DE1442093A1 - Verfahren zur Herstellung und Reinigung einer stabilen Lipase-Zubereitung - Google Patents
Verfahren zur Herstellung und Reinigung einer stabilen Lipase-ZubereitungInfo
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Description
DR. MÜLLER-BOR£ DIPL.-ING. GRALFS Dr. MANITZ 1442093
24. April 1964
Dr. Expl.
Bg/Kp - F 1?8
Juichiro JFukumoto, No. 4-227 Kirihata,
Nagoyama, -iEakarazuka, Japan.
Toshio Tsujisaka, No. 21,, 1-chome,
Tamade-Hondori, Nishinari-ku, Osaka, Japan.
Mieko Iwai, No. 1.1, 3-chome, Haramicho,
Ikuno-ku, Osaka, Japan.
Verfahren zur Herstellung und !Reinigung einer stabilen Lipase-Zubereitung
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
einer stabilen Lipase-Zubereitung.
f Lipase ist genau wie andere hydrolytische Enzyme in
Medizin und Industrie von großer Bedeutung. Sie kann
z. B. bei der Behandlung von Verdauungsstörungen des Menschen und zur Verbesserung von ölen, fetten und
anderen Nahrungsmitteln verwendet werden. Aber ihre gewerbsmäßige Anwendung erfolgt in beschränkterem
Maße als die anderer hydrolytischer Enzyme,- was"auf
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ihre Instabilität bei der Reinigung und Lagerung zurückzuführen ist, Ferner ist diese Beschränkung der
Gewinnung der Lipase zuzuschreiben, denn das im Handel
erhältliche präparat ist zum größten Teil tierischer oder pflanzlicher Herkunft.
Wir haben gefunden, daß die Instabilität der Lipase hauptsächlich einer Enzymwirkung der als Verunrei?-
nigung vorhandenen protease zuzuschreiben ist*
Andererseits haben wir festgestellt, daß bei der Kultivierung von Rhizopus delemar: in flüssigem Medium Lipase erzeugt wird und daß die Erzeugung von Protease
bei dieser Kultivierung durch Einstellung eines
bestimmten Stickstoff- und Kohlenstoffgehalts in dem
Medium gesteuert werden kann. Unsere iTersUche haben
ergeben, daß Rhizopus delemar eine große Menge Pro-»
tease erzeugt, wenn die Kultivierung in einem flüssigen Medium mit niedrigem Stickstoffgehalt und verhältnismäßig hohem Kohlenstoff gehalt erfolgt. Wenn
dagegen der Stickstoffgehalt hoher oder der Kohlenstoff ge halt geringer ist, so nimmt die Erzeugung von
Protease" ab. Wir haben ferner gefunden, daß die Slidung von Protease ohne Beeinflussung der Erzeugung
von Lipase.· im· wesentlichen unterdrückt werden kann^
wenn die Kultivierung .von Rhizqpüs delemar in einem .
Medium erfolgt j das etwa 0*5 Ms:lr5 :$ äidcsfoff liefernder
Substanzenals Blement berechnet, und
_ 3 —
etwa 0,4- bis 1,5 % kohlenstoffliefernder Substanzen,
als Element berechnet, sowie eine geringe Menge anorganischer Substanz bei einem pH-Wert von 5>0 bis
6,0 enthält (Tabelle I).
Wir haben ferner gefunden, daß Lipase während der Reinigung oder der Lagerung leicht durch Bisenionen
inaktiviert werden kann. Diese Inaktivierung erfolgt
nach unseren Beobachtungen schnell, wenn während der Herstellung mehr als etwa 0,5 ppm Bisenionen
zugegen sind. Mit fortschreitender Reinigung werden bei höheren ppm an Eisen immer größere Anteile der
Lipase inaktiviert (Tabelle II). Wir haben dementsprechend festgestellt, daß die Konzentration an
Eisenionen während der Herstellung niedriger als 0,5 ppm gehalten werden sollte.
