DE69326227T2

DE69326227T2 - Verfahren zur Isolation von hoch angereicherten Faktoren IX, X und II vom Prothrombin komplex oder menschlichem Plasma

Info

Publication number: DE69326227T2
Application number: DE69326227T
Authority: DE
Inventors: Silvana Arrighi; Maria Giuseppina Borri; Enzo Bucci; Francesco Norelli
Original assignee: ISI IST SIEROVACCINOGENO ITAL; Sclavo SpA
Current assignee: ISI IST SIEROVACCINOGENO ITAL; Sclavo SpA
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1993-03-22
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2013-03-23
Also published as: EP0617049B1; IT1262899B; ITFI920078A0; EP0617049A1; ES2138603T3; DE69326227D1; ITFI920078A1; US5378365A; ATE184018T1

Description

Verfahren zur Isolierung der hoch-gereinigten Faktoren IX, X und II aus dem Prothrombinkomplex oder Humanplasma

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung des Faktors IX, des Faktors X und des Faktors II aus Humanplasma oder Fraktionen davon, das (die) diese enthält (enthalten), durch wiederholte chromatographische Anionenaustauscher-Trennungen und anschließende Chromatographie an einem selektiven Adsorptionsharz. Bei dem Verfahren erhält man hoch-gereinigte Produkte.

