DE1642654C3

DE1642654C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines stabilen gereinigten Lipase-Präparates und pharmazeutisches Mittel, welches dieses enthält

Info

Publication number: DE1642654C3
Application number: DE1968S0113737
Authority: DE
Inventors: Pierre Dipl.- Landw. Laboureur; Michel Labrousse; Roland Ives Mauver Riom Puy De Dome Nay
Original assignee: Centre Europeen De Recherches Mauvernay Cerm Riom; D'etudes Et D'applications Biochimiques Seab Jouy-En-Josas Les Yvelines Ste
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1968-01-16
Filing date: 1968-01-16
Publication date: 1979-11-29
Also published as: DE1642654B2; DE1642654A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines stabilen gereinigten Lipase-Präparates hoher Aktivität und ein pharmazeutisches Mittel, welches dieses enthält.

Lipasen stellen wichtige Enzyme bei der Umwandlung von Peptiden dar, da s-, insbesondere die Hydrolyse von Triglyzeriden ermöglichen, die in Diglyzeride, Monoglyzeride, Glyzerin- und Fettsäuren umgewandelt werden. Lipasen werden daher in der Therapie insbesondere zur Behandlung von gastrointestinalen Störungen, Dyspepsien, akuten Manifestationen von Verdauungsallergien und anderen Fällen verwendet.

Die dabei verwendeten Lipasen sind zum größten Ttil Produkte auf Basis von gemahlenem und getrocknetem Pankreas. Pankreas-Lipase weist jedoch zahlreiche Nachteile auf, insbesondere eine sehr beschränkte Aktivität, die auf einen pH-Bereich von 7,5 bis 9,5 begrenzt ist. Weiterhin besitzen Pankreaslipasen eine hohe Instabilität, was zusammen mit einem unangenehmen Geschmack und Geruch den pharmazeutischen Anforderungen nur sehr wenig gerecht wird.

Es wurde auch bereits vorgeschlagen, Lipase durch Züchten von Schimmelpilzen, beispielsweise der Gattung Aspergillus Penicilium, Mucar oder Candida herzustellen-

Die dabei erhältlichen Produkte sind jedoch für die therapeutische Verwendung nicht immer völlig zufriedenstellend.

So werden in der französischen Patentschrift 1490 099, in der französischen Patentschrift 14 89 553 und in deir US-Patentschrift 31 89 529 Verfahren zur Gewinnung von Lipase beschrieben.

ίο Untersucht man die bei den bekannten Verfahren erhaltenen Kulturfiltrate gemäß dem Verfahren von D e s η ο e 11 auf ihre Lipaseaktivität, so stellt man fest, daß das Kulturfiltrat bei der französichen Patentschrift 14 90 099 weniger als zwei Einheiten pro ml enthält, das

i> Kulturfiltrat gemäß der französischen Patentschrift 14 89 553 enthält 25 Einheiten pro ml und das Kulturfiltrat der US-Patentschrift 31 89 529 enthält 6 Einheiten pro ml.

Diese Werte sind aber sehr niedrig und oft nicht reproduzierbar. Es besteht daher ein Bedarf nach Lipasepräparaten mit reproduzierbarer und hoher Aktivität.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, durch ein mikrobiologisches ZOchtungsverfahren eine Lipase mit hoher Aktivität, weitem Aktivitätsbereich und hoher Stabilität herzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines stabilen gereinigten Lipasepräparates hoher Aktivität, wobei eine wäßrige Nährlösung bis zur konstanten enzymatischen Aktivität der Lipsse in dem Medium aerob fermentiert wird, das Medium anschließend durch Filtrieren abgetrennt und aus dem Filtrat das Lipasepräparat gewonnen wird, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mirkoorganismus den Stamm Rhizopus arrhizus Fischer, der bei dem Laboratoire de Cryptogamie mie in Paris mit der Hinterlegungsnummer 1916 deponiert ist, einsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein pharmazeutisches Mittel zur Behandlung vuii gastrointestinalen Störungen, Dyspepsien und Verdauungsallergien, enthaltend einem Lipasepräparat, das nach dem Verfahren, das oben beschrieben worden ist, hergestellt worden ist. Prüft man das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren

•r> erhaltene Kulturfiltrat auf ähnliche Weise auf die Lipaseaktivität, wie es oben bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Lipase beschrieben wurde, so stellt man fest, daß die erfindungsgemäßen Kulturfiltrate 140 bis 200 Einheiten Lipaseaktivität pro

■>o ml enthalten.