Erfindungsgemäß wird Rhizopus delemar auf ein wässriges
Nährmedium geimpft, das 0,5 bis 1,5 % stickstoff liefernder Substanzen (berechnet als elementarer
Stickstoff), 0,4 bis 1,5 % kohlenstoffliefernder
Substanzen (berechnet als elementarer Kohlenstoff) und eine kleine Menge anorganischer Substanz wie
z. B. KH^PO/j.» MgSO^ u. a. bei einem pH-Wert von etwa
5»O bis etwa 6,0 enthält* Als Stickstoffquelle dienen
z. B. Peptone, Sojabohnenejttrakt oder Getreidekeimflüssigkeit,
als Kohlenstoffquelle Glucose, Sucrose
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oder lösliche Stärke. Die Kultur wird 2-4 Tage läng bebrütet, was vorzugsweise bei einer Temperatur von
25 - 55°O geschieht. Die .Konzentration an Eisenionen
in dem Medium wird geringer als 0,5 ppm gehalten. Wenn
erfindungsgemäß der pH-Wert des Mediums am Anfang auf ■
etwa 5,5 eingestellt wird," so steigt er nach der Kultivierung
auf etwa 6,5 bis etwa 8r5 an.
Die Gewinnung der Lipasefraktion aus dem Kulturmedium
geschieht in üblicher Weise durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat» Die KuItürflüssigkeit wird also filtriert und das Filtrat mit Ammöniumsulfat' versetzt.
: ist, ■
"Wenn ein Sättigungsgrad von 0,55 "bis 0*65 erseicht/i""^
wiM die erhaltene Ausfällung abgetoennt. Das produkt
enthält mehr als 95 % der Gesamt-Lipaseaktivität des
Ausgangsmaterials.
Die so gewonnene rohe Enzymzubereitung wird erfindungsgemäß weiter gereinigt. Das Rohprodukt wird in
Wasser gelöst und die erhaltene Lösung zur Abtrennung von Ammöniumsulf at entsalzt. Dies kann durch
Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von "SEPHADEX" geschehen. Wenn^das Kulturfiltrat ei?wa\
die ZiUgelassene Menge Eisenionen enthalt, so wird
die Dialyse möglichst gegen reines Wasser durchgeführt, das etwa 0,0001 Mol Chelatisiefungsmittel
wie z. B. liatriumcitrat oder EDM enthalt. Durch ,'
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diese Behandlung werden fast alle Eisenionen entfernt,
wobei ein Dialysat zurückbleibt, das einen Gehalt an
Bisenionen von weniger als 0,01 ppm aufweist. Die erhaltene Lösung wird auf einen pH-Wert von etwa 4-, 5
bis etwa 6*0 eingestellt und durch ein schwaches
Anionenaustauscherharz wie z. B. Duolite A-2/geschickt,
wobei die größte Menge der Proteinstoffe und anderen Verunreinigungen an dem Harz adsorbiert werden.
Die so behandelte Lösung wird nun mit einem schwachen K&tionenavustauscher zur Absorbierung der Lipasefraktion
in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert vorher mit Hilfe einer organischen Säure wie 1/50 bis 1/100
molarer wässriger Essigsäure auf etwa 5»5 bis etwa 5»0
Eingestellt worden ist. Als schwache Eationenaustauscher
eignen sich ü. a» Amberlite IRG-50, Duolite
GS-IOl, SE-SEPHADEX und Carboxymethylcellulose ^ Di·
gereinigte Lipaselösung wird in der Weise gewonnen,
# daß man den Ionenaustauscher mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 oder einer 0,2 - 0,4 #igen
wässrigen Lösung eines neutralen anorganischen Salzes wie z. B. Natriumchlorid, Ammoniumsulfat u. a. eluiert·
Es wird nun ein organisches Lösungsmittel wie Methanol,
Äthanol oder Aceton in großem Überschuß zu der so gewonnenen
Lipaselösung zugegeben und der erhaltene Niederschlag getrocknet, wobei eine gereinigte "Xipase als
,Pulver erhalten wird. Die Gesamtausbeute an Lipase-
809809/0712 -
aktivität beträgt etwa 40.- 30 % der berechneteji Menge
auf die des Kulturmediums. Erfindungsgemäß ist nicht
nur Rhiζopus delemar'zur Erzeugung von Lipase brauchbar,
sondern es können auch andere Stämme der Gattung Rhizopus
wie Rhizopus formosensis, Rhizopus chinenses und Rhizopus nigricans mit befriedigendem Erfolg benutzt
werden.
