DE1442093A1

DE1442093A1 - Verfahren zur Herstellung und Reinigung einer stabilen Lipase-Zubereitung

Info

Publication number: DE1442093A1
Application number: DE19641442093
Authority: DE
Inventors: Juichiro Fukumoto; Mieko Iwai; Yoshio Tsujisaka
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1963-04-27
Filing date: 1964-04-25
Publication date: 1968-11-21
Also published as: CH439187A; US3262863A

Description

DR. MÜLLER-BOR£ DIPL.-ING. GRALFS Dr. MANITZ 1442093

PATENTANWÄLTE

24. April 1964

Dr. Expl.

Bg/Kp - F 1?8

Juichiro JFukumoto, No. 4-227 Kirihata, Nagoyama, -iEakarazuka, Japan.

Toshio Tsujisaka, No. 21,, 1-chome, Tamade-Hondori, Nishinari-ku, Osaka, Japan.

Mieko Iwai, No. 1.1, 3-chome, Haramicho, Ikuno-ku, Osaka, Japan.

Verfahren zur Herstellung und !Reinigung einer stabilen Lipase-Zubereitung

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen Lipase-Zubereitung.

f Lipase ist genau wie andere hydrolytische Enzyme in Medizin und Industrie von großer Bedeutung. Sie kann z. B. bei der Behandlung von Verdauungsstörungen des Menschen und zur Verbesserung von ölen, fetten und anderen Nahrungsmitteln verwendet werden. Aber ihre gewerbsmäßige Anwendung erfolgt in beschränkterem Maße als die anderer hydrolytischer Enzyme,- was"auf

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ihre Instabilität bei der Reinigung und Lagerung zurückzuführen ist, Ferner ist diese Beschränkung der Gewinnung der Lipase zuzuschreiben, denn das im Handel erhältliche präparat ist zum größten Teil tierischer oder pflanzlicher Herkunft.

Wir haben gefunden, daß die Instabilität der Lipase hauptsächlich einer Enzymwirkung der als Verunrei?- nigung vorhandenen protease zuzuschreiben ist* Andererseits haben wir festgestellt, daß bei der Kultivierung von Rhizopus delemar: in flüssigem Medium Lipase erzeugt wird und daß die Erzeugung von Protease bei dieser Kultivierung durch Einstellung eines bestimmten Stickstoff- und Kohlenstoffgehalts in dem Medium gesteuert werden kann. Unsere iTersUche haben ergeben, daß Rhizopus delemar eine große Menge Pro-» tease erzeugt, wenn die Kultivierung in einem flüssigen Medium mit niedrigem Stickstoffgehalt und verhältnismäßig hohem Kohlenstoff gehalt erfolgt. Wenn dagegen der Stickstoffgehalt hoher oder der Kohlenstoff ge halt geringer ist, so nimmt die Erzeugung von Protease" ab. Wir haben ferner gefunden, daß die Slidung von Protease ohne Beeinflussung der Erzeugung von Lipase.· im· wesentlichen unterdrückt werden kann^ wenn die Kultivierung .von Rhizqpüs delemar in einem . Medium erfolgt j das etwa 0*5 Ms^:l_r5 ^:$ äidcsfoff liefernder Substanzenals Blement berechnet, und

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etwa 0,4- bis 1,5 % kohlenstoffliefernder Substanzen, als Element berechnet, sowie eine geringe Menge anorganischer Substanz bei einem pH-Wert von 5>0 bis 6,0 enthält (Tabelle I).

Wir haben ferner gefunden, daß Lipase während der Reinigung oder der Lagerung leicht durch Bisenionen inaktiviert werden kann. Diese Inaktivierung erfolgt nach unseren Beobachtungen schnell, wenn während der Herstellung mehr als etwa 0,5 ppm Bisenionen zugegen sind. Mit fortschreitender Reinigung werden bei höheren ppm an Eisen immer größere Anteile der Lipase inaktiviert (Tabelle II). Wir haben dementsprechend festgestellt, daß die Konzentration an Eisenionen während der Herstellung niedriger als 0,5 ppm gehalten werden sollte.