Unter den Mucoraceen sind nur bestimmte Stämme für die Bildung von Lipase geeignet, wie es aus der nachfolgenden Tabelle I hervorgeht.

Tabelle I

Stamm

Kulturdauer in Stunden
41

64

Rhizopus arrhizus Fischer 1916 (LC, Paris) 46Einh./ml

Mucor hiemalis 56 Einh./ml

Mucor Racemosus 2 Einh./ml

Mucur muccdo 0 Einh./ml

Mortierella alpina Spuren

72 Einh./ml	-
68 Einh./ml	-
0 Einh./ml	0
Spuren	0
Spuren	Spuren

Il Das verwendete Bestimmungsverfahren und die

t| Definition der Einheit werden im folgenden beschrieben.

P In ein iSO-ml'Becherglas werden gegeben 7,5 ml

f| einer neutralisierten Olivenölemulsion, die von einem

f! Ansatz stammt, der 50 ml neutrales Öl enthält 50 ml

3%jger Polyvinylalkohol und 25 ml destilliertes Wasser, 5 ml 0,1 n-Calciumchloridlösung, 1 ml einer 20%jgen Lösung von menschlichem Eiweiß und 76,5 ml destilliertes Wasser von 37^PC Der pH-Wert wird durch 0,1 n-SodalöEUiig auf 7,6 eingestellt Dann wird eine bestimmte Menge der zu bestimmenden enzymatischen Lösung zugesetzt und ein Zeitmesser ausgelöst Jedesmal, wenn der pH-Wert 7,6 erreicht wird die erforderliche Zeit und die Zahl der ml der verwendeten 0,1 n-Sodalösung festgestellt Das Enzym läßt man auf π sein Substrat während etwa 10 Minuten einwirken, worauf eine Kurve der Zeit in Sekunden in Abhängigkeit von der Zahl der mMol Soda gezeichnet wird. Diese Kurve weist einen Teil auf, in welchem sich mindestens drei Punkte in AusFluchtung befinden, und zwar bei etwa 0,8 ml. Aus diesem geradlinigen Teil wird die Zahl der in einer Minute verbrauchten Sodamikromole aus der verwendeten Menge Enzym berechnet Als Einheit wird diejenige Enzymmenge bezeichnet welche bei den angegebenen Bestimmungsbedingungen in einer Minute eine Fettsäuremenge freisetzt die durch ein Soda-Mikromol neutralisiert werden kann.

Die nachfolgende Beschreibung des Züchtungsverfahrens ist auf dieses Bestimmungsverfahren und die beschriebene Einheit abgestellt so

Die Kultur des verwendeten Stammes der Art Rhizopus arrhizus wird durch eine Vorkultur in einem flüssigen Medium eingeimpft das so zusammengesetzt ist daß die maximale Pilzbildung in ziemlich kurzer Zeit von weniger als 24 Stunden erhalten wird. Diese Vorkultur geschieht mit Belüftung und Rühren bei einer Temperatur zwischen 20 und 35°C. Es kann jedes Medium verwendet werden, das eine gute und rasche Entwicklung des Stammes zuläßt

Das Kulturmedium kann alle organischen und mineralisciien Elemente enthalten, die für eine gute' Entwicklung des Mikroorganismus notwendig sind, sowie diejenigen, weiche zu einer reichlichen Erzeugung von exozellulären Lipasen erforderlich sind. Als Kohlenstoffquelle sind die günstigsten Elemente die Stärken, Extreme und hydrolisierte Mehle. Als Stickstoffquerren sind die günstigsten Elemente die Ammoniumsalze, die Nitrate, löslicher Maisextrakt, Pepton und Casein. Als mineralische Elemente soll das Medium Kalium, Magnesium, Calcium, Phosphor, Schwefel und Chlor enthalten. Vitamine, wie Thiamin, Riboflavin, Niacin, Pyridoxin, Pantothensäure, Biotin, Folsäure und Inosit sind für die Entwicklung des Pilzes und zur Herstellung der Lipase günstig, jedoch nicht unerläßlich. Der pH-Wert des Mediums soll vor dem Impfen zwischen 5 und 7 liegen. Er kann durch Ammoniak oder 2 η-Schwefelsäure eingestellt werden.

Die Kulturen werden als Tiefkultur mit Belüftung und Rühren durchgeführt Diese beiden Faktoren können in Abhängigkeit von den Anlagen schwanken, es ist jedoch zu erwähnen, daß eine zu starke Belüftung der Herstellung der Lipase schaden kann.

Während der Dauer der Kultur wird das Medium auf 20-35⁰C gehalten.

Die Kultur wird fortgesetzt, bis die enzymatische Aktivität eine Stufe erreicht, d. h. bis man die gleiche Anzahl Lipaseeinheiten bei zwei aufeinanderfolgenden, mit einer Stunde Abbtind durchgeführten Bestimmungen erhält

Nach Beendigung der Kultur wird der Nährboden nitriert, um das Myzel abzutrennen. Sodann wird die flüssige Phase gesammelt, um die Lipase zu gewinnen, Diese Lipase, welche in Wasser löslich ist, jedoch in organischen Lösungsmitteln und in konzentrierten wäßrigen Salzlösungen unlöslich ist kann leicht abgetrennt werden, und zwar durch Ausfällen mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (vorzugsweise Aceton) oder in dem vorzugsweise Ammoniumsulfat zugesetzt wird.

Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und dann im Vakuum getrocknet

Zur Erhöhung der Aktivität und zur Herabsetzung der Menge der Verunreinigungen des in der beschriebenen Weise erhaltenen Rohprodukts ist es möglich, dieses wieder aufzulösen und erneut auszufällen, beispielsweise durch fraktioniertes Ausfällen durch Zusatz von Lösungsmitteln oder von Salzen.

Nach dem Trocknen erhält ma" sin pulverförmiges Produkt von sehr hoher Lipaseaktivität dessen Betrag zwischen 5000 bis 12 000 Lipaseeinheiten je Gramm je nach der Konzentration der Kulturfiltrate und der Zahl der Ausfällungen schwankt

Die Lipase gemäß der Erfindung ist im wesentlichen durch ihre biologischen Eigenschaften gekennzeichnet, welche nachfolgend in Verbindung mit den Zeichnungen näher beschrieben werden, und zwar zeigt

F i g. 1 die Stabilitätskurven der Lipase in einer Lösung zu 1 mg/ml in Abhängigkeit von der Zeit und von verschiedenen Temperaturen, wobei die Kurven 1, 2,3 und 4 die Veränderungen der Aktivität der Lipase in Prozent in Abhängigkeit von der Zeit in Stunden bei 50, 37,20 und 0⁰C darstellen;

F i g. 2 zeigt die Wirkung der Inkubierungstemperatur (in °C) auf die Aktivität (in °/o) der gewonnenen Lipase;

F i g. 3 zeigt die Wirkung der pulverförmigen Lipase auf verschiedene Substrate ausgedrückt in Soda-Mikromolen in Abhängigkeit vom pH-Wert, wobei die Kurven 1, 2 und 3 jeweils die Wirkung von 50 Lipaseeinheiten s-:{ 3 g Olivenöl, die Wirkung von 150 Lipaseeinheiten auf 3 g Tributyrin und die Wirkung von 50 Lipaseeinheiten auf 3 g Triolein darstellen;

F i g. 4 den Einfluß von Metallionen auf die Aktivität der Lipase ausgedrückt in Aktivüätsprozänten in Abhängigkeit von der Konzentration des Metalls im Enzymo-Substrat-Gemisch, wobei die Kurven 1—5 sich auf die Wirkung von Zink-, Quecksilber-, Kupfer(ll)-, Eisen(HI)- und Kobaltionen beziehen;

F i g. 5 zeigt die Wirkung der Salze der Gallensäuren auf die Lipase, ausgedrückt in Veränderungen der Aktivität (%) von 5 mg Pulver in Abhängigkeit von der Konzentration (%) von Salzen der Gallensäuren im Enzym-Substrat-Gemisch, wobei sich die Kurven 1, 2 und 3 auf die Wirkung der Desoxycholsäuie, des Natriumtaurocholats und des Natriumcholats beziehen.

