwa 0,01-bis
0,05molaren Pufferlösung bei einem pH-Wert von
ίο etwa 5 bis 7 äquilibriert worden ist oder mit einem
Anionenaustauscher, der der gleiche sein kann, wie er in dem vorstehend geschilderten Verfahren verwendet
wurde und der mit einer etwa 0,1- bis 0,2molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa
7,0 äquilibriert worden ist, behandelt, um zunächst unerwünschte Verunreinigungen selektiv zu adsorbieren
und dadurch abzutrennen.
Als Kationenaustauscher kann beispielsweise ein Polysaccharidgel, wie Carboxymethylcellulose (CM-
Cellulose), CarboxymethyJdextran (CM-Sephadex), oder ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat wie
Amberlite lRC-50, verwendet werden. Die selektive Adsorption wird in an sich bekannter Weise durchgeführt.
In beiden Fällen wird die Pufferlösung, die durch den jeweiligen Ionenaustauscher geleitet wird, und die
weiter gereinigte Hyaluronidase enthält, mit dem Anionenaustauscher unter den vorgenannten Bedingungen
zusammengebracht Es wird eine besser gereinigte Hyaluronidase-Fraktion erhalten, die anschließend der
Gelfiltration unterworfen wird.
Die in der Globulinfraktion enthaltenen Verunreinigungen
können auch mittels weniger vernetzter Molekularsiebe und unspezifischer Adsorptionsmittel
abgetrennt werden, um die wesentlichen Stufen zu erleichtern, d.h. das Zusammenbringen mit dem
Anionenaustauscher und die Gelfiltration. Zu diesem Zweck wird die Globulinfraktion durch ein Molekularsieb,
wie Sepnadex G-100 oder G-150, geleitet, und in
drei Fraktionen fraktioniert, d. h. eine Fraktion, die Substanzen mit höherem Molekulargewicht enthält, die
Produktfraktion, die Substanzen mit einem Molekulargewicht von 50 000 bis 100 000 enthält, sowie eine
Substanzen mit niedrigerem Molekulargewicht enthaltende Fraktion. Die Produktfraktion kann mit einem
unspezifischen Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, Kaolin oder Hydroxylapatit, zusammengebracht werden.
Die auf diese Weise erhaltene partiell gereinigte Fraktion kann sodann mit dem Kationenaustauscher
>o oder Anionenaustauscher nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren und anschließend nach dem
eingangs beschriebenen Verfahren mit dem Anionenaustauscher behandelt und der Gelfiltration unterworfen
werden.
Überraschenderweise zeigt das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung keine Nebenwirkungen, wenn es
dem Menschen injiziert wird.
Das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung hat folgende Eigenschaften:
> >> · Das Molekulargewicht (bestimmt durch Gelfiltration)
beträgt etwa 70 000, der isoelektrische Punkt (bestimmt durch Elektrofocussierung) liegt bei 5,2 und das
pH-Optimum bei 3,6 bis 4,0, bestimmt mit Hyaluronsäure aus menschlicher Nabelschnur als Substrat. Das
ι·. Enzym ist sehr stabil, wenn es unterhalb 30°C in
wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 7 aufbewahrt wird.
Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Hyalu-
Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Hyalu-
ronidase aus menschlicher Plazenta wurde ein Gelfiltrationsverfahren
entsprechend Biochem. J, Bd. 91 (1964), S. 222—233 angewendet Als Gel diente Sephadex
G-200. Die Säulenabmessungen betrugen 15 χ 260 mm. Als Lösungsmittel wurde 0,1 η-Kochsalzlösung verwendet
Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 0,23 ml/Min.
Folgende Substanzen bekannten Molekulargewichts wurden als Eichsubstanzen verwendet:
Rinder-Cytochrom C
Rinder-Hämoglobin
Menschliches Transf errin
Menschliches y-Globulin
Rinder-Hämoglobin
Menschliches Transf errin
Menschliches y-Globulin
(MG 12 800)
(MG 65 000)
(MG 90 000)
(MG 160 000)
(MG 65 000)
(MG 90 000)
(MG 160 000)
In der vorgenannten Literaturstelle finden sich auch Ausführungen über die Genauigkeit von derartigen
Molekulargewichtsbestimmungen (vgL insbesondere S. 231, rechte Spalte):
Hyaluronidase aus Stiertestikel hat dagegen ein Molekulargewicht von 11 000, einen isoelektrischen
Punkt von 5,7 und ein pH-Optimum von 4,0 bis 5,5; vgl. Biochim. Biophys. Acta, Bd. 11 (1953), S. 524 bis 529 und
J. Biol. Chem., Bd. 238 (1963), S. 3522 bis 3527.
Aus den vorstehend angegebenen Werten ist ersichtlich, daß sich das Hyaluronidase-Präparat der
Erfindung aus menschlicher Plazenta von Hyaluronidase aus Stiertestikel unterscheidet.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Bestimmung der Hyaluronidase-Aktivität wird nach einer
modifizierten Methode von N. N. A r ο η s ο η, Jr. und E.
A. Padidson.J. Biol.Chem., Bd. 242 (3)(1967), Seiten
437 bis 440, und V. Patel, A. L. Tappel und J. S. O'Brien, Biochem. Med. Bd. 3 (1972), Seilen 447 bis
457, durchgeführt. In einem Reagenzglas werden 0,04molare Acetatpuffer (pH 3,6), 0,15molare Kochsalzlösung,
150 γ Natriumhyaluronat als Substrat und die
Enzymlösung miteinander vermischt. Das Gesamtvolumen beträgt 0,40 ml. Das Reaktionsgemisch wird 60
Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird das Reaktionsgemisch zum Abstoppen der enzymatischen
Reaktion mit 50 μΐ SOprozentiger Trichloressigsäurelösung
versetzt. Ein anderes Reagenzglas wird zur Kontrolle ohne Zusatz von Enzym inkubiert und nach
der Inkubierung unter den gleichen Bedingungen mit Trichloressigsäure und dem Enzymextrakt versetzt. In
Abwesenheit des Enzyms wird kein Abbau der Hyaluronsäure beobachtet. Das mit Trichloressigsäure
angesäuerte Reaktionsgemisch wird mit 50 μΐ einer Alkalilösung entsprechender Konzentration neutralisiert.
Gev:'öhnlich wird 3,4 η-Natronlauge verwendet. Die Menge von N-Acetylhexosamin-Endgruppen, die
aus dem Substrat durch die enzymatische Reaktion abgespalten wurde, wird nach der Methode von
Reissig.Strominger und L e 1 ο i r, J. Biol. Chem.,
Bd. 217 (1955), Seiten 959 bis 966, unter Verwendung von N-Acetylglucosamin als Standard besiimmt. Eine
Aktivitätseinheit von Hyaluronidase ist diejenige Enzymmenge, die 1 Mol N-Acetylglucosamin aus
Hyaluronsäure bei 37° C/min freisetzt.
Gefrorene menschliche Plazenta, die in feuchtem Zustand 2676 g wiegt, wird in einem Fleischwolf
zerkleinert und dreimal in jeweils 10 Liter kalter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und filtriert,
um anhaftendes Blut sorgfältig abzutrennen. Es werden 2071 g gewaschenes Plazentagewebe erhalten,
das mit einem Homogenisator mit dem 2,5fachen Volumen gekühlten 0,02molaren Tris-HCI-Puffer
(pH 9,0) bei der Höchstgeschwindigkeit des Schneidmessers 30 Sekunden homogenisiert wird Es werden
5450 ml Homogenat erhalten. Das Homogenal wird 2 Stunden stehengelassen und sodann 15 Minuten bei
9600 g zentrifugiert Es werden 3950 ml eines klaren Überstands erhalten. Der Überstand wird mit 5 n-Salzsäure
unter kräftigem Rühren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt Sodann werden 1290 g kristallines
Natriumsulfat bei einer Temperatur von 0 bis 5° C eingetragen. Man erhält eine etwa 50prozentige
gesättigte Lösung. Der pH-Weit der Lösung wird erneut überprüft und mit 1 η-Natronlauge auf 7,0
eingestellt Hierauf wird die Lösung 15 bis 18 Stunden
bei 0 bis 50C stehengelassen. Die entstandene Fällung
wird 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert und in 200 ml
Wasser gelöst Die Lösung wird gegen Wasser dialysiert, bis die Lösung frei von Sulfationen ist Das
Dialysat wird mit einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung (pH 8,2) äquilibriert und auf eine mit DEAE-Cellulose
gefüllte Säule mit den Abmessungen 43 χ 50 cm gegeben. Die DEAE-Cellulose wurde vorher mit der
gleichen Pufferlösung äquilibriert Sodann wird die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, um nicht
absorbierbare Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wird das Enzym mit 0,05molarer Phosphatpufferlösung
(pH 7,5) eluiert. Es werden 725 ml Eluat erhalten, das durcli Dialyse gegen Wasser entsalzt wird Die
spezifische Aktivität des Enzyms beträgt 43 Millieinheiten
pro mg Protein. Der Reinigungsgrad auf der Stufe der Ammoniumsulfat-Fraktionierung beträgt 1,8 und
nach der Chromatographie an DEAE-Cellulose 10.