■-..■■- ·■ - ' ■ - t - - - Versuch 1
^
Rhizopus delemar wurde 3 Tage lang bei 280O auf einem
wässrigen Hährmedium submers kultiviert, das pepton
Glucose in den in der Tabelle unten angegebenen Mengen, enthielt. Ferner enthielt das Medium 0,1 % HaNO,,
0,1 % KH2PO^ und 0,05 % MgSO4* Anschließend wurde die
Kultur durch Erhitzen im Autoklaven sterilisiert, In der Tabelle I sind die Eulturbedingungen und die Ergebnisse
aufgeführt, (10 % Pepton entsprechen;'etwa
-1,0 % elementarem Stickstoff)· .
| Glucose % |
pH | Kultur- filtrat |
Lipaseaktivität" (Einheiten/ml) |
nach. 5 Ta gen |
Protease- aktivität Xu/ml) |
|
| Zusamme nsetzung des Kulturmediums |
5 | Medium | 4,8 | unmittelbar- nach der Kultivierung |
5 | unmittelbar nach der Kultivierung |
| Pepton % |
3 | 5,5 | 5,4 | 7b | 350 | |
| 3 | 2 | ti | 6,5 | 112 | 340 | 235 |
| 5 * | 2 | Il | 7,4 | 350 | 715 | 7 |
| 5 | 3 | Il | 7,6 | 715 | 740 | 0 |
| 7,5 | 2 | Il | 8,0 | 740 | 635 | 0 |
| 10 | 1 | Il | . 8,3 | 650 | 175 | 0 |
| 10 | Il | 188 | 0 * |
|||
| 10 |
Versuch II
Um die Inhibitionswirkung von Bisenionen auf die Lipaseaktivität
zu veranschaulichen, wurde der folgende Versuch
durchgeführt. Jede probe wurde 60 Minuten in Gegenwart von Bisen(II)ionen (Ferrosulfat) der in der Tabelle aufgeführten Konzentration stehengelassen» anschließend wurden die noch vorhandenen jtripaseaktivitäten bestimmt. ,
durchgeführt. Jede probe wurde 60 Minuten in Gegenwart von Bisen(II)ionen (Ferrosulfat) der in der Tabelle aufgeführten Konzentration stehengelassen» anschließend wurden die noch vorhandenen jtripaseaktivitäten bestimmt. ,
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle il wiedergegeben.
809809/0712
| Ie+4: Gehalt (ppm) ...■■■"; | O | I . . ;. Zuruck-blel'be.nde Lipasaktivität 3 (Einheiten/ml) I |
■ · -B | σ |
| - | -.- -·..-..■■ .1; ■:- . | 150 | 170 ; | |
| ' ■ ' 0,3 -;..--■..;- :, s | 180 | ■ ; 14-9 | ■'- T7ör:v'-■-" | |
| ; '■;■ :■ %o ·: ";;■■' ■■■■·■"· | ;■■■■■■.■■'-"■"■ 18G | 150 | ||
| 2*0Ν ; 7 ; ■:-·-. | : : ." 178- - | :'; '58 | 44 | |
| 7, ■ """5*p '-■"■·■; -v - : | ■ -·.;■· ·■ 1^2; - | 7- ■■-.•14 ; | 11 | |
| 0 | ||||
| ■\:--.;'V'-.--ä:-.'^ |
Probe A: Verdünntes KuIturfiltrat, hergestellt durch
Kultivierung von Ehizopus delemar auf dem int
Beispiel. 1 beschriebenen Medium. (Lipase
Probe B: Wässrige Lösung einer rohen Lipasefraktion, hergestellt
duröh"Fraktionierung der oben beschrie-•benen
Probe' !"mit Ammoniumsulfät. (Lipase
150 Einheiten^!.) Λ-Λ : '■""'-';[
Probe G; Gereinigte Lipäsefraktion, hergestellt durch
Reinigung derebbeii beschriebenen Probe B mit
Hilfe^-von ioneiiaüstaüscherh und Dialyse.
(Lipase 17Ö Einheiten/ml»)
809809/0712
[Definition der Enzymeinheiten
Lipase: Bine -Einheit der Enzymaktivität wird als die
Aktivität definiert, die eine 14 mg ölsäure äquivalente Menge Fettsäure erzeugt, wenn 2 g
Olivenöl mit dem Enzym bei pH.5,6 und 30°G
150 Minuten verseift werden.
Protease j Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die
Aktivität definiert, die 10 !"Aminosäure oder ^in TriChloressigsäure lösliches Petid (berechnet
als Tyrosin) erzeugt, wenn 3 ml einer 1%igen Lösung von Milchcasein bei pH 3» 7
40 0 10 Minuten mit dem Enzym hydrolysiert werden·
Ein Stamm Rhizopus delemar*wurde auf das folgendermaßen
zusammengesetzte wässrige Medium geimpft:
Glucose 2 %
.,. 0f1 % . .