Es wurde in erster Linie die Stabilität der Lipase untersucht

Im trockenen Zustand erfahren die erfindungsgemäD erhaltenen enzymatischen Pulver keinerlei Aktivitätsverlust nach mehreren Monaten Lagerung im Heizschrank bei 37⁰C.

In wäßriger Lösung zu 1 mg/ml wurde die Stabilität dieser Lipase in erster Linie in Abhängigkeit von der Temperatur während veränderlicher Zeiten mit den in der nachstehenden Tabelle Il zusammengefaßten Ergebnissen untersucht.

	5	1	6 42 654	Lagerung	Lagerung
				bei 37 Γ	bei 50 (
Tabelle II				(Kurve 2)	(Kurve 1)
Lagerzeit		Aktivität in	7», bezogen auf die Zeil 0	92	68
		Lagerung	Lagerung	79	42
		bei 0 <	bei 20 C	69	35
		(Kurve 4)	(Kurve .1)	54	13,5
30 Minuten		100	100	49	5
1 Stunde		100	100	-	-
I V: Stunden		100	100	30	-
3 Stunden		KK)	KM)
4 Stunden		100	K)O
8 Stunden		100	80
24 Stunden	100	35

Diese Ergebnisse sind graphisch in F i g. 1 dargestellt.

Die Stabilität der gleichen Lösung wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert bei zwischen 2 und 9 gestaffelten pH-Werten und während veränderlicher Zeiten bei 0⁼C untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle Ml /usiimmengefaßt und ir Prozenten bezogen auf die Lösung mit dem pH-Werl 5,7 angegeben, welches der natürliche pH-Wert der Lösung ist:

Tabelle III	Restaktiviliit	pl 1.1	-	pH4	pH 5.7	pi I 6	pH 7	pH 8	pH 9
Lagerzeit	pH 2	100	75	100	100	100	100	100	100
	4	95	_	100	100	KX)	100	100	100
O	O	81		90	100	100	100	100	100
1 Stunde	-	-		-	-	-	-	-	100
2 Stunden		75	76	100	100	100	-	86
3 Stunden	-	-	100	100	100	91	-
4 Stunden	-	75	-	-	-	-	81
4¹; Stunden	-	_	100	91	91	88	_
5 Stunden
5 : Stunden

Aus diesen Ergebnissen !aßt sich erkennen, daß die erfindungsgemäßen Lipasen bemerkenswert stabil in Lösungen mit pH-Werten zwischen 3 und 9 sind, wobei die maximale Stabilität bei dem pH-Wert 5.7 besteht, d. h. beim natürlichen pH-Wert der Lösung. Es ist ferner festzustellen, daß die Stabilität in einem alkalischen Medium höher als in einem sauren Medium ist.

An zweiter Stelle wurden die Veränderungen der Aktivität der Linase in Abhängigkeit von der Inkubicrungstemperauir untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt und in F i g. 2 dargestellt, wobei die Aktivität bei einer Inkubierungstemperatur von 37°C als Bezugswert gleich !00% gesetzt wurde.

Tabelle IV

Inkubierungstemperatur Aktivität

18
30
37
4»)
45
50

36
80
100
96
86
70

An dritter Stelle wurde die Aktivität der Lipase aul verschiedenen Substraten in Abhängigkeit von dem pH-Wert der Inkubierung untersucht. Als Substrate wurden aufeinanderfolgend Olivenöl, Tributyrin und Triolein verwendet.