Die vom Puffersalz befreite Hyaluronidase-Fraktion wird gefriergetrocknet und in 0,01 molarem Tris-Puffer
(pH 7,0) gelöst. Diese Lösung wird der aufsteigenden Gelfiltration an Sephadex G-200 unterworfen. Das
Eluat wird in 2-mI-Fraktionen aufgefangen, die Hyaluronidase-Funktionen
werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat
gefriergetrocknet. Es werden 20,8 mg stark gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 17,2
Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Verwendung von Sephadex G-200 beträgt 3,8.
Das erhaltene Hyaluronidase-Präparat hat ein Molekulargewicht von etwa 69 0O0, bestimmt durch Gelfiltration,
und einen isoelektrischen Punkt von 5,19. Das Präparat ist bei 30° C in wäßriger Lösung bei einem
pH-Wert von 6,5 für mindestens 24 Stunden stabil. Bei 30minütiger Inkubation bei 60°C und beim gleichen
pH-Wert gehen 90 Prozent der ursprünglichen Aktivität verloren. Andererseits zeigt das Präparat keinen
Aktivitätsverlust bei mindestens 5maligem wiederholtem Gefrieren und Auftauen. Ferner ist das Präparat
stabil bei 0°C in wäßriger Lösung vom pH-Wert 4 bis 7,6.
1,5 kg gemäß Beispiel 1 hergestelltes gewaschenes Plazentagewebe wird zusammen mit dem 2,5fachen
Volumen Wasser in einem hochtourigen Schneidmischer homogenisiert. Das erhaltene Homogenisat wird
mit 2 η-Natronlauge unter kräftigem Rühren auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und 1 Stunde stehengelassen.
Sodann wird das Gemisch unter vermindertem Druck durch ein Filtertuch filtriert und der pH-Wert des
Filtrats mit 2 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wird mit kristallinem Ammoniumsulfat
bis zur 45prozentigen Sättigung versetzt und die entstandene Fällung nach mehrstündigem Stehen 20
Minuten bei 6800 g abzentrifugiert. Die Fällung wird in
wenig Wasser gelöst und die Lösung zur Abtrennung von Ammoniumsulfat gegen Wasser dialysiert. Das
Dialysat wird mit 0,01 molarer Phosphatpufferlösung (pH 6,0) äquilibriert und anschließend auf eine mit
CM-Sephadex (C-50) gefüllte Säule mit den Abmessungen 3 χ 80 cm gegeben, der vorher mit der gleichen
Pufferlösung äquilibriert wurde. Sodann wird mit dieser Pufferlösung eluiert. Das Eluat wird aufgefangen. Ein
großer Teil der nichtaktiven globulinähnlichen Proteine bleibt an der CM-Sephadex-Kolonne adsorbiert. Im
Eluat liegt partiell gereinigte Hyaluronidase vor. Die nichtadsorbierte Fraktion wird mit 0,01 molarem Tris-Puffer
(pH 8,0) äquilibriert und auf einem mit DEAE-Sephadex (A-50) gefüllte Säule mit den Abmessungen
2 χ 15 cm gegeber., die vorher mit dem gleichen Puffer
äquilibriert worden ist. Es wird mit 0,05molarer Tris-Pufferlösung (pH 7,0) eluiert und das Eluat
gefriergetrocknet. Es werden 30 mg partiell gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 11,2
Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Veiwendung von CM-Sephadex beträgt 3,5 und
von DEAE-Sephadex 8,5.
30 mg des Enzympräparats werden in 2 ml einer 0,15molaren Phosphatpufferlösung (pH 6,5) gelöst und
der ansteigenden Gelfiltration an Sephadex G-200 unterworfen. Die abfließende Lösung wird in 2-ml-Portionen
aufgefangen. Die Hyaluronidase-Fraktionen
ίο (enzymatisch festgestellt) werden vereinigt und durch
Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat gefriergetrocknet. Es werden 15,7 g hochgereinigte
Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 19,8 Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Die
Hyaluronidase hat ein Molekulargewicht von 72 000 und einen isoeiektrischen Punkt von 5,2 i. Das Präparat
hat die gleiche Stabilität wie das gemäß Beispiel 1 hergestellte Präparat.
Claims (4)
- Patentansprüche:!. Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2, einem pH-Optimum von 3,6 bis 4,0 und einer Stabilität von mindestens 24 Stunden in wäßriger Lösung bei Temperaturen unterhalb 300C und einem pH-Wert von 6 bis 7, hergestellt durch Extrahieren von menschlichem Plazentagewebe mit einer wäßrig-alkaiischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 1OA Isolieren der Globulinfraktion aus dem erhaltenen Extrakt, Adsorption der Globulinfraktion an einem Anionenaustauscher, der mit 0,005- bis O.Olmolarer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 äquilibriert worden ist, Eluieren der am Anionenaustauscher adsorbierten Hyaluronidase mit einer Pufferlösung erhöhter Molarität und/oder erniedrigtem pH-Wert und Gelfiltration der erhaltenen Hyaluronidase-Fraktion.
- 2. Hyaluronidase-Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst entweder mit einem Kationenaustauscher, der mit einer 0,01- bis 0,05molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bis 7 äquilibriert worden ist, oder mit einem Anionenaustauscher behandelt worden ist, der mit einer 0,1- bis 0,2molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 äquilibriert worden ist.
- 3. Hyaluronidase-Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.
- 4. Arzneimittel mit spreading factor-Wirkung in Haut und Bindegewebe zur parenteralen Verabreichung, enthaltend das Hyaluronidase-Präparat nach Anspruch 1 bis 3.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9706673A JPS5413510B2 (de) | 1973-08-28 | 1973-08-28 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2440529A1 DE2440529A1 (de) | 1975-04-03 |
DE2440529B2 true DE2440529B2 (de) | 1979-01-25 |
DE2440529C3 DE2440529C3 (de) | 1979-09-13 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2440529A Expired DE2440529C3 (de) | 1973-08-28 | 1974-08-23 | Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta |
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---|---|
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DE (1) | DE2440529C3 (de) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4152212A (en) * | 1976-02-25 | 1979-05-01 | Biorex Laboratories Limited | Process for the purification of glucuronoglycosaminoglycan hyaluronate lyase |
JPS6033474B2 (ja) * | 1978-05-11 | 1985-08-02 | 藤沢薬品工業株式会社 | 新規なヒアルロニダ−ゼbmp−8231およびその製造法 |
SU906485A1 (ru) * | 1978-11-22 | 1982-02-23 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Мясной Промышленности | Способ получени вещества дл ускорени созревани м сопродуктов |
DE2915309A1 (de) * | 1979-04-14 | 1980-10-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von anti-hyaluronidase und hierfuer verwendbares mittel |
US4729956A (en) * | 1986-05-01 | 1988-03-08 | Phillips Petroleum Company | Stabilized alcohol oxidase compositions and method for producing same |
JPH01500997A (ja) * | 1986-09-30 | 1989-04-06 | ビオヘミー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ヒアルロニダーゼの使用 |
US5102783A (en) * | 1990-01-12 | 1992-04-07 | Vetrepharm, Inc. | Composition and method for culturing and freezing cells and tissues |
GB2293824B (en) * | 1994-10-04 | 1998-11-18 | Ashok Meluttukez Krishnapillai | Extraction and purification of hyaluronidase from crustacean waste |
US5747027A (en) * | 1995-04-07 | 1998-05-05 | The Regents Of The University Of California | BH55 hyaluronidase |
US6610292B2 (en) | 1995-11-22 | 2003-08-26 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders |
US5866120A (en) | 1995-11-22 | 1999-02-02 | Advanced Corneal Systems, Inc. | Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase |
US6103525A (en) * | 1996-10-17 | 2000-08-15 | The Regents Of The University Of California | Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that bind to human plasma hyaluronidase |
US6193963B1 (en) | 1996-10-17 | 2001-02-27 | The Regents Of The University Of California | Method of treating tumor-bearing patients with human plasma hyaluronidase |
BR9908692A (pt) * | 1998-03-09 | 2001-12-04 | Ista Pharmaceuticals Inc | Uso de agentes de enrijecimento corneal emortocerotologia enzimática |
MXPA03011987A (es) | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Osio Sancho Alberto | Metodo para el tratamiento de la presbicia induciendo cambios en el poder y fisiologia corneal. |
AU2013299415B2 (en) | 2012-08-10 | 2017-07-13 | Osio Corporation d/b/a Yolia Health | Contact lens use in the treatment of an ophthalmologic condition |
EP3058084A4 (de) | 2013-10-16 | 2017-07-05 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Sialylierte glycoproteine |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2808362A (en) * | 1952-05-02 | 1957-10-01 | Armour & Co | Preparation of hyaluronidase |
-
1973
- 1973-08-28 JP JP9706673A patent/JPS5413510B2/ja not_active Expired
-
1974
- 1974-08-23 DE DE2440529A patent/DE2440529C3/de not_active Expired
- 1974-08-27 US US05/500,939 patent/US3945889A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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US3945889A (en) | 1976-03-23 |
DE2440529C3 (de) | 1979-09-13 |
DE2440529A1 (de) | 1975-04-03 |
JPS5048184A (de) | 1975-04-30 |
JPS5413510B2 (de) | 1979-05-31 |
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