DE3881895T2

DE3881895T2 - Verfahren zur Reinigung von Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren.

Info

Publication number: DE3881895T2
Application number: DE89901619T
Authority: DE
Inventors: Peter Feldman
Original assignee: Central Blood Laboratories Authority
Current assignee: Central Blood Laboratories Authority
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: NO902757D0; NO902757L; WO1989005650A2; DK153490D0; EP0391974A1; DK153490A; EP0391974B1; JPH0664B2; GB8729822D0; NO178882B; AU627446B2; WO1989005650A3; NO178882C; ATE90567T1; JPH03501085A; AU3032989A; DK175514B1; DE3881895D1

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Reinigung oder Anreicherung von Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren in derartige Faktoren enthaltenden Fraktionen.
Plasma, das aus Blut menschlichen oder tierischen Ursprungs erhalten wurde, enthält eine Vielzahl wertvoller, physiologisch aktiver Substanzen, insbesondere die verschiedenen Blutgerinnungsfaktoren, von denen einige in der Medizin für die Behandlung von Patienten, die einen Mangel an einer oder mehreren derartiger Substanzen aufweisen, verwendet werden. Die Blutgerinnungsfaktoren, d.h. die Glieder der sog. Blutgerinnungskaskade, umfassen eine Gruppe inaktiver und aktiver, proteolytischer Enzyme und modifizierter Proteine, die auf folgende Weise miteinander in Beziehung stehen: Faktor Gewebefaktor Prothrombin Thrombin Fibrinogen Fibrin
Der Index "a" bedeutet, daß das Enzym in der aktivierten Form vorliegt.
Weitere signifikante Plasmaproteine, die als in die allgemeine Kategorie der Blutgerinnungsfaktoren fallend angesehen werden können, umfassen Protein C und Protein S. Protein C ist ein inaktives Zymogen des proteolytischen Enzyms Aktiviertes Protein C (APC,PCa). Im Gegensatz zu den vorstehend genannten Gerinnungsfaktoren besitzt APC eine antikoagulierende Wirkung, die über die Proteolyse von Faktor V und Faktor VIII abläuft, die so inaktiviert werden. Die Aktivierung von Protein C scheint über ein Feedback-Verfahren Thrombin und ein endothel gebundenes Protein, Thrombomodulin, zu umfassen, die beide während des Koagulierungsverfahrens wirken. Die Aktivität von APC wird dann durch die Gegenwart von Protein S erhöht, das als Cofaktor zu wirken scheint.
Eine Anzahl der vorstehenden Faktoren, nämlich II, VII, IX, X und auch Protein C und Protein S, erwies sich als Vitamin- K-abhängig. Diese Faktoren tragen sowohl in der aktiven als auch inaktiven Form (neben aktiviertem Faktor II) endständige γ-Carboxyglutaminsäure-Reste, die durch ein enzymatisches Verfahren eingeführt werden, das über das Vitamin K abläuft. Zusätzlich zeigte sich, daß Protein C, Protein S und die Faktoren X und IX, jedoch nicht Prothrombin (Faktor II), einen modifizierten Asparaginsäure-Rest, nämlich einen β-Hydroxyasparaginsäure-Rest, besitzen.
Somit stellen die Vitamin K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren eine Gruppe verwandter, saurer Proteine mit sehr ähnlichen physikochemischen Eigenschaften dar. Die saure Natur dieser Substanzen ermöglichte es früher, daß diese als eine Gruppe isoliert wurden, obgleich ihre strukturelle und chemische Ähnlichkeit es schwierig machte, die einzelnen Proteine unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie einer Anionenaustauschchromatographie, zu trennen.
Außer Faktor VIII, der nicht Bestandteil des Prothrombinkomplexes ist, ist der am häufigsten verabreichte Blutgerinnungsfaktor Faktor IX. Traditionell wurde Faktor IX als Konzentrat all der Faktoren des Prothrombinkomplexes II, VII, IX und X zur Verfügung gestellt, obgleich Faktor VII zuweilen getrennt von IX, II und X zur Verfügung gestellt wird.
Nach Infusionen von derartigen Faktor IX-Konzentraten wurden einige wenige Fälle einer venösen Thrombose und einer ausgestreuten intravaskulären Koagulation (DIC) beobachtet. Diese unerwünschten Reaktionen könnten einem hyperkoagulierbaren Zustand zugeschrieben werden, der verstärkt wird durch hohe Gehalte an unnötigen, mit dem Faktor IX infundierten Gerinnungsfaktoren und/oder durch unerwünschte thrombogene Komponenten in dem Konzentrat. Die intensive und langanhaltende Verabreichung von Faktor IX kann zu weitaus höheren als normalen Gehalten an Faktor II führen, der in den äquivalenten Mengen infundiert wird und eine längere Halbwertszeit des Verschwindens in dem Plasma besitzt. Einige Hypothesen auf Basis von in vitro-Untersuchungen oder Tiermodellen legten auch nahe, daß eine Kombination von Faktoren thrombogener sein könnte als Faktor IX allein. In der Tat sind gegenwärtige Dosierungsgehalte von Faktor IX zum Teil durch das Erfordernis, übermäßige Gehalte an Faktor II zu vermeiden, begrenzt.
Weiterhin zeigen als Folge der Behandlung mit Faktor VIII- Konzentraten einige Hämophilie A-Patienten Anzeichen einer nicht-viralen Immunosuppression. Eine ähnliche Immunosuppression bei Hämophilie B-Patienten nach der Behandlung mit Faktor IX-Konzentrat legt nahe, daß die Reaktion in beiden Fällen auf eine unerwünschte Verunreinigung in den Konzentraten zurückzuführen sein kann.
Donorplasma-Poole, aus denen Gerinngungsfaktor-Konzentrate hergestellt werden, enthalten das verursachende Agens (wahrscheinlich viral) der Nicht A-Nicht B-Hepatitis, und man muß annehmen, daß sie das Risiko einer Verunreinigung mit Viren (z.B. Hepatitis B und HIV) beinhalten. Zur Verbesserung der Produktsicherheit müssen die Konzentrate viruzidalen Behandlungen unterzogen werden, die durch die Gegenwart verunreinigender Proteine erschwert werden können. Beispielsweise kann diese viruzidale Behandlung in einem stärker gereinigten Konzentrat, in dem eine Störung aus nicht notwendigen Proteinen minimal gehalten weiden kann, einfacher konzipiert werden.
Im allgemeinen ist es zur Verabreichung eines vorgesehenen Blutgerinnungsfaktors bevorzugt, einen spezifischen Gerinnungsfaktor im menschlichen Patienten zu ersetzen oder zu ergänzen, ohne gleichzeitig den Gehalt an anderen Faktoren oder in der Tat an jeglichen Verunreinigungen, die unerwünschte physiologische Wirkungen verursachen könnten, zu erhöhen.
Es besteht somit ein Bedürfnis für ein verbessertes Verfahren einer zumindest teilweisen Abtrennung von Vitamin K- abhängigen Gerinnungsfaktoren, um einige der vorstehenden Probleme zu vermindern oder sogar zu beseitigen. Es wurde nun gefunden, daß die Vitamin K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren zumindest teilweise voneinander durch Metallchelat- Chromatographie getrennt werden können.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur zumindest teilweisen Abtrennung von Vitamin K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren aus einer Mischung vorgesehen, die zumindest einen derartigen Faktor enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß diese Mischung an ein Chelat eines mehrwertigen Metalls adsorbiert wird, das an einem inerten Träger immobilisiert ist, woran sich eine Elution anschließt, um eine oder mehrere hinsichtlich eines dieser Faktoren angereicherte Fraktionen zu erhalten.
Im allgemeinen enthält diese Mischung zumindest zwei Vitamin K-abhängige Blutgerinnungsfaktoren. Somit wird, obgleich die Erfindung die Reinigung oder Anreicherung von vollständig funktionalisierten Gerinnungsfaktoren, die sich von mikrobiologischen Kulturen unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie ableiten, umfaßt, die Quelle der Gerinnungsfaktoren gewöhnlich Blutplasma, insbesondere menschliches Plasma, sein.
Die Mischung der erfindungsgemäß zu behandelnden Faktoren wird gewöhnlich ein Plasmafraktionskonzentrat sein, aus dem einige Plasmafaktoren bereits entfernt worden sind.
Bei der Erzielung von gemischten Faktoren aus Plasma umfassen typische, ursprüngliche, die gewünschten Komponenten enthaltenden Fraktionen einen Kryoniederschlagsüberstand (der Überstand, der nach der Kryoausfällung von Faktor VIII- Konzentrat verbleibt), einen Fraktion I-Überstand und Fraktionen, die nach Adsorption des Plasmas mit verschiedenen Affinitätsreagentien, z.B. Heparin-Sepharose, erhalten wurden. Im allgemeinen werden die Faktoren durch Adsorption an einem Anionenaustauschharz, wie Diethylaminoethyl(DEAE)- cellulose, DEAE-Sephadex oder DEAE-Sepharose, zur Herstellung eines Prothrombinkomplexkonzentrats weiter konzentriert worden sein.
Es sollte erwähnt werden, daß unter optimalen Bedingungen für die Faktor IX-Herstellung DEAE-cellulose nicht Faktor VII bindet, obgleich Ionenaustauscher mit höherer Kapazität (z.B. DEAE-Sephadex und DEAE-Sepharose) Faktor VII wirksamer unter den gängigen Industrieverfahrensbedingungen binden. Somit wird Prothrombinkomplexkonzentrat aus DEAE-cellulose nicht Faktor VII enthalten. Dieser Verhaltensunterschied ermöglicht es, daß ein vorwiegend Faktor VII enthaltendes Konzentrat erhalten wird, obgleich dies auch einen Vorteil aus der Reinigung und Anreicherung gemäß der Erfindung haben kann. Während die Anionenaustauscherharzkonzentrate mit Vorteil gemäß der Erfindung behandelt werden können, können andere Kombinationen von Faktoren ebenfalls mit Vorteil behandelt werden, um die Konzentration an gewünschtem Faktor zu erhöhen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäß erzeugte, angereicherte Fraktion, die lediglich zwei Faktoren enthalten kann, einer zweiten Behandlung unterzogen werden, um zu einer weiteren Anreicherung zu gelangen.
Bestehende Reinigungssysteme besitzen verschiedene inhärente Nachteile. Heparin-Sepharose führt zu schlechter Auflösung und schlechten Gerinnungsfaktoraktivitäten bei der Verwendung im Industriemaßstab. Sulfatiertes Dextran ergibt Faktor IX mit einem sehr kurzen NAPTT (siehe unten), das zu thrombotischen Zwischenfällen bei der klinischen Anwendung führen könnte, und Dextransulfat ist zytotoxisch und jegliches Auslaugen aus einer derartigen Affinitätsmatrix kann das Produkt ernsthaft verunreinigen. Die vorliegende Behandlung besitzt gegenüber derartigen Reinigungssystemen in sämtlichen Aspekten Vorteile.
Während ein gewisser Nutzen durch eine ansatzweise Behandlung der anfänglichen Mischung mit dem immobilisierten Metallchelat, gefolgt von einem einfachen Waschen zur Entfernung des bzw. der am einfachsten eluierten Faktors bzw. Faktoren erhalten werden kann, ist die am meisten bevorzugte Arbeitsmethode die Säulenchromatographie. Die Mischung der Faktoren kann somit auf das obere Ende der Säule aufgebracht werden und ein Elutionsmittel durchlaufen, um Fraktionen zu ergeben, die die getrennten und teilweise getrennten Faktoren enthalten. Alternativ kann die anfängliche Mischung ansatzweise auf das immobilisierte Metallchelat vor Beladen der Säule aufgebracht werden.
Die chelatisierten, mehrwertigen Metalle für die Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren liegen im allgemeinen im zweiwertigen Zustand vor, wobei Cu²&spplus; besonders bevorzugt ist.
Das immobilisierte Chelatisierungsmittel kann einen herkömmlichen Stütz- oder Gerüstträger (wie einen Träger auf Basis von Cellulose, Polystyrol, Acrylamid, Siliciumdioxid, Fluorkohlenstoffen, vernetztem Dextran oder vernetzter Agarose), der zur Chelatisierung mehrwertiger Metalle befähigte Gruppen trägt, umfassen. Solche Gruppen sind gut bekannt und können in Lehrbüchern, wie Martell und Calvin, Chemistry of the Metal Chelate Compounds, Prentice Hall, Inc., New York (1952), vorgefunden werden.
Iminodiessigsäuregruppen, -N(CH&sub2;COOH)&sub2;, sind besonders bevorzugte chelatisierende Gruppen.
Die chelatisierenden Gruppen werden im allgemeinen durch lineare "Spacer"-Gruppierungen, wie gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffe oder Kohlenhydratketten mit vorteilhaft 8 bis 16 Atomen, z.B. 12 Atomen, zwischen der chelatisierenden Gruppe und dem Träger, in Distanz zu der Stütze oder dem Gerüst des Trägers gehalten. Solche Spacer-Gruppierungen können in geeignete Substrate durch Umsetzung mit einem zweiwertigen Reagens der gewünschten Kettenlänge eingebracht werden. Eine bevorzugte, Metall bindende Matrix ist chelatisierende Sepharose, die ein geperltes 6% Agaroseprodukt, vertrieben von Pharmacia AB, ist, das Iminodiessigsäuregruppen, die an die Sepharose durch eine Kette
geknüpft sind, trägt.
Die Bindung der Proteine an den chelatisierenden Träger hängt von zumindest vier Gesichtspunkten ab:
(i) der Ionenstärke, wobei eine erhöhte Ionenstärke offensichtlich die nicht-spezifische Bindung minimal hält;
(ii) der Anwesenheit von Pufferionen sowohl in der zu beladenden Probe als auch in dem äquilibrierten Metall- Chelatgel;
(iii) der Beladungskapazität der Matrix: diese ist eine endliche Größe, die vollständig durch die dichter bindenden Proteine auf Kosten der schwächer bindenden Proteine gesättigt sein kann. Die Kapazität der Matrix bei einem speziellen Protein hängt somit von der Zusammensetzung und der Konzentration der Proteinmischung ab, mit der sie während der Beladung und der Adsorptionskontaktzeit ausgelöst wird;
(iv) sowohl hinsichtlich der Bindung als auch der Elution ist der pH ein anerkannter Faktor.
Es wurde gefunden, daß bei relativ hohen Ionenstärken die Bindung von Prothrombin (Faktor II) und Thrombin an dem Chelat reduziert ist, während diejenige der Faktoren IX und X und von Protein C erhöht ist. Daher ist es im allgemeinen erwünscht, den Prothrombingehalt in Konzentraten anderer Blutgerinnungsfaktoren zu reduzieren, um die Möglichkeit der Thrombinbildung zu vermeiden, wobei diese Entdeckung besonders wertvoll ist. Es ist somit bevorzugt, das Metallchelat in einer wäßrigen Lösung relativ hoher Ionenstärke, z.B. von 0,4 bis 1,0 Mol, vorzugsweise 0,4 bis 0,6 Mol, am meisten bevorzugt etwa 0,5 Mol, zu beladen, wobei Natriumchlorid und/oder eines oder mehrere andere Elektrolyte eine Lösung äquivalenter Ionenstärke ergeben.
Verschiedene Vitamin-K-abhängige Gerinnungsfaktoren besitzen verschiedene pH-Optima für die Bindung an ein chelatisierendes Gel, und demzufolge ergibt die Auswahl des pH der Beladungspufferlösung ein weiteres Mittel, um die bevorzugte Bindung an dem chelatisierenden Gel von einem oder mehreren Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren gegenüber einem anderen derartigen Faktor zu fördern. Somit findet z.B. im Fall von Cu²&spplus;-angeregter, chelatisierender Sepharose eine optimale Bindung der Faktoren II, IX und X bei pH 6,0 bis 7,0,oberhalb pH 7,0 bzw. bei pH 6,5 bis 7,5 statt. Demzufolge wird beispielsweise zur Erhöhung der differentiellen Bindung an ein derartiges Gel von Faktor IX gegenüber Prothrombin der Beladungs-pH wünschenswerterweise pH 7,0 oder darüber sein.
Weiterhin kann, wenn man Prothrombin aus einem oder mehreren anderen Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren abreichern möchte, eine verminderte Bindung von Prothrombin zugunsten anderer Blutgerinnungsfaktoren, z.B. Faktor IX, durch geeignete Auswahl der Adsorptionskontaktdauer und der Beladungsanforderung begünstigt werden. So wird zur Optimierung der Trennung des Faktors IX von Faktor II an Cu²&spplus;-angeregter Chelatisierungs-Sepharose, ausgehend von einem Prothrombin- Komplexkonzentrat, die Adsorptionskontaktzeit vorteilhaft mehr als 20 Minuten, insbesondere etwa 40 Minuten oder länger, betragen,und die Beladungsanforderung wird wünschenswerterweise derart sein, daß eine Beladung mit Faktor IX, von 100 bis 450 F.IX:Ag-Einheiten je ml Gel erreicht wird.
Die Säulenchromatographie ist bevorzugt. Die Anfangsmischung der Faktoren wird vorzugsweise auf das obere Ende einer Säule aufgebracht, jedoch ist es auch möglich, die Anfangsmischung auf das immobilisierte Chelat ansatzweise zu beladen. Nach Waschen, zumeist bei hoher Ionenstärke, können die verbliebenen Faktoren entweder durch ansatzweise Elution oder durch Transferieren des Gels auf eine Säule für die chromatographische Elution getrennt werden.
An die Ladung schließt sich zweckmäßigerweise direkt ein Waschen mit einer wäßrigen Lösung von gleicher oder ähnlicher Ionenstärke und pH zur Entfernung von Prothrombin und jeglichem Thrombin, das anwesend sein kann, an. Vorteilhaft kann eine Waschstufe bei saurem pH zusätzlich zur Entfernung von chelatisierendem Gel-inter-α-Trypsin-Inhibitor durchgeführt werden. Dieses Protein wird als unerwünschte Hauptverunreinigung von Faktor IX-Konzentraten, die nach dem Stand der Technik hergestellt wurden, das in einigen Fällen soviel wie 30% des Gesamtproteins ausmacht, angesehen. Es wurde jedoch gefunden, daß inter-α-Trypsin-Inhibitor aus Cu²&spplus;-angeregter chelatisierender Sepharose bei einem pH von etwa 4,5 bis 5,5 ohne nennenswerten Verlust von Faktor IX aus dem Gel eluiert werden kann. Zur Reduzierung der Elektrolytgehalte in dem Endprodukt ist es zweckmäßig, zumindest eine letzte Waschstufe bei niedriger Ionenstärke, z.B. äquivalent 100 bis 200 mM NaCl, einzuschließen.
Dieses Waschverfahren führt zu einer gewissen Entfernung von Viren durch zusätzliche Waschstufen, während das Protein immobilisiert wird. Weiterhin können die immobilisierten Faktoren mit einem Viruzid, wie einem Detergens, bei dieser Stufe behandelt werden, und das Viruzid kann dann durch weiteres Waschen vor der Elutionsstufe entfernt werden. Es sollte festgestellt werden, daß das Metallchelatmaterial ohne weiteres die Proteinfaktoren von Interesse in Gegenwart von als Viruzide verwendeten Detergentien und/oder Lösungsmitteln vor der anfänglichen Adsorption gemäß der Erfindung bindet und diese Faktoren zurückhalten kann, wenn das Viruzid durch Waschen entfernt wird, oder tatsächlich, wenn eine Viruziddetergenswäsche vor der Elution der Faktoren angewendet wird. Dies steht im Gegensatz zu zahlreichen früheren Affinitätssäulen, die zur Adsorption derartiger Proteine verwendet wurden, wo das Detergens dazu neigt, die Elution der Proteine zu beeinträchtigen.
Die nach der Entfernung von Faktor II auf der Säule verbleibenden Gerinnungsfaktoren oder in der Tat derartige auf die Säule im wesentlichen in Abwesenheit von Faktor II aufgebrachten Faktoren können durch eine Änderung des pH und/oder durch Verwendung eines Austauschmittels, ausgewählt unter Imidazol und Aminosäuren, wünschenswerterweise bei signifikant geringerer Ionenstärke, als derjenigen der Beladungspufferlösung, eluiert werden, um die Notwendigkeit einer Entfernung von Salzen aus den resultierenden, angereicherten Fraktionen zu reduzieren oder zu vermeiden. Geeignete, bevorzugte Ionenstärken für eine solche Elution liegen im Bereich von 100 bis 200 mM.
Hängt die Elution der gewünschten Blutgerinnungsfaktoren von einem pH-Gradienten ab, kann dies ein zunehmender pH-Gradient oder ein abnehmender pH-Gradient sein, und in jedem Fall kann inter-α-Trypsin-Inhibitor in erwünschter Weise aus dem Chelatisierungsgel vor dem Sammeln einer Faktor IX-angereicherten Fraktion abgereichert werden. Somit kann bei Verwendung eines zunehmenden pH-Gradienten für die Elution es erwünscht sein, daß der Ausgangs-pH so niedrig wie etwa bei 4,5 bis 5,5 liegt, um die Entfernung von inter-α-Trypsin- Inhibitor zu erzielen, woran sich jedoch im allgemeinen eine erhebliche Stufe aufwärts im pH für die Elution von erwünschten Blutgerinnungsfaktoren anschließt. Insbesondere wurde beispielsweise gefunden, daß Faktor IX-und Faktor X - angereicherte Fraktionen in erwünschter Weise aus Cu²&spplus;-angeregter Chelatisierungs-Sepharose in Gegenwart einer Nicht- Aminosäure oder in Gegenwart von ein Puffersystem enthaltendem Imidazol bei relativ geringer Ionenstärke, z.B. 100 mM NaCl, durch Variieren des pH linear von etwa pH 7,0 bis etwa pH 8,0 eluiert werden können. Bei Verwendung eines abnehmenden pH-Gradienten, um z.B. aus dem gleichen Geltyp Blutgerinnungsfaktoren eines Prothrombinkomplexkonzentrats zu eluieren, woran sich ein Waschen des Gels bei einem pH oberhalb 7,0 bei hoher Ionenstärke, z.B. 500 mM NaCl, anschließt, um Faktor II zu entfernen, kann die Elution von Faktor X- und Faktor IX-angereicherten Fraktionen, die im wesentlichen von inter-α-Trypsin frei sind, in erwünschter Weise bei relativ niedriger Ionenstärke, z.B. 100 mM NaCl, durch stufenweise Abnahme des pH der Pufferlösung in einem sauren pH- Bereich herab auf etwa pH 4,0 erreicht werden. In diesem Fall wird die folgende Reihenfolge der Proteinelution beobachtet: Faktor X/Faktor V (pH etwa 5-5,6)-inter-α-Trypsin- Inhibitor/Protein C (pH etwa 4,6), Faktor IX (pH etwa 4,1).
Möchte man gereinigten oder angereicherten Faktor II herstellen, kann dieser vorzugsweise aus einer Metallchelatsäule bei niedriger Ionenstärke in Abwesenheit von Aminosäuren eluiert werden.
Verwendet man ein Austauschmittel, liegt die Konzentration an Imidazol oder Aminosäure (insbesondere Glycin, Methionin oder Glutaminsäure) in dem Elutionsmittel vorzugsweise im Bereich von 5 bis 70 mM. Geeignete Aminosäuren für die Verwendung bei einer derartigen Elution schließen z.B. Alanin, Phenylalanin, Valin, Lysin, Glycin, Methionin und Glutaminsäure ein. Die letzten drei genannten Aminosäuren sind für diesen Zweck besonders bevorzugt.
Ein ein Austauschmittel enthaltendes Elutionsmittel wird vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 4 bis 9, insbesondere 6 bis 8, z.B. etwa 7, gepuffert. Geeignete Puffersysteme umfassen Aminoalkoholpuffer, wie Tris- und Citrat-Phosphat-Puffer. Es wurde gefunden, daß Tris die Elution sämtlicher Faktoren bei niedrigeren Konzentrationen an Austauschmittel, d.h. Imidazol oder Aminosäure, ermöglicht.
Im allgemeinen scheint, unabhängig von dem verwendeten Elutionssystem, die Reihenfolge der Elution, die die Bindungsaffinität wiederzugeben scheint, Faktor II/IIa, Faktor X, FaktorIX/IXa/Protein C zu sein.
Im allgemeinen wird die Elution vorzugsweise derart durchgeführt, daß die spezifische Aktivität an eluiertem Protein (Reinheit und/oder Wirksamkeit) optimiert wird. Im allgemeinen liegt die Konzentration des interessierenden Hauptfaktors, z.B. Faktor IX, vorzugsweise bei zumindest 30 IE/ml.
Nach Elution kann die Lösung einer Gefriertrocknung unterzogen werden. Zur Inaktivierung von Virusinfektionen kann das gefriergetrocknete Konzentrat bei z.B. 80ºC erhitzt werden. Wir fanden, daß die nach der Erfindung gereinigten Konzentrate im wesentlichen ein derartiges Erhitzen überleben, wobei eine signifikante Aktivierung der jeweiligen Faktoren in größerem Ausmaß als bei den früheren Konzentraten vermieden wird.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Methoden erwies es sich als möglich, erstmals herzustellen:
(a) Faktor IX, der im wesentlichen von Faktor II und inter-α-Trypsin-Inhibitor frei ist;
(b) Protein C, das im wesentlichen von den Faktoren II, IX und X frei ist;
(c) Faktor X, der im wesentlichen von Faktor II frei ist und spezifische Faktor X-Aktivität von zumindest 13 IE/mg Protein besitzt; und
(d) Faktor VII, der im wesentlichen von Faktor II frei ist und eine spezifische Faktor VII-Aktivität von höher als einer Einheit je mg Protein besitzt.

Testmethoden

Die berichteten Vorkommnisse von thrombotischen Zwischenfällen nach einer Infusion von früherem Prothrombinkomplexkonzentrat führte zu in vitro- und in vivo-Tests der Produkte im Hinblick auf ihre potentielle thrombogene Wirkung. Die in vivo-Tests wurden bei Tieren (Kaninchen, Meerschweinchen und Hunden) unter Verwendung verschiedener Kriterien für die Bewertung der Thrombose nach der Infusion durchgeführt. In vitro-Tests basieren auf der Befähigung des Konzentrats, die Gerinnungsdauer des Substratplasmas oder von Fibrinogen zu reduzieren. Die Signifikanz dieser Tests wurde nicht gezeigt jedoch wird großes Gewicht hierauf in Form der Produktqualitätskontrolle gelegt.
Die drei Haupttests sind:

NAPTT:

Bestimmt den Gehalt an aktivierten Gerinnungsfaktoren in der Probe bei einer willkürlichen niedrigeren Grenzgerinnungszeit von 150 Sekunden. Die NAPTT kann nicht schlüssig mit der Konzentration irgendeines speziellen aktivierten Gerinnungsfaktors in Beziehung gesetzt werden, gibt jedoch die Anwesenheit von Faktor IXa und Faktor Xa an.

FCT:

Bestimmt die Zeit, die erforderlich ist, damit eine Fibrinogenlösung in Gegenwart des Testmaterials gerinnt. Dies stellt ein direktes Maß für Thrombin dar (das vorletzte Protein bei der Blutgerinnung "Kaskade"). Die niedrigere Grenzgerinnungszeit beträgt 3 Stunden, entsprechend 5 x 10&supmin;³ IE/ml oder 2 ng/ml Thrombin.

TGt 50:

Bestimmt die Zeit, die benötigt wird, um eine bekannte Menge Thrombin zu erzeugen. Sie ist ein Maß für die Aktivierung der Gerinnungsfaktoren, die früher bei dem Verfahren arbeiten.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung.

In den Beispielen verwendete Tests für die quantitative Bestimmung der Proteine

Sowohl die funktionelle biologische Aktivität als auch die antigene Aktivität wurden verwendet, um die Proteine von Interesse quantitativ zu bestimmen.
Die biologische Aktivität der Faktoren II, IX und X wurde bestimmt, indem man Gerinnungsversuche durchführte. Die Einheit der Gerinnungsaktivität (:C) wurde unter Verwendung eines Arbeitsstandards 87/532 definiert, der gegenüber dem 1. Internationalen Standard für Faktoren II-, IX- und X- Konzentrat, Code 84/681, geeicht worden war.
Die biologische Äktivität von Faktor VII wurde bestimmt, indem man den Gerinnungsversuch durchführte oder durch chromogenen Assay unter Verwendung eines synthetischen Substrats. In beiden Fällen wurde die Einheit unter Verwendung eines in-house Faktor VII-Konzentrats-Arbeitsstandards zugeordnet, der gegenüber einem menschlichen Plasmapool von mehr als dreißig Spendern, definiert als eine Faktor VII-Aktivität von 1,0 Faktor (F.)VII:C E/ml besitzend, geeicht worden war.
Sämtliche Antigenaktivitäten (:Ag) für die Faktoren II, V, IX und X, Protein C und inter-α-Trypsin-Inhibitor wurden durch Immun-Elektrophorese (Laurell's Rocket-Methode) unter Verwendung von Normalem, gepooltem Plasma als Standard bestimmt. In jedem Fall wurde der Standard einer Aktivität von 1,0 Einheiten/ml zugeordnet und Probenaktiväten wurden als Plasma-Äquivalenteinheiten/ml ausgedrückt.
In der vorliegenden Beschreibung wird die Gerinnungsaktivität oder "Faktor - :C" in Form von internationalen Einheiten je ml oder IE/ml angegeben. Die Antigenaktivität oder "Faktor - : Ag" wird als Einheiten je ml (E/ml) oder Plasma- Äquivalenteinheiten je ml (p.e.E/ml) angegeben.
Da die Gerinnungs- und Antigenaktivitäten Maße für verschiedene Aspekte der Proteinchemie sind, ist die internationale Einheit der Gerinnungsaktivität nicht das gleiche wie die Plasma-Äquivalenteinheit. Typischerweise beträgt das Verhältnis von IE : p.e.E. für Faktor II, Faktor IX und Faktor x in teilweise gereinigten Proteinkonzentraten 0,86, 0,6 bzw. 0,63.

Beispiel 1

Herstellung von Prothrombin aus Prothrombinkomplexkonzentrat (PCC)

Chelatisierende Sepharose wurde mit Kupferionen angeregt, indem man durch sie Kupfersulfatlösung leitete. Das Gel wurde dann mit Citrat-Phosphat-Puffer, der 500 mM NaCl bei pH 7,0 enthielt, gewaschen. PCC enthaltendes 500 mM NaCl wurde auf die Säule bei einer Beladung von 100 bis 200 Faktor IX IE/ml Gel aufgebracht. Das Proteineluat wurde überwacht und das Durchbruchprotein wurde gesammelt. Dieses enthielt Prothrombin bei Aktivitäten von 5 bis 25 IE/ml mit einer spezifischen Aktivität von 5 IE/mg Protein. Dieses Material bestand zu zumindest 70% aus Prothrombin.

Beispiel 2

Wirkung der Ionenstärke auf die Bindung der Faktoren II, IX, X und Protein C an Kupfer-Chelatgel

PCC wurde gegen Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 100, 250, 500 oder 1000mM NaCl, dialysiert. Dieses wurde dann auf eine Cu²&spplus;-angeregte Chelatisierungs-Sepharosesäule beladen, die mit dem Puffer der gleichen Ionenstärke gewaschen worden war. Nach dem Beladen bei 430 Einheiten/ml Gel wurde die Spule weiter mit dem gleichen Puffer gewaschen und das eluierte, nicht-gebundene Protein im Hinblick auf die Faktoren II, IX, X und Protein C untersucht. Die nachstehende Tabelle I zeigt die Ergebnisse. Tabelle I Adsorption [NaCl] (mM) Nicht-gebundene Einheiten/ml Gel
Eine maximale unterschiedliche Bindung von Faktor IX gegenüber Faktor II wurde bei 500 mM NaCl beobachtet.

Beispiel 3

Wirkung des Adsorptions-pH auf die Bindung der Faktoren II, IX und X an Kupfer-Chelatgel

Chelatisierende Sepharose wurde zuerst mit Kupferionen angeregt und dann mit einem Citrat-Phosphat-Puffersystem, enthaltend 500 mM NaCl bei einem auf den angegebenen Wert eingestellten pH, gewaschen. PCC mit einem Gehalt von 500 mM NaCl wurde auf den gleichen pH titriert und dann auf das Gel bei etwa 300 Faktor IX-Einheiten/ml Gel beladen. Die Säule wurde weiterhin mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Durchbruch/nicht-gebundene Protein gesammelt und im Hinblick auf die Faktoren II, IX und X einer Messung unterzogen. Die nachstehende Tabelle II zeigt die Ergebnisse. Tabelle II Adsorption pH Nicht-gebundene Einheiten/ml Gel
Optimale Bindung von Faktor II wurde zwischen pH 6,0 bis 7,0 erreicht.
Optimale Bindung von Faktor IX wurde oberhalb pH 7,0 erreicht.
Optimale Bindung von Faktor X wurde zwischen pH 6,5 und pH 7,5 erreicht.
Der Adsorptions-pH kann daher verwendet werden, um die Bindung eines bevorzugten Gerinnungsfaktors an dem Gel zu optimieren.

Beispiel 4

Herstellung eines Konzentrats von Faktor X und Faktor IX mit reduziertem Prothrombin

Man stellte eine chelatisierende Sepharosesäule her und belud sie wie in Beispiel 1. Nach dem Aufbringen von PCC wurde die Säule mit Citrat-Phosphat-Puffer,enthaltend 500 mM NaCl bei pH 7,0, gewaschen. Die Ionenstärke wurde hierauf durch Waschen mit Citrat-Phosphat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, reduziert. Die Faktor X-Fraktion wurde dann mit Citrat- Phosphat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 5 mM Glycin, eluiert. Diese enthielt Faktor X bei 15 bis 40 Faktor X IE/ml und weniger als 0,01 Einheiten Prothrombin je Einheit Faktor X. Die spezifische Aktivität von Faktor X betrug 13 IE/mg Protein und war daher 7% rein. Diese Fraktion enthielt auch Faktor IX in etwa äquimolaren Mengen (1 IE Faktor IX/Einheit Faktor X).

Beispiel 5

Herstellung von Faktor X mit reduziertem Prothrombin und Faktor IX

Eine chelatisierende Sepharosesäule wurde wie in Beispiel 1 beechrieben angeregt und beladen. Nach Aufbringen der Probe wurde die Säule mit Citrat-Phosphat-Puffer mit einem Gehalt an 500 mM NaCl bei pH 7,0 gewaschen. Der Faktor X wurde dann mit Citrat-Phosphat-Puffer bei pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl und 5 mM Glycin, eluiert. Dieses Material enthielt 15 bis 30 Faktor X IE/ml mit einer spezifischen Aktivität von 14 IE/mg Protein. Dieses Material unterschied sich von dem in Beispiel 4 erhaltenen dadurch, daß es eine höhere Prothrombinaktivität und eine geringere Faktor IX-Aktivität besaß. Hier wurden 0,25 IE/Einheit Faktor X sowohl für Prothrombin als auch Faktor IX erhalten. Daher bestand das Prothrombin noch aus etwa 40 bis 50 Gew.% Gesamtprotein.

Beispiel 6

Herstellung eines Konzentrats von Faktor IX und Faktor X mit reduziertem Prothrombin

Eine chelatisierende Sepharosesäule wurde wie in Beispiel 1 beschrieben angeregt und beladen. Sie wurde dann nacheinander mit Citrat-Phosphat-Puffer, enthaltend zuerst 500 mM und dann 100 mM NaCl, bei pH 7,0 gewaschen. Sowohl Faktor IX als auch Faktor X wurde dann mit Tris-Glycin-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, bei Aktivitäten von 30 IE/ml eluiert. Das Prothrombin wurde auf 0,03 IE/Einheit Faktor IX oder Faktor X reduziert.

Beispiel 7

Herstellung eines Konzentrats von Faktor IX und Protein C mit reduziertem Prothrombin und Faktor X

Eine chelatisierende Sepharosesäule wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und gewaschen. Nach Elution von Protein in 5mM Glycin wurde Tris-Glycin-Puffer zur Elution von Faktor IX verwendet. Man fand, daß Tris im Bereich von 10 bis 30 mM, Glycin im Bereich von 40 bis 70 mM und NaCl 100 mM geeignet war. Dieses eluierte Faktor IX bei Aktivitäten von 30 bis 50 IE/ml. Prothrombin war nicht nachweisbar und Faktor X zeigte weniger als 0,01 Einheiten/Einheit Faktor IX (weniger als 0,05 Gew.%). Protein C wurde auch bei Konzentrationen von 25 bis 40 Plasmaäquivalenteinheiten/ml eluiert.

Beispiel 8

Abtrennung von Protein C aus Prothrombin und Faktor X

Die Reinigung von Protein C wird durch Co-Elution von Prothrombin und Faktor X in herkömmlichen chromatographischen Systemen, wie Heparin-Sepharose oder Dextran-Sulfat-Sepharose, erschwert. In diesen Systemen ist jedoch die Faktor IX-Verunreinigung aufgrund einer dichteren Bindung dieses Proteins minimal. Das hier beschriebene Metallchelatsystem kann daher als eine Stufe bei der Reinigung von Protein C verwendet werden.
Die Herstellung und das Waschen einer chelatisierenden Sepharosesäule waren wie in Beispiel 7 beschrieben. Da die Proteinbindung konzentrationsabhängig ist, war die Beladung möglichst hoch bis zu 160 Faktor X IE/ml Gel oder 240 Prothrombin IE/ml Gel. Die Säule wurde dann wie in Beispiel 7 beschrieben gewaschen und eluiert, wobei Protein C, das mit dem letzten Tris-Glycin-Puffer-Elutionsmittel eluiert wurde, von Prothrombin und Faktor X-Verunreinigungen abgetrennt war.

Beispiel 9

Wirkung der Adsorptionskontaktzeit auf die Bindung und die Gewinnung von Faktor II, Faktor IX, Faktor X und Protein C aus Cu²&spplus;-angeregter Chelatisierungssepharose

Chelatisierungssepharose wurde in Säulen gepackt, mit Kupferionen angeregt und dann mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. 500 mM NaCl enthaltendes PCC wurde auf jede Säule bei einer kontrollierten Fließgeschwindigkeit derart beladen, daß die Kontaktdauer mit dem Gel in den verschiedenen Säulen variiert werden konnte. Die Säulen wurden bei 430 Faktor IX Einheiten/ml Gel beladen, mit dein 500 mM NaCl-Puffer, dann mit 100 mM NaCl-Puffer und hiernach mit 10 mM Tris, 70 mM Glycin, 100 mM NaCl-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Die Durchbruch- und die Tris-Glycin-Eluate wurden hinsichtlich Faktor II, Faktor IX, Faktor X und Protein C einer Bestimmung unterzogen. Die Ergebnisse finden sich in nachstehender Tabelle III. Tabelle III Kontaktzeit (min) Nicht-gebundene Einheiten/ml Gel Eluierte Einheiten/ml Gel
Die Bindung des Proteins an das Gel ist daher von der Kontaktdauer abhängig. Diese kann für die Faktoren IX, X und Protein C bei Kontaktzeiten von 40 Minuten oder mehr optimiert werden. Eine erhöhte Kontaktdauer führt zu einer geringeren Bindung von Faktor II an dem Gel.

Beispiel 10

Wirkung der Beladungsanforderung auf die Bindung und Gewinnung von Faktor II, Faktor IX, Faktor X und Protein C mit Cu²&spplus;-angeregter Chelatisierungssepharose

Chelatisierungssepharose wurde in verschiedene Säulen gepackt, mit Kupferionen angeregt und mit Citrat-Phosphat- Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. 500 mM NaCl enthaltendes PCC wurde auf die Säulen in verschiedenen Mengen beladen, wobei die Kontaktdauer für jede Säule bei 40 Minuten durch Variieren der Fließgeschwindigkeit durch die Säule gehalten wurde. Die Säulen wurden dann mit Puffern, wie in Beispiel 6 beschrieben, gewaschen. Die Ergebnisse finden sich in nachstehender Tabelle IV. Tabelle IV Beladung F.IX:Ag Einheiten/ml Gel Nicht-gebundene Einheiten/ml Gel Eluierte Einheiten/ml Gel
Zunehmende Beladung tauscht Faktor II bevorzugt aus. Die Beladungsanforderung kann verwendet werden, um die Bindung und die Gewinnung eines speziellen Proteins in bezug auf die anderen zu steigern. Eine verbesserte Trennung von Faktor IX von Faktor II wurde bei Beladungen von 258 bis 430 F.IX:Ag Einheiten/ml Gel (äquivalent etwa 150 bis 250 F.IX:C IE/ml Gel) erreicht.

Beispiel 11

Wirkung der Faktor IX-Konzentration auf die Bindung und Gewinnung von Faktor II, Faktor IX, Faktor X und Protein C mit Cu²&spplus;-angeregter Chelatisierungssepharose

Chelatisierungssepharose wurde mit Kupferionen angeregt und wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben gewaschen. 500 mM NaCl enthaltendes PCC wurde in Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, verdünnt. Die Säulen wurden bei verschiedenen Verdünnungen beladen und mit Puffern, wie in Beispiel 6 beschrieben, gewaschen. Die Gesamtbeladungsanforderung (ca. 250 Einheiten/ml Gel) und die Kontaktzeiten wurden konstant gehalten. Die Ergebnisse finden sich in nachstehender Tabelle V. Tabelle V Beladungsstärke F.IX:Ag E/ml Gel Nicht-gebundene Einheiten/ml Gel Eluierte Einheiten/ml Gel
Höhere Konzentrationen an beladenem Material sind bevorzugt, damit die Bindung an dem Chelat stattfinden kann.

Beispiel 12

Wirkung des Chelatisierungsgels auf die Bindung von Faktor IX und dessen Gewinnung

Gleiche Volumina von fünf Chelatisierungsgeltypen wurden in fünf Säulen gepackt, mit Cu²&spplus;-Ionen angeregt und mit Citrat- Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. PCC, das auf einen Gehalt von 500 mM NaCl eingestellt war, wurde in gleichen Mengen auf jede Säule beladen, wonach ein Waschen nacheinander mit dem gleichen Puffer, Puffer mit einem Gehalt an 100 mM NaCl und dann Elution mit 10 mM Tris, 70 mM Glycin-Puffer, pH 7,0, folgten. Faktor IX wurde in den Durchbruch-, Wasch- und Eluatfraktionen bestimmt.
Die verwendeten Geltypen waren:
(1) Chelatisierende Sepharose, enthaltend Iminodiessigsäure, geknüpft an Sepharose durch ein 12 Atom (10Kohlenstoff)-Spacermolekül [Pharmacia].
(2) Wie bei 1, jedoch mit zusätzlicher Verknüpfung für Fast Flow Sepharose.
(3) Agarose, die durch ein 12 Atom (10 Kohlenstoff)-Spacermolekül geknüpfte Iminodiessigsäure trägt [Sigma].
(4) Iminodiessigsäure, die direkt an ein Styrol- Divinylbenzol-vernetztes Polymeres geknüpft ist [Chelex 100, BioRad].
(5) Wie bei 4, jedoch mit einer nicht-vernetzten Matrix mit gröberer Maschenzahl [Chelex 20, BioRad].
Die nachstehende Tabelle VI zeigt die Ergebnisse. Tabelle VI Gel-Typ Faktor IX, % an Beladenem Durchbruch Wäsche Eluat
Die Bindung von Faktor IX an Cu²&spplus;-angeregte Iminodiessigsäuregruppen wird gesteigert, indem man ein Spacermolekül zwischen der Matrix und der chelatisierenden Gruppe vorsieht und indem man nicht-vernetzte, chelatisierende Sepharose verwendet.

Beispiel 13

Herstellung von Faktor IX unter Verwendung von Cu²&spplus;-angeregter, chelatisierende Sepharose bei einer ansatzweisen Adsorption

Chelatisierende Sepharose wurde mit Wasser gewaschen, hiernach in einer Kupfersulfatlösung (5 mg/ml) suspendiert und 20 bis 30 Minuten gemischt. Das Cu²&spplus;-angeregte Gel wurde aus der Mischung durch Zentrifugieren gewonnen und intensiv mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. Das Gel wurde wie oben gewonnen, erneut in einer Lösung von PCC mit einem Gehalt an 500 mM NaCl suspendiert und 20 bis 30 Minuten gemischt. Das Verhältnis von PCC zu dem Gel betrug etwa 150 Faktor IX:C-Einheiten/ml Gel. Das Gel wurde durch Zentrifugieren oder Schwerkraftabsetzen gewonnen und der Überstand entfernt.
Aufeinanderfolgende Waschvorgänge mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, dann 100 mM NaCl, entfernten schwachgebundenes Protein und reduzierten die Ionenstärke. Faktor X konnte dann durch Waschen mit 10 mM Tris, 5 mM Glycin, 100 mM NaCl, pH 7,0, entfernt werden. Faktor IX wurde dann eluiert, indem man das Gel mit 10 mM Tris, 70 mM Glycin, 100 mM NaCl, pH 7,0, eluierte.

Beispiel 14

Gewinnung von Faktor IX aus Cu²&spplus;-angeregter, chelatisierender Sepharose unter Verwendung verschiedener Aminosäure- Elutionspuffer

Säulen von chelatisierender Sepharose wurden,wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben,mit Cu²&spplus;-Ionen angeregt und gewaschen. PCC (enthaltend 500 mM NaCl) wurde auf jede Säule beladen, woran sich ein Waschen mit Citrat-Phosphat- Puffer, pH 7,0, anschloß. Faktor IX wurde gewonnen, indem man mit 10 mM Tris, pH 7,0, enthaltend 70 mM einer Aminosäure, ausgewählt unter (a) nicht-polaren Aminosäuren (z.B. Alanin, Valin, Phenylalanin, Methionin), (b) polaren, ungeladenen Aminosäuren (z.B. Glycin, Serin, Tyrosin, Glutamin), (c) polaren, negativ geladenen Aminosäuren (z.B. Glutaminsäure) oder (d) polaren, positiv geladenen Aminosäuren (z.B. Lysin, Arginin), eluierte. Methionin, Glycin und Glutaminsäure erwiesen sich als besonders vorteilhaft, woboi diese Faktor IX-Ausbeuten von höher als 80% und spezifische Aktivitäten von Faktor IX von höher als 5 IE/mg ergaben.

Beispiel 15

Elution von Faktor X und Faktor IX aus chelatisierender Sepharose unter Verwendung von Methionin

Eine Säule von Cu²&spplus;-angeregter, chelatisierender Sepharose wurde mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. PCC wurde auf die Säule aufgebracht, die hiernach mit dem gleichen Puffer gewaschen wurde, bevor man die Ionenstärke durch Waschen mit einem 100 mM NaCl enthaltenden Puffer reduzierte. Hiernach wurde Faktor X mit Tris- Puffer, pH 7,0, enthaltend 2 mM bis 5 mM Methionin, eluiert. Die Faktor X-Aktivität war höher als 15 E/ml und die spezifische Aktivität betrug etwa 30 E/mg. Faktor IX war in der Faktor X-Fraktion auf etwa 0,5 Einheiten Faktor IX/Einheit Faktor X reduziert, und das Prothrombin war in einer Menge von weniger als 0,1 E/E Faktor X vorhanden.
Es zeigte sich, daß Faktor IX durch Waschen mit Tris-Puffer, enthaltend 10 bis 15 mM Methionin, eluiert wurde. Die Aktivität von Faktor IX war höher als 15 E/ml und er besaß eine spezifische Aktivität von etwa 20 E/mg. Prothrombin war in der Faktor IX-Fraktion nicht nachweisbar, und Faktor X war in einer Menge von weniger als 0,1 Faktor X-Einheit/Einheit Faktor IX vorhanden.

Beispiel 16

Elution von Faktor X und Faktor IX aus chelatisierender Sepharose unter Verwendung von Glutaminsäure

Man stellte eine Cu²&spplus;-angeregte, chelatisierende Sepharosesäule her, wusch und belud mit PCC und wusch wie für die Methioninelution beschrieben (Beispiel 15).
Faktor X wurde mit 10 mM Tris-Puffer, enthaltend 5 mM bis 10 mM Glutaminsäure, eluiart. Der Faktor X besaß eine spezifische Aktivität von 16 bis 22 E/mg.
Faktor IX mit einer spezifischen Aktivität von etwa 15 E/mg wurde hiernach eluiert, indem man die Glutaminsäure-Konzentration in dem Elutionspuffer auf 40 mM erhöhte.

Beispiel 17

Herstellung von Faktor IX und Faktor X unter Verwendung eines zunehmenden pH-Gradienten zur Elution aus chelatisierender Sepharose

Eine Säule von chelatisierender Sepharose wurde mit Cu²&spplus;- Ionen angeregt und mit Puffer bei pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. 500 mM NaCl enthaltendes PCC wurde auf die Säule beladen, die hiernach mit Puffer gewaschen wurde. Die Ionenstärke wurde auf 100 mM NaCl unter Verwendung eines Puffers mit geringem Salzgehalt von pH 7,0 reduziert. Etwas Faktor X wurde durch diesen Puffer mit einer spezifischen Aktivität von 10,5 E/mg eluiert.
Die Säule wurde allmählich durch einen pH-Gradienten von pH 7,0 bis pH 8,5 eluiert. Faktor IX und Faktor X wurden zwischen pH 7,1 und pH 7,9 bei spezifischen Aktivitäten von 27 E/mg bzw. 6 E/mg eluiert.

Beispiel 18

Herstellung der Faktoren IX, X und von Protein C unter Verwendung des pH und von Glycin für die Elution

Eine Säule von chelatisierender Sepharose wurde mit Cu²&spplus;- Ionen angeregt und mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,5, gewaschen. 500 mM NaCl enthaltendes PCC wurde auf pH 7,5 eingestellt und auf die Säule beladen, die mit Puffer gewaschen wurde. Die Ionenstärke wurde hiernach reduziert, indem man mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 100 mM NaCl, wusch. Dies führte zu einer Elution von Faktor X mit einer spezifischen Aktivität von 18 E/mg in einer Mischung mit Faktor IX, der eine spezifische Aktivität von 9 E/mg besaß. Eine kombinierte Protein C- (15 E/ml; 6,5 E/mg Protein) und Faktor IX- (12 E/ml; 5 E/mg Protein)-Fraktion wurde dann gesammelt, indem man mit 10 mM Tris, 5 mM Glycin, 100 mM NaCl- Puffer, pH 8,0, wusch.

Beispiel 19

Elution von Proteinkomponenten aus chelatisierender Sepharose unter Verwendung eines abnehmenden pH-Gradienten

Eine Säule von chelatisierender Sepharose wurde mit Cu²&spplus;- Ionen angeregt und mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. Hiernach wurde PCC nach Einstellung des pH auf 7,5 und von NaCl auf 500 mM aufgebracht. Hieran schloß sich die Verwendung des vorstehenden Puffers als Wäsche zur Entfernung von Faktor II an. 30% Faktor V sind das Ausgangsmaterial, das auch bei dieser Wäsche entfernt wurde. Hiernach wurde die Ionenstärke durch Waschen mit 100 mM NaCl enthaltendem Puffer reduziert. Dies entfernte auch Faktor X bei einer spezifischen Aktivität von etwa 15 E/mg Protein. Unter Verwendung der Citrat-Phosphat-Puffer wurde ein pH-Gradient während des Waschens der Säule von pH 7,5 bis pH 4,0 erzeugt. Man fand, daß Fraktionen gesammelt werden konnten, die an ausgewählten Proteinen reich waren. So wurde beispielsweise bei etwa pH 5,5 Faktor X weiter entfernt, während zwischen pH 5 und pH 5,6 weitere 40% von gebundenem Faktor V aus der Säule bei etwa fünf Plasmaäquivalenteinheiten/ml entfernt wurden.
In diesem pH-Bereich begann auch die Elution von inter-α- Trypsin-Inhibitor sowie von Protein C. Da der Puffer-pH auf 4,6 fiel, fand eine weitere inter-α-Trypsin-Inhibitor- und Protein C-Elution mit spezifischen Aktivitäten von 3,0 bzw. 4,6 Plasmaäquivalenteinheiten/mg Protein statt. Lediglich geringe Mengen an Faktor IX wurden während dieser Abschnitte des absteigenden pH-Gradienten eluiert.
Als der pH dann weiter beispielsweise auf pH 4,1 reduziert wurde, wurde Faktor IX bei Aktivitäten von höher als 40 E/ml und spezifischen Aktivitäten von höher als 30 E/mg Protein eluiert. Diese Fraktion enthielt keinen nachweisbaren Faktor II noch Faktor X. Protein C war bei etwa 0,01 E/E Faktor IX vorhanden, Faktor V war bei 0,06 E/E Faktor IX vorhanden und inter-α-Trypsin-Inhibitor war bei 0,03 E/E Faktor IX vorhanden. In Form ihrer Verunreinigung von einer Einheit Faktor IX bedeutet dies eine Reduktion an Protein C, Faktor V und inter-α-Trypsin-Inhibitor von 95%, 63% bzw. 90% gegenüber dem Ausgangsmaterial (PCC).

Beispiel 20

Verwendung von pH und Aminosäure zur Abtrennung von Proteinkomponenten aus chelatisierender Sepharose

Eine Säule von chelatisierender Sepharose wurde mit Cu²&spplus;- Ionen angeregt und mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. PCC, auf einen Gehalt von 500 mM NaCl eingestellt und mit einem pH von 7,5, wurde auf die Säule geladen, die dann mit dem oben beschriebenen Puffer gewaschen wurde. Eine weitere Wäsche mit Citrat- Phosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 100 mM NaCl, reduzierte die Ionenstärke und entfernte Faktor X, der mit einer Aktivität von zumindest 6 E/ml und einer spezifischen Aktivität von zumindest 15 E/mg Protein gesammelt werden konnte. Der pH wurde hiernach durch Waschen mit einem dritten Puffer, typischerweise Citrat-Phosphat, pH 4,5, enthaltend 100 mM NaCl, reduziert. Dies führte zu einer Entfernung von zumindest 55%, des verbliebenen, gebundenen inter-α-Trypsin-Inhibitors und von 24% des verbliebenen, gebundenen Proteins C, jedoch lediglich 5% an gebundenem Faktor IX. Die Säule wurde dann in einem Puffer mit einem pH und einer Salzkonzentration, wie sie für die Elution von Faktor IX geeignet waren, typischerweise pH 7,0, 100 mM NaCl, re-äquilibriert. Der Faktor IX wurde dann mit einem Aminosäure-Elutionsmittelpuffer, z.B. Glycin in Tris-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, eluiert. Dies ergab Faktor IX von 200 E/ml mit einer spezifischen Aktivität von höher als 50 E/mg Protein. Protein C war auch mit einer spezifischen Aktivität von 20 Plasmaäquivalenteinheiten/mg Protein vorhanden.
Verglichen mit dem PCC-Ausgangsmaterial, enthielt die Faktor IX-Fraktion signifikant verminderte Mengen an verunreinigenden Proteinen. Faktor II, Faktor X, Faktor V und inter- α-Trypsin-Inhibitor waren je Einheit Faktor IX bei Gehalten von 0,0005, 0,005, 0,002 bzw. 0,04 Einheiten vorhanden, und zwar verglichen mit Werten von 1,0, 1,0, 0,2 bzw. 0,4 in dem PCC-Ausgangsmaterial.

Beispiel 21

Herstellung von Faktor VII an Cu²&spplus;-angeregter, chelatisierender Sepharose

Eine Säule von chelatisierender Sepharose wurde mit Cu²&spplus;- Ionen beschickt, hiernach mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. Faktor VII-Konzentrat, hergestellt durch Elution von DEAE-Sepharose, adsorbiert mit Kryoüberstand oder Faktor IX-verarmtem Überstand, wurde auf einen Gehalt von 500 mM NaCl eingestellt und auf die Säule bei 50 bis 150 Faktor VII-Einheiten/ml Gel beladen. Nach dem Waschen mit dem vorstehenden Puffer wurde die Ionenstärke durch Waschen mit Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 100 mM NaCl, reduziert. Faktor VII wurde mit einer spezifischen Aktivität von mehr als einer Einheit je mg durch Waschen der Säule mit 10 mM Tris, 60 mM Glycin bei pH 7,0, enthaltend 100 mM NaCl, gewonnen.

Beispiel 22

Detergensbehandlung von Blutgerinnungsfaktoren während der Adsorption an chelatisierender Sepharose

Chelatisierende Sepharose wurde mit Cu²&spplus;-Ionen geladen, gewaschen und dann wie in Beispiel 1 beschrieben beladen. Die Säule wurde dann mit Citrat-Phosphat-Puffer bei pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, gewaschen. Die Säule wurde hiernach mit zumindest vier Bettvolumina des gleichen Puffers, enthaltend 1 Gew.% Natriumdodecylsulfat, zur Solubilisierung von Lipidkomponenten, die an das Gel gebunden waren, gewaschen. Danach wurde das Detergens aus dem Gel mit Citrat-Phosphat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, herausgewaschen. Diese Stufe diente auch der Reduktion der Ionenstärke durch Entsalzen. Faktor IX wurde hiernach aus dem Gel mit Glycin in Tris-Puffer, wie in Beispiel 7 beschrieben, eluiert. Unter Verwendung des gleichen Verfahrens kann das Natriumdodecylsulfat durch das gleiche Gewicht an Cholsäure oder Polyoxyethylen(20)-monooleat (Tween 80) ersetzt werden.

Beispiel 23

Gefriertrocknung und anschließende Wärmebehandlung der letzten Fraktionen der Beispiele 1 und 4 bis 7

Die Eluate der vorstehend angegebenen Beispiele wurden ohne Aktivitätsverlust gefriergetrocknet und dann 72 Stunden auf 80ºC zur Reduktion der potentiellen viralen Infektivität erhitzt. Im Gegensatz zu Anwesenheit von PCC wurde keine Bildung von Thrombin beim Erhitzen beobachtet. Die Faktoren II, IX und X zeigten gegenüber dem Erhitzen in unterschiedlichen Medien unterschiedliche Stabilitäten. Wurden die Eluate in Citrat und Wasser verdünnt, erhielt man nach dem Erhitzen Ausbeuten von 65 bis 90% der nichterhitzten Aktivität. Die Verdünnung in Tris ergab einen weitaus höheren Aktivitätsverlust, der für Faktor X größer war als für Prothrombin und für Faktor IX größer war als für Faktor X. Diese allgemeine Wirkung kann, wie nachstehend in den Beispielen 24 und 25 beschrieben, vorteilhaft verwertet werden.

Beispiel 24

Reduzierte Faktor IX-Aktivität in einem Konzentrat von Faktor X

Die vorstehenden Beispiele 4 und 6 beschreiben die Herstellung eines Faktor X-Konzentrats, wobei auch Faktor IX anwesend ist. Die Faktor IX-Aktivität kann bevorzugt durch Verdünnen der relevanten Faktor X-Fraktionen in 50 mM Tris- Puffer, pH 7,0, vor dem Gefriertrocknen reduziert werden. Alternativ kann zur Vermeidung einer Verdünnung der Eluat- Faktor X-Aktivität das Tris in dem Elutionspuffer auf 50 mM erhöht werden, so daß Faktor X in seinen Formulierungspuffer eluiert wird. Nach dem Gefriertrocknen kann dieses Material 72 Stunden auf 80ºC erhitzt werden. Die Faktor IX-Aktivität wird mehr als diejenige von Faktor X reduziert, so daß das Produkt mit höherer Spezifität als ein Faktor X-Konzentrat eingesetzt werden kann.

Beispiel 25

Wärmebehandlung von hochreinem Faktor IX-Konzentrat

Um höchstmögliche Ausbeuten an Faktor IX-Aktivität nach dem Erhitzen zu erhalten, wurde das in Beispiel 7 beschriebene Faktor IX-Eluat auf die gewünschte Endaktivität in Citrat oder Citrat-Phosphat-Puffern oder in Wasser verdünnt, gefriergetrocknet und hiernach 72 Stunden bei 80ºC wärmebehandelt. Der Elutionspuffer enthielt Tris, jedoch wurde die Wirkung desselben durch Auswahl der Fraktionen mit ausreichend hoher Faktor IX-Aktivität für ein wirksames Herauslösen der Tris-Komponente in den Endpuffer minimiert. Alternativ kann die Formulierung des Elutionspuffers modifiziert werden, um eine direkte Gefriertrocknung des unverdünnten Eluats zu ermöglichen.

Claims

1. Verfahren um Vitamin-K-abhängige Blutgerinnungsfaktoren aus einer zumindest einen derartigen Faktor enthaltenden Mischung zumindest teilweise abzutrennen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Mischung an ein Chelat eines mehrwertigen Metalls adsorbiert wird, das an einem inerten Träger immobilisiert ist, woran sich eine Elution anschließt, um eine oder mehrere hinsichtlich eines dieser Faktoren angereicherte Fraktionen zu erhalten.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung zumindest zwei Vitamin-K-abhängige Blutgerinnungsfaktoren enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Mischung ein Prothrombinkomplex-Konzentrat ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese Mischung einer mikrobiologischen Kultur entstammt, die einen durch rekombinante DNA-Technologie gebildeten Vitamin-K- abhängigen Blutgerinnungsfaktor enthält.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der inerte Träger immobilisiert hierauf chelatisierte Cu²&spplus;-Ionen aufweist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Cu²&spplus;-Ionen mit Iminodiessigsäuregruppen, die an einen Agarose- Träger über einen Spacer geknüpft sind, chelatisiert sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer 8 bis 16 Atome aufweist.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung an dem Chelat in Gegenwart einer wäßrigen Lösung adsorbiert wird, die 0,4 bis 1,0 M NaCl und/oder einen oder mehrere andere Elektrolyten zur Schaffung einer Lösung mit einer äquivalenten Ionenstärke enthält.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung 0,5 M NaCl und/oder einen oder mehrere andere Elektrolyten zur Schaffung einer Lösung mit einer äquivalenten Ionenstärke enthält.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung an dem Chelat in Gegenwart einer Pufferlösung bei pH 6,0 oder darüber adsorbiert wird.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Prothrombinkomplex-Konzentrat an einem Agarose-Träger wie in Anspruch 6 definiert über einen Zeitraum von mehr als 20 Minuten adsorbiert wird, um eine Faktor IX- Beladung von 100 bis 450 F.TX:Ag-Einheiten je ml Gel zu ergeben.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Adsorption der Mischung ein Waschen des Trägers zur Entfernung von gebundenem Faktor II vor der Elution irgendeiner Fraktion, die an einem gewünschten weiteren Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktor angereichert ist, anschließt.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Adsorption der Mischung eine Waschstufe anschließt, bei der zumindest die letzte Waschstufe mit einer Pufferlösung durchgeführt wird, die 100 - 200 mM NaCl und/oder einen oder mehrere weitere Elektrolyten für die Schaffung einer Lösung mit äquivalenter Ionenstärke enthält.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution von einem oder mehreren gewünschten Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren die an dem Träger adsorbiert sind, mit Hilfe eines pH-Gradienten erzielt wird.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution von einem oder mehreren gewünschten Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktoren, die an dem Träger adsorbiert sind, mit Hilfe einer Pufferlösung erzielt wird, die eine Aminosäure, ausgewählt unter Glycin, Methionin und Glutaminsäure enthält.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Elutionsstufe unter Verwendung einer Pufferlösung mit saurem pH umfaßt, um gebundenen Inter-α-Trypsin-Inhibitor spezifisch aus dem Träger zu entfernen.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Elutionsstufe ein Sammeln einer hinsichtlich Faktor IX angereicherten Fraktion, die im wesentlichen von dem Inhibitor und Faktor II frei ist, anschließt.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Faktor X-angereicherte Fraktion und/oder eine Faktor VII-angereicherte Fraktion und/oder eine Protein C-angereicherte Fraktion erhält, welche im wesentlichen von Faktor II frei ist/sind.

19. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Säulenchromatographie durchführt.

20. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Faktor IX zumindest teilweise aus einer Mischung abgetrennt wird, die Faktor IX und zumindest einen anderen Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktor enthält.

21. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Faktor IX zumindest teilweise aus einer Mischung abgetrennt wird, die Faktor IX und zumindest einen anderen Vitamin-K-abhängigen Blutgerinnungsfaktor enthält, und worin das chelatisierte mehrwertige Metall Kupfer ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, worin Faktor IX aus immobilisiertem chelatisierten Kupfer mit Hilfe einer Pufferlösung eluiert wird, die eine Aminosäure, ausgewählt unter Glycin, Methionin und Glutaminsäure enthält.