In jedem Falle wird eine Emulsion des Substrats ir einer 3%igen Polyvinylalkohollösung in der gleicher Weise wie für die Bestimmung bei einer Olivenölemu! sion hergestellt. Die Versuche werden in den dr '. Fäller in ähnlicher Weise durchgeführt wie folgt:

Zu 7,5 ml Emulsion werden 5 ml 0,1 m-Calciumchlo ridlösung und 72,5 ml destilliertes Wasser von 37° C gegeben und das Gemisch auf den gewünschter pH-Wert gebracht. Sodann werden 5 mg (50 Einheiten Enzymlösung zu 1 mg/ml zugesetzt, die vorher auf der gewünschten pH-Wert gebracht worden ist Da; Gemisch wird während 10 Minuten auf 37° C und au dem gewünschten pH-Wert gehalten. Nun werder 10 ml Äthanol zugesetzt, der pH-Wert 9 eingestellt unc die verwendete 0,1 n-Sodamenge einschließlich derjeni gen gemessen, die zur Aufrechterhaliung des pH-Wer tes während der enzymatischen Reaktion verwende worden war.

Vorher wird eine Biindprobe mii einer Lösung ohnf Enzym hergestellt, die 10 Minuten auf 37° C gehalter wird, die durch 10 ml Äthanol inaktiv gemacht wird unc

welcher die cnzymalischc Lösung (nach dem Äthanol) zugesetzt wird. Die mit ilen drei vorgenannten Substraten jeweils erhaltenen Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen V. Vl und VII sowie in I'ig. 3 der Zeichnungen dargestellt.

I aIvL¹C Y	Zahl dei zur Lin-	Gesamtzahl der ver
pi I-Wert	stcllunt! verwen	wendeten Soda-
	(lelen Snilii-	Mikromolc
	Ntikiiiiiiole
	0	0
2.25	0	149
3.30	0	K)I
4.05	0	79
4.95	1(1.1	2Ü'-i
7.00	I (.2	183
7.50	2}	23
9.00
labcllc Yl	/iilil dei /in I iii-	(iesiiml/ahl der \cr-
l-l IW en	slelliuif! \etttcn-	wendeten Sodii-
	delen Soda-	Mikroniole
	Mikmmnle
	0	0
2.In	0	141
3.30	15	90
4.05	54	90
5.00	84	129
i).(K)	90	90
7.00	78	78
8.00
Tabelle YII	/,],] ,1,., ,,,, Ii,,	I- III
nil.UVrI	stellung verwen	wendeten Soda-
	deten Soda-	MiI romolc
	Mikromnle
	0	S3
	0	148
3.00	0	18()
3.45	0	150
3.95	0	158
5.00	0	235
5.90	200	454
7.(K)	130	130
8.(K)	48	48
9 (K)

Aus diesen Ergebnissen ist erkennbar, daß die erfindungsgemäße Lipase auf Triglyceride mit zwischen 2.5 und 9 liegenden pH-Werten einwirken kann und daß sie zwei Aktivitätsoptima besitzt, welch letztere im Falle von Olivenöl und Triolein bei pH-Werten von 3,5 und 7 erzielt werden und im Falle von Tributyrin bei pH-Werten von 3,5 und 6.

An vierter Stelle werden die Aktivitätsbestimmungen der erfindungsgemäßen Lipase auf verschiedenen Substraten durchgeführt, nämlich auf Erdnußöl Triolein, ein Netzmittel und Mono-, Di- und Triacelin in der gleichen Weise wie vorangehend für Olivenöl, so daß ein Vergleich mit dem letzteren gezogen werden kann.

Ls wurde festgestellt, dal! auf Erdnußöl und Triolein die Lipase eine Aktivität besitzt, die im wesentlichen gleich derjenigen auf Olivenöl ist. Ls ergibt sich jedoch, daß im Lalle von Triolein eine viel größere Menge Fettsäure freigesetzt werden muß, um das Gleichgewicht der verschiedenen Hydrolysereaklionen zu erzielen.

Auf das Netzmittel weist die Lipase keine Aktivität in der Zeit auf. die gewöhnlich der Bestimmung auf Olivenöl entspricht, jedoch läßt sich nach einigen Stunden (mindestens 4 Stunden) ein Begin, der Hydrolyse feststellen. Dagegen erfahren unter den gleichen Bedingungen Mono-, Di- und Triacetin keine Hydrolyse.