v. 0*05 %'..'■ ■.-:-'■ z"
Pepton . "3 ' 7 °/o . '■■ , ■
:\S-. ,0,15 ppm ... ■,·;■ ,v ,,·;/
ORIGINAL IMSPECTED
1442Ö93
- ίο - -
und drei Tage bei 28°C unter Schütteln bebrüte-t. Das
Kulturmedium, das 700 Einheiten/ml.Lipase·enthielt, ' wurde
filtriert und das !"iltrat" (Probe Ä-in-TersuGh II)
mit Ammoniumsulfat bei einem Fe++ Gehalt von 0,8 ppm
fraktioniert. Die bei einem Sättigungsgrad von O
erhaltene Ausfällung wurde abgetrennt, in Wasser gelöst
und die Lösung (probe B in Versuch II) zur Entfernung
Ammoniumsulfat dialysiert.- Das Dialysat wurde, 'auf pH 5»0
gebracht und durch eine Säule.'" mit" einem schwachen Anionenaustauscherharz
geschickt (Duolite A-2). Die erhaltene Lösung mit 80 % Lipäseaktivität bezogen auf das
Ausgangsmaterial wurde mit Hilfe einer 1/50 molaren wässrigen Essigsäure auf pH 4,5 gebrächt und dann durch
eine säule mit einem schwachen Kationenaustauscherharz geschickt (Amberlite IRC 50)· Das Harz wurde mit wässrigen
NaCl-Lösungen sukzessiv steigender Konzentration eluiert. Die bei 0,2-0,4 /1 FaCl erhaltenen Fraktionen
wurden gesammelt und dialysiert (probe C in Versuch II)·
Zum Dialysat wurde Methanol zugesetzt, der erhaltene Niederschlag bei 1O0Q5 ab£ilt?3&ert und bei niedriger- Tem>peratur
getrocknet. Das so erhaltene Enzympulver besaß eine Aktivität, die 50>% der des"Ausgangsmaterials betrug
und zeigte eine 500 mal so^hohe,Lipasewirksamkeit
wie die 'des Kul-6urfiitrats\ ^^zogen aur den Proteingehalt. Es ,wurde zu den vorhergehend beschriebenen Operationen
Aesfcilliertea Wasser mil? weniger, als Οί-1/ ppm
Fe++ verwendet, " . i/
' -' ■ 'r Ji * ,'' 1^ ' ' ! ORfGiNAL JNSPECTED
Claims (1)
14^2093
- 11 Pate ntansprüche
ep φά$- Herstellung einer stabilen Idpase-Zuberei-
tung,dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus
der Gattung Shizopus auf einem wässrigen Nährütedium, das
Oi5,bis,1,5% stickstoffliefernder Substanzen, berechnet
als elementarer Stickstoff, 0,4- bis 1,5# kohlenstoff liefernder
Substanzen, berechnet als elementarer Kohlenstoff und eine geringe Menge einer anorganischen Substanz bei
einem pH-Wert des Mediums zwischen 5,0 und 6,0 enthält,
solange kultiviert wird, bis das Medium eine Lipase-Aktivität
aufweist und daß die Lipasefraktionen frei von Protease aus dem Kulturmedium isoliert werden.
2*Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Enzym in der Weise gereinigt wird, daß die bei der
Ammonium sulfat-Fraktionierung des Kulturfiltrats bei
einem Sättigungsgrad von 0,35 his 0,65 erhaltene Ausfällung gesammelt, die entsalzte wässrige Lösung dieses
Niederschlages mit einem schwachen Aniomenaustaiischerharz im schwach sauren Gebiet zur Entfernung von Verunreinigungen
behandelt, die Lösung anschließend mit einem schwachen
Kationenaustauscher zur Adsorbierung der Lipaseßcaktion
behandelt und dieses Austauschermaterial dann mit einer Pufferlösung bei einem pH von etwa 5t5 oder einer
0,2-0,4#igen wässrigen Lösung eines neutralen anorganischen
Salzes eluiert wird und daß eine ausreichende Menge eines
organischen Lösungsmittels zur Ausfällung der Lipase zu des* Dialysat zugesetzt und das Präzipitat getrocknet
SO98öS/01 %2 ; . ; ■■■-■-;
wird.
J.Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mikroorganismus-Rhizopus delemar ist.
SO 98 09/07 12
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-
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- 1964-04-25 DE DE19641442093 patent/DE1442093A1/de active Pending
Also Published As
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |