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Verfahren zur Herstellung von Streptokinase
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Streptokinasepuffer mit einer molaren Konzentration von 0, 02 bis 0,06 verwendet werden. Zur Elution der Streptoki- nase sollte ein Phosphatpuffer mit einer molaren Konzentration im Bereich von 0,06 bis 0, 15 verwendet werden. Es hat sich gezeigt, dass Fraktionen mit einer molaren Konzentration von 0,06 bis 0,08 die grössten
Mengen an Streptokinase enthalten. Das Verfahren wird durchweg bei einem PH von etwa 7,5 durchge- führt.
Ein zur Durchführung der obigen Behandlung des Harzes mit Phosphatpuffern anwachsender Stärke be- stens geeignetes Verfahren besteht darin, durch die Säule einen Phosphatpuffer zu leiten, der eine anfäng- liche molare Konzentration von 0, 01 besitzt und dem allmählich ein Phosphatpuffer mit einer molaren
Konzentration von 0, 15 oder darüber zugemischt wird. Auf diese Weise wird die molare Konzentration des Elutionspuffers kontinuierlich erhöht. Der durch die Säule gehende Teil bis zu einer molaren Konzen- tration von 0,06 wird verworfen und der Teil mit einer molaren Konzentration über 0,06 und bis zu 0, 15 wird gesammelt. Statt der Anwendung einer derartigen kontinuierlich ansteigenden molaren Konzentra- tion ist es auch möglich, das Harz aufeinanderfolgend mit getrennten Puffern ansteigender molarer Stärke zu waschen.
So kann beispielsweise zuerst mit einer 0,02 m-Lösung, dann mit einer 0, 04 m-Lösung und anschliessend mit einem 0,06 m-Puffer gewaschen werden, die alle verworfen werden. Die nächsten höhermolaren Konzentrationen, 0, 07, 0, 09 und 0, 15 m, werden gesammelt, da sie die grössten Mengen Streptokinase enthalten.
In dem ersten 0, 06 m-Elutionspuffer findet sich etwas Streptokinase und demzufolge kann ein zweites Waschen bei der gleichen molaren Konzentration durchgeführt und das Eluat gesammelt werden, da es eine merkliche Menge Streptokinase enthält. Es ist auch möglich, die Verunreinigungen mit einem einzigen Puffer von 0, 06 m-Konzentration zu entfernen und die Streptokinase mit einem einzigen Puffer von etwa 0,08 m-Konzentration zu sammeln, doch ist dann die Ausbeute an Streptokinase relativ geringer.
In den volgenden Beispielen wird Diäthylaminoäthylgruppen enthaltende Cellulose (DEAE) verwendet, doch kann das erfindungsgemässe Verfahren auch mit andern äquivalenten Celluloseharzen, wie beispielsweise TEAE, ECTEOLA Cellulose u. dgl., die in der oben genannten Literaturstelle beschrieben sind, durchgeführt werden. Es können die verschiedensten bekannten Phosphatpuffer verwendet werden und sie können aus den Alkali-und Erdalkalimono-,-di-oder-triphosphaten ausgewählt sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel l : Das Beispiel erläutert die Reinigung von roher Streptokinase durch Chromatographie an gemäss der oben genannten Literaturstelle hergestelltem DEAE-Celluloseharz.
Vorzugsweise wird das Harz vor der Verwendung wie folgt behandelt : Man suspendiert 400 g DEAE in 81 Wasser, stellt den pH-Wert mit n-Salzsäure auf 2 ein und setzt Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 5% zu. Das Gemisch wird über einem Filtertuch filtriert und mit 8 l 50/0iger Natriumchlorid- lösung gewaschen. Man suspendiert das Material in Wasser, stellt den pli-Wert mit n-Natronlauge auf 10,5 ein, bringt die Natriumchloridkonzentration auf 5%, filtriert und wäscht mit 8 l 5% niger Natriumchloridlösung. Das DEAE-Celluloseharz wird erneut suspendiert und der pH-Wert mit n-Salzsäure auf 3 eingestellt.
Man bringt die Konzentration wieder auf zo und wäscht das Harz mit 8 l 5 0iger Natriumchloridlösung. Anschliessend wird das DEAE-Celluloseharz mit 20 1 pyrogenfreiem Wasser gewaschen und filtriert.
Das DEAE-Celluloseharz wird in dem 0, 01 m-Phosphatpuffer suspendiert, mehrere Male aufgerührt und absitzen gelassen, um feine Bestandteile zu entfernen. Zur Herstellung von Säulen mit einer geeigneten Durchflussgeschwindigkeit ist es wesentlich, dass die feinen Bestandteile entfernt sind. Die hier beschriebene Säule besitzt eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa 500 ml/h. Es ist sehr zweckmässig, die Säule unmittelbar vor der Verwendung aufzurühren, um ein Loslösen der Festsubstanz von der Glasoberfläche zu verhindern.
Eine 30 cm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 52 mm wird mit in 0,01 m-Phosphatpuffer suspendiertem DEAE-Celluloseharz beschickt. Es wird genügend DEAE zugegeben, so dass sich nach Absitzen eine Säule von 6 bis 7 cm bildet.
Die roheStreptokinaselösung wird gegen einenPhosphatpuffer der folgenden Zusammensetzung (0, 005 bis 0, 015 m, vorzugsweise 0, 01 m) dialysiert :
Einbasisches Natriumphosphat NaHJ'C. HO
27,6 g/l Lösung A
Zweibasisches Natriumphosphat Na2HPO4
28,4 g/l Lösung B
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lung des Gleichgewichts kann durch Messung des elektrischen Widerstands der Lösung geprüft werden.
Als Streptokinase, die an das Harz adsorbiert werden soll, kann eine handelsübliche verwendet wer- den. Die in einer Konzentration von 106 Einheiten/ml oder einer Gesamtmenge von 100 x 106 Einheiten in 100 ml Wasser gelöste Streptokinase wird 16 -18 h bei 3 C gegen 21 0, 01 m-Phosphatpuffer, PH 7, 5, dialysiert. Bei der Molarität der ausfliessenden Flüssigkeit von 0, 06 und 0, 07 wird der Hauptteil von
Streptokinase hoher Reinheit eluiert und erscheint in der ausfliessenden Flüssigkeit. Die Fraktionen werden auf ihren Streptokinasegehalt und auf Protein geprüft und die Reinheit der einzelnen Fraktionen wird durch
Berechnung der spezifischen Aktivität, Einheiten Streptokinase/y Stickstoff, bestimmt.
Die an Strepto- kinase reichenFraktionen können lyophilisiert oder zur Umwandlung von Plasminogen in Plasmin verwen- det werden.
Beispiel 2 : Eine DEAE-Säule wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und das Harz mit 0, 08-0, 12 m-, vorzugsweise 0, 1 m-Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht. Die rohe Streptokinase wird gegen 0, 08-0, 12 m-, vorzugsweise 0, 1 m-, Phosphatpuffer dialysiert. Nach Einstellung des Gleichgewichts wird die Streptokinase auf die Säule gebracht. Die meisten Verunreinigungen werden an der Säule zurückgehalten, während die Streptokinaselösung in der abfliessenden Flüssigkeit erscheint. Die Säule wird mit 0, 08-0, 12 m-, vorzugsweise 0, 1 m-, Phosphatpuffer gewaschen. Die Säule wird mit diesem Puffer erneut gewaschen und der Hauptteil der Streptokinase in der austretenden Flüssigkeit gewonnen. Sie kann dann, wie in Beispiel 1 angegeben, verwendet werden.
Beispiel 3 : Herstellung der Säule : Es wurde eine Aufschlämmung von 1, 5 g DEAE in 30 ml 0, 005 m-Kaliumphosphatpuffer vom pH 7, 0 hergestellt. Die Aufschlämmung wurde in eine chromatographische Säule (30 cm Höhe, 1 cm Innendurchmesser) gegossen, die mit einer Dichtungsscheibe und einem Kapillarsiphon ausgestattet war. Man liess das Harz durch Schwerkraft absitzen und packte es durch Anwendung von Druckluft (gefilterte Luft schwach über Atmosphärendruck) zu etwa 15 cm Höhe. Eine dünne Schicht Baumwolle wurde über dem Harz in der Säule angebracht, um es vor mechanischer Störung zu schützen. Die Packung der Säule verlangsamt die Durchflussgeschwindigkeit durch die Säule auf 10-20 ml/h.
Aufbringen der Probe auf die Säule : Rohe Streptokinase mit etwa 250 mg Protein wurde in etwa 15 ml Wasser gelöst und die Lösung in der Kälte (2-50C) gegen 0, 005 m-Phosphatpuffer dialysiert. Dann wurde die Lösung in die Säule gebracht. Man liess die rohe Streptokinaselösung (unter dem gleichen geringen Druck, der zum Packen verwendet wurde) durch die Säule durchsickern, bevor Puffer ansteigender Ionenstärke zugesetzt wurde.
Elution der Säule : Man brachte in die Säule Kaliumphosphatpuffer vom pH 7 mit kontinuierlich an- wachsender Konzentration ein. Der Konzentrationsanstieg wurde dadurch erzielt, dass man 0, 3 m-Kaliumphosphatpuffer (pH 7, 0) in einen 250 ml Behälter, der 0, 005 m-Puffer enthielt, fliessen liess, in welchem mittels eines magnetischen Rührers gemischt wurde. Die Flüssigkeit aus dem Mischbehälter floss durch die Säule, wobei die Geschwindigkeit des Flusses durch die Säule die Geschwindigkeit des Flusses der 0, 3 m-Lösung in den 250 ml Mischbehälter steuerte. Der den Puffer durch die Säule treibende hydrostatische Druck konnte durch Heben oder Senken des Pufferbehälters verändert werden.
Das Eluat wurde in Mengen von jeweils 10 ml in gesonderten Sammelgläsem aufgefangen. Die Prüfung des Streptokinasegehaits der Proben in den Sammelgläsem zeigte, dass sich die Hauptmenge an reiner Streptokinase unter diesen Bedingungen in dem 100. 50. ml des Eluats befand, in welchen die Phosphatkonzentration von 0,07 bis 0, 12 m schwankte. Bei niedrigeren Phosphatkonzentrationen wurden Verunreinigungen der rohen Streptokinase eluiert.
Beispiel 4 : Das Verfahren von Beispiel 3 wurde unter Verwendung von Natriumphosphatpuffer an Stelle des Kaliumphosphats durchgeführt. Die Hauptmenge reiner Streptokinase befand sich, wie in Beispiel 3, in dem 100.-150. ml des Eluats.