Schließlich wurde eine Untersuchung der Wirkung der Lipase in Abhängigkeit von verschiedenen Inhibitoren, Beschleunigern und Schutzstoffen mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:

a) Mineralische Verbindungen:

Ls wurden Versuche mit Zink-, Quecksilber-, Kupfer. Blei . Zinn-, Eisen-, Kobalt-, Aluminium-, Strontium-. Magnesium- und Manganionen in Gegenwart von ("ak ium entsprechend der herkömmlichen Bestimmungsincthode durchgeführt. Für Calcium, das stark beschleunigend wirkt, wurde eine Bestimmung nach der herkömmlichen Methode durchgeführt, während ohne Calcium die erhaltene Aktivität willkürlieh mit 100% angenommen wurde. Die Konzentration von 5.5 χ 10 ^! M, welche eine Aktivität von 466% bezogen auf die Bestimmung ohne Calcium ergibt, entspricht genau der gewöhnlich bei der Bestimmung verwendeten Calciummcnge.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt.

Das Calcium besitzt außer seinem hohen Beschleunigungsvermögen ein Schutzvermögen für die wäßrigen Lipaselösungen, so daß eine Lipaselösung von 1 mg/ml in einer 0,1 m-Calciumchloridlösung keinen Aktivität·, verlust nach Ablauf von 6 Stunden bei 18"C erleidet, wahrend ohne Gegenwart von Caiciurii die gieiciie Lösung 9 - 12% ihrer Aktivität verliert.

b) Organische Verbindungen:

Ls wurden verschiedene Versuche unter Verwendung von FiDTA-Na-SaIz"), menschlichem Eiweiß. Kaliumfcrrocyanid. Cholesterin. Harnstoff. Netzmittel. Natriumlaurylsulfat. Salzen der Gallensäuren. Glycerin und Ölsäure durchgeführt.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Wirkung des EDTA-Na-Salzes'): Die Aktivität von 100% ist durch die Bestimmung ohne EDTA-Na-SaIz*) gegeben, welche Aktivität in Gegenwart einer Konzentration von 1.IxIO-⁴N aufrechterhalten wird und welche verringert wird auf 85% bei einer Konzentration von 5,5 χ 10 ⁴ N, auf 78% bei einer Konzentration von 1,1 χ 10"³N und auf 15% bei einer Konzentration von 5,5 χ 10"³N. wobei das gesamte Calcium komplex gebunden ist.

Wirkung des menschlichen Eiweißes: Die Aktivität von 100% ist gegeben durch die Bestimmung ohne Eiweiß. Es läßt sich feststellen, daß in Gegenwart von 1 ml einer 20%igen wäßrigen Eiweißlösung diese Aktivität auf 141% gebracht wird und in Gegenwart

•)EDTA = Äthylendiamintetraessigsäure

von 5 ml dieser Lösung auf 158%.

Kaliumferrocyanid ergibt weder eine Beschleunigung noch eine Inhibierung.

Cholesterin wirkt leicht beschleunigend auf die Lipase.

Harnstoff bestimmt keine Veränderung der enzymatischen Aktivität.

Das Netzmittel und Nairiumlaurylsulfat führen beide zu einer Besonderheit: Bei geringer Dosis wirken sie beschleunigend, während sie bei größeren Dosen inhibierend werden, wie sich aus den nachfolgenden Tabellen VIII und IX ergibt:

Tabelle VIII

Übrigens wirkt Natriumdesoxycholat inhibierend, während das Cholat ein Beschleuniger ist, wie dies die in der nachfolgenden Tabelle Xl zusammengefaßten Ergebnisse zeigen.

Konzentration an Netz	Aktivität
mittel im Lnzym-Substrnt-
(iemisch
(y je ml)	<%)
0	100
50	105
100	124
150	148
200	100
300	0
Tabelle IX
Konzentration an Lauryl-	Aktivität
sult'at im Enzym-Substrat-
Gemisch
(yje ml)	(%)

100
1000

100

111

29

LMe wirkung eier Saize der uaiiensauren: uie untersuchten Gallensäuresalze waren Desoxycholsäure, Natriumtaurocholat und Natriumcholat.