Erfindungsgemäß wird Rhizopus delemar auf ein wässriges Nährmedium geimpft, das 0,5 bis 1,5 % stickstoff liefernder Substanzen (berechnet als elementarer Stickstoff), 0,4 bis 1,5 % kohlenstoffliefernder Substanzen (berechnet als elementarer Kohlenstoff) und eine kleine Menge anorganischer Substanz wie z. B. KH^PO/j.» MgSO^ u. a. bei einem pH-Wert von etwa 5»O bis etwa 6,0 enthält* Als Stickstoffquelle dienen z. B. Peptone, Sojabohnenejttrakt oder Getreidekeimflüssigkeit, als Kohlenstoffquelle Glucose, Sucrose

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oder lösliche Stärke. Die Kultur wird 2-4 Tage läng bebrütet, was vorzugsweise bei einer Temperatur von 25 - 55°O geschieht. Die .Konzentration an Eisenionen in dem Medium wird geringer als 0,5 ppm gehalten. Wenn erfindungsgemäß der pH-Wert des Mediums am Anfang auf ■ etwa 5,5 eingestellt wird," so steigt er nach der Kultivierung auf etwa 6,5 bis etwa 8_r5 an.

Die Gewinnung der Lipasefraktion aus dem Kulturmedium geschieht in üblicher Weise durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat» Die KuItürflüssigkeit wird also filtriert und das Filtrat mit Ammöniumsulfat' versetzt.

^: ist, ■ "Wenn ein Sättigungsgrad von 0,55 "bis 0*65 erseicht/i""^ wiM die erhaltene Ausfällung abgetoennt. Das produkt enthält mehr als 95 % der Gesamt-Lipaseaktivität des Ausgangsmaterials.

Die so gewonnene rohe Enzymzubereitung wird erfindungsgemäß weiter gereinigt. Das Rohprodukt wird in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung zur Abtrennung von Ammöniumsulf at entsalzt. Dies kann durch Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von "SEPHADEX" geschehen. Wenn^das Kulturfiltrat ei?wa\ die ZiUgelassene Menge Eisenionen enthalt, so wird die Dialyse möglichst gegen reines Wasser durchgeführt, das etwa 0,0001 Mol Chelatisiefungsmittel wie z. B. liatriumcitrat oder EDM enthalt. Durch ,'

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diese Behandlung werden fast alle Eisenionen entfernt, wobei ein Dialysat zurückbleibt, das einen Gehalt an Bisenionen von weniger als 0,01 ppm aufweist. Die erhaltene Lösung wird auf einen pH-Wert von etwa 4-, 5 bis etwa 6*0 eingestellt und durch ein schwaches Anionenaustauscherharz wie z. B. Duolite A-2/geschickt, wobei die größte Menge der Proteinstoffe und anderen Verunreinigungen an dem Harz adsorbiert werden.

Die so behandelte Lösung wird nun mit einem schwachen K&tionenavustauscher zur Absorbierung der Lipasefraktion in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert vorher mit Hilfe einer organischen Säure wie 1/50 bis 1/100 molarer wässriger Essigsäure auf etwa 5»5 bis etwa 5»0 Eingestellt worden ist. Als schwache Eationenaustauscher eignen sich ü. a» Amberlite IRG-50, Duolite GS-IOl, SE-SEPHADEX und Carboxymethylcellulose ^ Di· gereinigte Lipaselösung wird in der Weise gewonnen, _# daß man den Ionenaustauscher mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 oder einer 0,2 - 0,4 #igen wässrigen Lösung eines neutralen anorganischen Salzes wie z. B. Natriumchlorid, Ammoniumsulfat u. a. eluiert·

Es wird nun ein organisches Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Aceton in großem Überschuß zu der so gewonnenen Lipaselösung zugegeben und der erhaltene Niederschlag getrocknet, wobei eine gereinigte "Xipase als ,Pulver erhalten wird. Die Gesamtausbeute an Lipase-

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aktivität beträgt etwa 40.- 30 % der berechneteji Menge auf die des Kulturmediums. Erfindungsgemäß ist nicht nur Rhiζopus delemar'zur Erzeugung von Lipase brauchbar, sondern es können auch andere Stämme der Gattung Rhizopus wie Rhizopus formosensis, Rhizopus chinenses und Rhizopus nigricans mit befriedigendem Erfolg benutzt werden.