Stand der Technik

Ein grundlegendes Verfahren zur Behandlung angeborener Störungen bei den Koagulationsfaktoren ist die Ersatztherapie, d. h. die intravenöse Verabreichung des Defizit-Faktors. Bei dem genannten therapeutischen Verfahren ist es erforderlich, daß Koagulations-Faktor-Konzentrate, die den Defizit-Faktor mit einer hohen Aktivität enthalten, in injizierbaren kleinen Volumina leicht zur Verfügung stehen. Die ständig steigende Bedeutung dieser Therapie machte es erforderlich, Verfahren zu entwickeln, welche die obengenannten Produkte in verbesserter Qualität und Reinheit liefern.
Die bisher angewendeten Verfahren [N. Wickerhauser, J. T. Sgouris: "Development of large scale fractionation methods. II. Isolation of a factor IX concentrate (prothrombin complex) for clinical use", Vox Sang., 22, 137-160 (1972); J. Heystek, H. G. J. Brummelhuis, R. W. Krijnen: "Contribution to the optimal use of human blood. II. The large scale preparation of prothrombin complex. A comparison between two methods using the anion exchangers DEAE-cellulose DE- 52 and DEAE-Sephadex A-50", Vox Sang., 25, 113-123 (1973); H. Suomela, G. Myllyla, E. Raaska: "Preparation and properties of a therapeutic factor IX concentrate", Vox Sang., 33, 37-50 (1977); J. P. Miletich, G. J. Broze, P. W. Majerus: "Purification of human coagulation factors II, IX and X using sulfated dextran beads", Meth. Enzymol., 80, 221-228 (1981)] basieren im wesentlichen auf chromatographischen Verfahren, die Konzentrate mit unterschiedlicher Reinheit ergeben, die aus verschiedenen Vitamin-K-abhängigen Proteinen bestehen: dem Faktor II (Prothrombin), dem Faktor VII (Proconvertin), dem Faktor IX (Christmas-Faktor), dem Faktor X (Stewart-Prower-Faktor), die bekannt sind als Prothrombin-Komplex-Faktoren. Derzeit werden die obengenannten Konzentrate üblicherweise zur Behandlung von Defiziten an den Faktoren II, IX und X verwendet.
Innerhalb des hämophilen Syndrom-Bereiches (Hämophilie A oder Defizit an Faktor VIII, Hämophilie B oder Defizit an Faktor IX, Hämophilie C oder Defizit an Faktor XI) ist die Hämophilie B die zweitwichtigste, was die Anzahl der Fälle angeht, und - ähnlich wie die Hämophilie A - eine der schwerwiegendsten wegen des häufigen Auftretens von Hämorrhagien.
Die Verabreichung von Prothrombin-Komplex-Konzentraten an Patienten, die unter Hämophilie B leiden, über einen langen Zeitraum hinweg, kann eine Hy perkoagulabilität und eine disseminierte intravasculäre Koagulation (DIVC) hervorrufen, wahrscheinlich verursacht durch eine Überdosierung mit den Faktoren II und X und/oder durch die Anwesenheit von Spurenmengen an aktivierten Faktoren, wie IXa, Xa und IIa. Es bestand daher das Bedürfnis, reine Konzentrate der einzelnen Faktoren herzustellen.
Unter den insoweit entwickelten neuen Verfahren basieren einige auf der Immunoaffinitäts-Chromatographie [H. Bessos, C. V. Prowse: "Immunopurification of human coagulation factor IX using monoclonal antibodies", Thromb. Haemostasis, 56, 86 (1986); K. Smith: "Immunoaffinity purification of factor IX from commercial concentrates and infusion studies in animals", Blood, 72, 1269 (1988); J. Tharakan, D. Strickland, W. Burgess, W. N. Drohan, D. B. Clark: "Development of an immunoaffinity process for factor IX purification", Vox Sang., 58, 21-29 (1990)]. Die genannten Verfahren liefern ein Produkt mit einer hohen spezifischen Aktivität, das jedoch durch Viren und heterologe Proteine verunreinigt sein kann. Daraus folgt, daß das nach den obengenannten Verfahren erhaltene Produkt weiter gereinigt und vor der Verwendung kontrolliert werden muß, um es auf die Anwesenheit von Kontaminanten, falls solche vorhanden sind, zu prüfen.
Es wurden deshalb Verfahren entwickelt, die Produkte mit einer hohen spezifischen Aktivität und einer hohen Reinheit ergeben, ohne mit den obengenannten Mängeln behaftet zu sein [C. Michalski, F. Bal, T. Burnouf, M. Goudemand: "Large-scale production and properties of a solvent-detergent-treated factor IX concentrate from human plasma", Vox Sang., 55, 202-210 (1988); T. Burnouf, C. Michalski, M. Goudemand, J. J. Huart: "Properties of a highly purified human plasma factor IX:C therapeutic concentrate prepared by conventional chromatography", Vox Sang., 57, 225-232 (1989)].
In den obengenannten Verfahren werden Anionenaustauscher verwendet, wobei die Endstufe die Affinitäts-Chromatographie ist, die auf einer stationären Phase basiert, die mit sulfatierten Verbindungen wie Heparin funktionalisiert worden ist.