■-..■■- ·■ - ' ■ - t - - - Versuch 1 ^

Rhizopus delemar wurde 3 Tage lang bei 28⁰O auf einem wässrigen Hährmedium submers kultiviert, das pepton Glucose in den in der Tabelle unten angegebenen Mengen, enthielt. Ferner enthielt das Medium 0,1 % HaNO,, 0,1 % KH₂PO^ und 0,05 % MgSO₄* Anschließend wurde die Kultur durch Erhitzen im Autoklaven sterilisiert, In der Tabelle I sind die Eulturbedingungen und die Ergebnisse aufgeführt, (10 % Pepton entsprechen;'etwa -1,0 % elementarem Stickstoff)· .

Tabelle I

	Glucose %	pH	Kultur- filtrat	Lipaseaktivität" (Einheiten/ml)	nach. 5 Ta gen	Protease- aktivität Xu/ml)
Zusamme nsetzung des Kulturmediums	5	Medium	4,8	unmittelbar- nach der Kultivierung	5	unmittelbar nach der Kultivierung
Pepton %	3	5,5	5,4	7b		350
3	2	ti	6,5	112	340	235
5 *	2	Il	7,4	350	715	7
5	3	Il	7,6	715	740	0
7,5	2	Il	8,0	740	635	0
10	1	Il	. 8,3	650	175	0
10	Il		188	0 *
10

Versuch II

Um die Inhibitionswirkung von Bisenionen auf die Lipaseaktivität zu veranschaulichen, wurde der folgende Versuch
durchgeführt. Jede probe wurde 60 Minuten in Gegenwart von Bisen(II)ionen (Ferrosulfat) der in der Tabelle aufgeführten Konzentration stehengelassen» anschließend wurden die noch vorhandenen jtripaseaktivitäten bestimmt. ,

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle il wiedergegeben.

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tabelle Ii

Ie⁺⁴: Gehalt (ppm) ...■■■";	O	I . . ^;. Zuruck-blel'be.nde Lipasaktivität 3 (Einheiten/ml) I	■ · -B	σ
-		-.- -·..-..■■ ._1; ■:- .	150	170 ;
*' ■ ' 0,3* -;..--■..;- :, ^s**	180	■ ^; 14-9	■'- T7ö^r:^v'-■-"
^; '■;■ :■ %o ·^: ";;■■' ■■■■·■"·	;■■■■■■.■■'-"■"■ 18G		150
2*0^Ν ; 7 ^; ■^:-·-.	^: : ." 178- -	:'^; '58	44
*7, ■ """5p '-■"■·■; -^v - ^:**	■ -·.;■· ·■ 1^2; -	7- ■■-.•14 ;	11
		0
■\:--.^;'V'-.--ä:-.'^

Probe A: Verdünntes KuIturfiltrat, hergestellt durch Kultivierung von Ehizopus delemar auf dem in_t Beispiel. 1 beschriebenen Medium. (Lipase

Probe B: Wässrige Lösung einer rohen Lipasefraktion, hergestellt duröh"Fraktionierung der oben beschrie-•benen Probe' !"mit Ammoniumsulfät. (Lipase 150 Einheiten^!.) ^Λ-^Λ : '■""'-';[

Probe G; Gereinigte Lipäsefraktion, hergestellt durch Reinigung der^ebbeii beschriebenen Probe B mit Hilfe^-von ioneiiaüstaüscherh und Dialyse. (Lipase 17Ö Einheiten/ml»)

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[Definition der Enzymeinheiten

Lipase: Bine -Einheit der Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die eine 14 mg ölsäure äquivalente Menge Fettsäure erzeugt, wenn 2 g Olivenöl mit dem Enzym bei pH.5,6 und 30°G 150 Minuten verseift werden.

Protease j Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die 10 !"Aminosäure oder ^in TriChloressigsäure lösliches Petid (berechnet als Tyrosin) erzeugt, wenn 3 ml einer 1%igen Lösung von Milchcasein bei pH 3» 7 40 0 10 Minuten mit dem Enzym hydrolysiert werden·

Beispiel .