In WO/05650 ist allgemein die Verwendung eines Cu²&spplus;-Chelatharzes für die Abtrennung von Vitamin K-abhängigen Blutgerinnungs-Faktoren beschrieben.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt einen hoch-gereinigten Faktor IX (mit einer spezifischen Aktivität von höher als 100 I. U./mg Protein), der frei von den anderen Faktoren des Prothrombin-Komplexes (PTC) ist, und Isolate der hochgereinigten Faktoren II und X durch zwei aufeinanderfolgende chromatographische Ionenaustausch-Trennungen (bei Salz-Konzentrations- und pH- Bedingungen, welche die Entfernung der meisten Verunreinigungs-Proteine und insbesondere einiger PTC-Komponenten erlauben), woran sich die Adsorptions-Chromatographie an einer mit Metallionen (insbesondere Kupferionen) derivatisierten Matrix anschließt.
Die erfindungsgemäße Reinigung wird durchgeführt durch diskontinuierliche (absatzweise) PTC-Adsorption aus Plasma und/oder Fraktionen davon an einem Anionenaustauscherharz (beispielsweise DEAE-Sephadex A-50) und unter Verwendung von Phosphatpuffern: TL1 (0,02 M dibasisches Natriumphosphat, 0,02 M monobasisches Kaliumphosphat, 0,16 M Natriumchlorid) bei pH 6,9 ± 0,1 für das Waschen des Harzes; TE1 (0,1 M dibasisches Natriumphosphat, 0,1 M monobasisches Kaliumphosphat, 0,8 M Natriumchlorid) und TE2 (0,05 M dibasisches Natriumphosphat, 0,05 M monobasisches Kaliumphosphat, 0,4 M Natriumchlorid) bei pH 6,9 ± 0,1 zum Eluieren der obengenannten Proteine. Die PTC-Lösung wird nach der dreistufigen Elution mit DEAE- Sephadex, die in geeigneter Weise stabilisiert, verdünnt und filtriert worden ist, einer viralen Inaktivierung durch chemische Agentien, beispielsweise 0,3% TNBP und 1% Tween 80, unterworfen und mindestens 6 h lang unter Rühren bei 24ºC damit in Kontakt gehalten. Die inaktivierte PTC-Lösung wird nach der Kontrolle und der Wiedereinstellung der geeigneten Salz-Konzentrationen, falls erforderlich, auf 0-5ºC abgekühlt, filtriert und auf eine DEAE-Sepharose Fast Flow enthaltende Kolonne aufgegeben, die mit einem Phosphat/Citratpuffer (5 mM Natriumcitrat, 2,5 mM dibasisches Natriumphosphat, 2,5 mM monobasisches Kaliumphosphat), der 0,19 M Natriumchlorid enthält (TL2), bei einem pH-Wert in dem Bereich von 6 bis 6,5 konditioniert worden ist. Bei diesem Arbeitsgang wird eine Strömungsgeschwindigkeit von 45-65 cm/h und eine Beladung mit von 20-40 I. U. Faktor IX pro ml Harz angewendet.
Die zur Inaktivierung von Viren verwendeten Tenside und die meisten nichtgebundenen Proteine werden bei dem Durchlauf und durch Waschen des Harzes mit etwa einem Kolonnenvolumen TL2 entfernt. Die schwach gebundenen Proteine und etwa 70% des Faktors X werden durch Waschen des Harzes mit mindestens 18 Kolonnenvolumina Phosphat/Citratpuffer, der 0,26 M Natriumchlorid enthält (TL3) bei pH 6,1 ± 0,1 eluiert. Der Faktor X wird mit einer Reinheit von etwa 20 I. U./mg Protein gewonnen.
Das Produkt, das den Faktor IX enthält, wird dann mit mindestens 5 Kolonnenvolumina Phosphat/Citratpuffer, bestehend aus 0,28-0,36 M (vorzugsweise 0,29 M) Natriumchlorid (TE4), bei pH 6,1 ± 0,1 eluiert. Die erhaltene Lösung, die den Faktor IX mit einer spezifischen Aktivität enthält, die im allgemeinen in dem Bereich zwischen 5 und 15 I. U./mg Proteine liegt, wird in geeigneter Weise stabilisiert, gegen den Puffer TD1 (20-100 mM - vorzugsweise 50 mM- Natriumacetat, 0,2-1 M - vorzugsweise 0,5 M - Natriumchlorid) bei pH 7,2 ± 0,2 ultrafiltriert, dann filtriert und danach auf eine Kolonne aufgegeben, die Kupferionen enthält, die auf Sepharosegel als Träger aufgebracht sind, und mit dem Puffer TD1 konditioniert worden ist. Bei diesem Arbeitsgang wird eine Strömungsgeschwindigkeit von 20-60 cm/h und eine Beladung mit 30-100 I. U. Faktor IX pro ml Gel angewendet.
Die Kolonne wird zuerst mit einem Volumenteil TD1 gewaschen, um kontaminierende nicht-gebundene Proteine zu entfernen, und dann wird sie mit 8 bis 10 Volumenteilen Puffer TL4 (Puffer TD1, der 40-80 mM - vorzugsweise 60 mM - Glycin enthält) bei pH 7,2 ± 0,2 gewaschen, um weitere schwach gebundene Proteine und insbesondere die Faktoren II und X zu eluieren. Dann wird der Faktor IX mit dem Puffer TE5 (50 mM Natriumacetat, 500 mM Natriumchlorid, 0,08-0,12 M - vorzugsweise 0,1 M - Glycin) bei pH 7,2 ± 0,2 eluiert.
Die die jeweiligen Faktoren enthaltenden Eluate werden stabilisiert, diafiltriert, eingeengt, filtriert und gefriergetrocknet.
Weitere Vorteile und Charakteristika der Erfindung gehen aus dem nachfolgenden Beispiel hervor, das die Erfindung lediglich erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel

Stufe 1

Eingefrorenes frisches Humanplasma (etwa 1000 l) wurde unter kontinuierlichem Rühren und Trockenzentrifugieren bei 0 bis 5ºC aufgetaut. Der Niederschlag, eine Kryopaste, wurde gesammelt. Sie kann beispielsweise für die Reinigung des Faktors VIII verwendet werden.
Das überstehende Plasma wurde auf 0 bis 1ºC abgekühlt, der pH-Wert wurde mit einem 1 M Acetatpuffer auf 6,9 eingestellt.
Die PTC-Faktoren wurden an einem Anionenaustauscherharz, d. h. an DEAE- Sephadex A-50 (das vorher in TL1 gequollen und sterilisiert wurde) adsorbiert, dem Plasma in einem Verhältnis von 1,5 g trockenem Harz/l Plasma zugesetzt und unter Rühren etwa 45 min lang bei 1 bis 3ºC in Kontakt gehalten. Nach der obengenannten Kontaktzeit wurde das Harz einige Stunden lang absitzen gelassen. Dann wurden nach dem Dekantieren des überstehenden Plasmas, das abgetrennt und zur Gewinnung von Antithrombin III-, Gammaglobulin-, Albumin- und ähnlichen Konzentraten weiter fraktioniert wurde, die zurückbleibende Suspension, die aus dem Plasma-Rückstand + Harz + PTC bestand, gesammelt. Der Plasma-Rückstand und die nicht-gebundenen Proteine wurden durch Waschen des Harzes mit einem TL1-Puffer-Volumen von etwa 2/3 des anfänglichen Plasma-Volumens bei 4ºC entfernt.
Die PTC-Faktoren (d. h. der Faktor IX, der Faktor X, der Faktor II und Spurenmengen an Faktor VII), die an dem Harz adsorbiert waren, wurden zuerst mit einem Puffer TE1-Volumen von etwa 1/10 des anfänglichen Plasma- Volumens, dann zweimal mit TE2, jedesmal mit einem TE2-Volumen von etwa 1/10 des anfänglichen Plasma-Volumens, eluiert.
Die eluierte PTC-Lösung (50 bis 60% Ausbeute und spezifische Aktivität 1-2 I. U. Faktor IX/mg Protein) wurde in einem geeigneten Behälter gesammelt und durch Zugabe von Heparin in einer Konzentration von 0,75 Einheiten/ml Lösung stabilisiert. Die Osmolarität wurde wiederhergestellt durch Diafiltration oder Verdünnen mit H&sub2;O, das mit Stabilisator versetzt war, und die Lösung wurde unter sterilen Bedingungen filtriert.

Stufe 2

Die in der Stufe 1 erhaltene Lösung wurde unter Anwendung konventioneller Verfahren mit einem Gemisch von Tensiden, insbesondere TNBP in einer Konzentration von 0,3% und Tween 80 in einer Konzentration von 1%, versetzt und unter schwachem Rühren 6 h bei 24ºC damit in Kontakt gehalten.

Stufe 3

Die inaktivierte PTC-Lösung wurde kontrolliert, der pH-Wert wurde auf 6,1 ± 1 eingestellt und die physiologischen Salzkonzentrations-Bedingungen wurden wiederhergestellt. Dann wurde die Lösung auf etwa 4ºC abgekühlt, durch Klärungs-Membranen filtriert und auf eine Kolonne, die etwa 15 bis 20 l DEAE- Sepharose Fast Flow (das vorher mit TL2 bei pH 6,1 ± 0,1 konditioniert worden war) enthielt, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 55 cm/h aufgegeben. Die nicht-adsorbierten Proteine wurden durch Auswaschen des Harzes mit einem Volumenteil TL2 entfernt; die schwach gebundenen Proteine und der größte Teil des Faktors X wurden durch Waschen der Kolonne mit 18 Volumenteilen TL3 entfernt.
Der Faktor IX, ein Teil des Faktors II und ein Teil des Faktors X wurden mit 5 Kolonnenvolumina TE4 eluiert. Die Ausbeute betrug 60 bis 70% und die spezifische Aktivität betrug etwa 10 I. U. Faktor IX/mg Protein. Nach dem Einengen auf 1/10 des Anfangsvolumens wurde die Lösung über 30000 d- Ausschluß-Membranen gegen 2,5-4 Volumina TD1 diafiltriert.