Ein Stamm Rhizopus delemar*wurde auf das folgendermaßen

zusammengesetzte wässrige Medium geimpft:

Glucose 2 %

.,. 0_f1 % . . _v. 0*05 %'..'■ ■.-:-'■ ^z" Pepton . "3 ' 7 °/o . '■■ , ■

^:\S-. ,0,15 ppm ... ■,·;■ ,v ,,·;/

ORIGINAL IMSPECTED

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- ίο - -

und drei Tage bei 28°C unter Schütteln bebrüte-t. Das Kulturmedium, das 700 Einheiten/ml.Lipase·enthielt, ' wurde filtriert und das !"iltrat" (Probe Ä-in-TersuGh II) mit Ammoniumsulfat bei einem Fe⁺⁺ Gehalt von 0,8 ppm fraktioniert. Die bei einem Sättigungsgrad von O erhaltene Ausfällung wurde abgetrennt, in Wasser gelöst und die Lösung (probe B in Versuch II) zur Entfernung Ammoniumsulfat dialysiert.- Das Dialysat wurde, 'auf pH 5»0 gebracht und durch eine Säule.'" mit" einem schwachen Anionenaustauscherharz geschickt (Duolite A-2). Die erhaltene Lösung mit 80 % Lipäseaktivität bezogen auf das Ausgangsmaterial wurde mit Hilfe einer 1/50 molaren wässrigen Essigsäure auf pH 4,5 gebrächt und dann durch eine säule mit einem schwachen Kationenaustauscherharz geschickt (Amberlite IRC 50)· Das Harz wurde mit wässrigen NaCl-Lösungen sukzessiv steigender Konzentration eluiert. Die bei 0,2-0,4 /1 FaCl erhaltenen Fraktionen wurden gesammelt und dialysiert (probe C in Versuch II)· Zum Dialysat wurde Methanol zugesetzt, der erhaltene Niederschlag bei 1O⁰Q₅ ab£ilt?3&ert und bei niedriger- Tem>peratur getrocknet. Das so erhaltene Enzympulver besaß eine Aktivität, die 50>% der des"Ausgangsmaterials betrug und zeigte eine 500 mal so^hohe,Lipasewirksamkeit wie die 'des Kul-6urfiitrats\ ^^zogen aur den Proteingehalt. Es ,wurde zu den vorhergehend beschriebenen Operationen Aesfcilliertea Wasser mil? weniger, als Οί-1/ ppm Fe⁺⁺ verwendet, " . ^i/

' -' ■ 'r ^Ji * ,'' ¹^ ' ' ^! ORfGiNAL JNSPECTED

Claims

14^2093

- 11 Pate ntansprüche

ep φά$- Herstellung einer stabilen Idpase-Zuberei-

tung,dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Shizopus auf einem wässrigen Nährütedium, das Oi5,bis,1,5% stickstoffliefernder Substanzen, berechnet als elementarer Stickstoff, 0,4- bis 1,5# kohlenstoff liefernder Substanzen, berechnet als elementarer Kohlenstoff und eine geringe Menge einer anorganischen Substanz bei einem pH-Wert des Mediums zwischen 5,0 und 6,0 enthält, solange kultiviert wird, bis das Medium eine Lipase-Aktivität aufweist und daß die Lipasefraktionen frei von Protease aus dem Kulturmedium isoliert werden.

2*Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in der Weise gereinigt wird, daß die bei der Ammonium sulfat-Fraktionierung des Kulturfiltrats bei einem Sättigungsgrad von 0,35 his 0,65 erhaltene Ausfällung gesammelt, die entsalzte wässrige Lösung dieses Niederschlages mit einem schwachen Aniomenaustaiischerharz im schwach sauren Gebiet zur Entfernung von Verunreinigungen behandelt, die Lösung anschließend mit einem schwachen Kationenaustauscher zur Adsorbierung der Lipaseßcaktion behandelt und dieses Austauschermaterial dann mit einer Pufferlösung bei einem pH von etwa 5_t5 oder einer 0,2-0,4#igen wässrigen Lösung eines neutralen anorganischen Salzes eluiert wird und daß eine ausreichende Menge eines organischen Lösungsmittels zur Ausfällung der Lipase zu des* Dialysat zugesetzt und das Präzipitat getrocknet

SO98öS/01 %2 ; . _; ■■■-■-;

wird.

J.Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus-Rhizopus delemar ist.

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