Stufe 4

Die ausreichend eingeengt PTC-Lösung wurde durch Klärungs-Membranen filtriert und auf eine Kolonne aufgegeben, die mit Kupferionen derivatisierter Chelatbildungs-Sepharose, die vorher in TD1 konditioniert worden war, gefüllt war. Bei dem Arbeitsgang wurden eine Strömungsgeschwindigkeit von 30 cm/h und eine Beladung mit 50 I. U. Faktor IX pro ml Harz angewendet.
Die nicht-adsorbierten Proteine wurden durch Auswaschen mit einem Kolonnenvolumen TD1 entfernt. Der Faktor II und der Faktor X-Rest wurde mit TL4 eluiert; genauer wurde der Faktor II in den zweiten, dritten und vierten Kolonnen-Waschfraktionen gesammelt und der Faktor X-Rest wurde in den sechsten, siebten und achten Waschfraktionen gesammelt. Der Faktor IX wurde mit TE5 eluiert und es wurden etwa 4 Kolonnen-Waschfraktionen gesammelt. Die Ausbeute betrug etwa 75% der aufgegebenen I. U.
Das den Faktor IX mit einer spezifischen Aktivität von etwa 100 I. U./mg Protein enthaltende Eluat wurde auf 50 I. U. ml eingeengt, gegen 5 Volumina auf einem 30000 d Ausschluß-Ultrafilter diafiltriert, um die physiologischen Bedingungen wieder herzustellen, durch Zugabe von 0,03 I. U. Antithrombin III pro I. U. Faktor IX in geeigneter Weise stabilisiert, unter sterilen Bedingungen filtriert, in Phiolen gegossen und gefriergetrocknet.
Die Ausbeute an Faktor II und Faktor X betrug 60% der aufgegebenen Menge; die spezifische Aktivität des Faktors II betrug etwa 30 I. U./mg Proteine und diejenige des Faktors X betrug 20 I. U./mg Proteine. Die Eluate wurden auf 50 I. U./ml eingeengt, diafiltriert, in geeigneter Weise stabilisiert, unter sterilen Bedingungen filtriert und gefriergetrocknet.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung des Faktors IX, des Faktors II und des Faktors X aus Humanplasma, bei dem:

a) das überstehende Plasma nach der Kryopasten-Zentrifugierung und Entnahme gereinigt wird durch Adsorption an einem Anionenaustauscherharz und das adsorbierte Produkt weiter eluiert wird;

b) das in der Stufe (a) gesammelte Produkt einer viralen Inaktivierung unterworfen und filtriert wird und die dabei erhaltene Lösung erneut auf eine Anionenaustauscherkolonne aufgegeben wird; die nicht- oder nur schwach adsorbierten Proteine (unter ihnen der Faktor X) jeweils mit einem Puffer, bestehend aus 5 mM Natriumcitrat, 2,5 mM dibasischem Natriumphosphat und 2,5 mM monobasischem Kaliumphosphat, enthaltendend 0,19 M Natriumchlorid, mit einem pH-Wert in dem Bereich von 6 bis 6,5, und mit einem Puffer, bestehend aus 5 mM Natriumcitrat, 2,5 mM dibasischem Natriumphosphat, und 2,5 mM monobasischem Natriumphosphat, enthaltend 0,26 M Natriumchlorid, mit einem pH-Wert von 6,1 ± 0,1, gewaschen werden und schließlich die adsorbierten Produkte (unter ihnen der Faktor IX) mit einem Phosphat/Citratpuffer, der 0,28 bis 0,36 M Natriumchlorid enthält, bei einem pH- Wert von 6,1 ± 0,1 eluiert wird; und

c) das in der Stufe (b) erhaltene Produkt eingeengt und diafiltriert und die erhaltene Lösung durch eine mit Kupferionen derivatisierte Kolonne fließen gelassen wird, die mit 20 bis 200 mM Natriumacetat, 0,2 bis 1 M Natriumchlorid bei pH 7,2 ± 0,2 konditioniert worden ist, und die nicht-gebundenen Proteine durch Waschen mit dem obengenannten Puffer entfernt werden; wonach der Faktor II durch Eluieren mit 20 bis 100 mM Natriumacetat, 0,2 bis 1 M Natriumchlorid, 40 bis 80 mM Glycerin bei pH 7,2 ± 0,2 gesammelt wird; der Faktor X nach dem Eluieren des Faktors II unter Verwendung des gleichen Puffers gesammelt wird und schließlich der Faktor IX durch Eluieren mit 50 mM Natriumacetat, 500 mM Natriumchlorid und 0,08 bis 0,12 M Glycin bei pH 7,2 ± 0,2 gesammelt wird.