Die Wirkung von Natriumtaurocholat war wegen des Umstandes schwer zu definieren, daß diese sich in ziemlich großen Proportionen je nach dem Ursprung zu verändern schien. Die nachfolgende Tabelle X zeigt jedoch, daß allgemein bei geringen Dosen das Taurocholat entweder inaktiv ist oder beschleunigend wirkt, während es bei größeren Dosen stark inhibierend wirkt.

Tabelle X	Aktivität in %	—	Taurocholat	0
Konzentration an	Taurocholat		Nr. 2
Taurocholat	Nr. 1		100
	100	100
0%	107	100
0,01%	115	110
0,025%	119	145
0,05%	80	-
0,1%	0
0,15%
0.6%

Tabelle XI	Aktivität in %	Natrium-	-
Konzentration an	Natriumcholat	ücsuxycholiit
Gallensiiuresalzen		100
	100	100
0%	121	58
0,025%	123	0
0,05%	123
0,1%	123
0,15%

Die Ergebnisse der Tabellen X und XI sind in F i g. > dargestellt: Das Glycerin hat keine Aktivität, noch wirkt es inhibierend oder beschleunigend.

Die Wirkung der Ölsäure führt schließlich zu einer besonderen Feststellung: Ölsäure mit 99,8%iger Reinheit ergibt weder eine Beschleunigung noch eine Inhibierung bei Konzentrationen von 4x10-⁵M und 4 χ IO^⁴ M, während sie eine Beschleunigung um 19"/o bei einer Konzentration von 2 χ 10-' M bewirkt. Eine völlig unreine Ölsäure bei der letztgenannten Konzentration bewirkt eine Beschleunigung von 32%.

Die Ergebnisse der vorstehend angegebenen Untersuchungen zeigen, daß die erfindungsgemäße Lipase ihre Wirkung nicht nur in einem besonders breiten pH-Bereich von 2 bis 10 zeigt, sondern daß darüber hinaus ihre Aktivitätsmaxima bei pH-Werten bei 3,5 und 7,0 liegen.

Diese Eigenschaften bringen es mit sich, daß die erfindungsgemäße Lipase ihre Wirkung sowohl im Darm als auch im Magen entfalten kann.

Ferner entwickelt die erfindungsgemäße Lipase ihre Aktivität auch in Gegenwart von Gallensauren.

Cl iiiiuuilgagcillaLic

somit nicht nur durch die Wahl des zur Züchtung verwendeten Stammes, sondern darüber hinaus durch eine Anzahl von physikalisch chemischen und biochemischen Eigenschaften von anderen mikrobiologisch hergestellten Lipasen. Ihre chemische Struktur wurde, wie diejenige anderer Lipasen, derzeit noch nicht aufgeklärt.

Sie kann daher in der Humanmedizin bei verschiedenen Indikationen verabreicht werden, von denen nachfolgend die wichtigsten genannt werden:

Verdauungsstörungen infolge einer Pankreasinsuf-Fizienz;

sekretorische Insuffizienzen der Seneszenz;

Astheromatose;

Psoriasis (die sehr häufig von Störungen des Fettumsatzes begleitet ist).

Außerdem ist zu erwähnen, daß die erfindungsgemäße Lipase entweder allein oder in Verbindung mit gastrischen Extrakten, Gallenextrakten oder Hemicellnlase verwendet werden kann.

Schließlich ist noch zu erwähnen, daß noch stärker -gereinigte Formen dieser Lipase erhalten werden und in anderen Anwendungsfällen Verwendung Finden können. Diese Formen sind die folgenden:

Gereinigte Formen, welche 50 000 bis 150 000 Einheiten je Gramm enthalten, werden aus Formen mit 5000 bis 15 000 Einheiten je Gramm durch fraktionierte Ausfällungen und durch die Beseitigung inaktiver Sedimente erhallen (welcher Vorgang mit Dialysen "> kombiniert werden kann), wobei die Ausfällungen bei niedriger Temperatur (von etwa -5 bis +5"C) durchgeführt werden und das bequemste, jedoch nicht ausschließliche Lösungsmittel Aceton ist, während andere Lösungsmittel die niederen aliphatischen Aiko- i" hole sind.

Die Präparate mit 5000, 12 000, 50 000 bis 150 000 Einheiten je Gramm können in der Therapeutik unter folgenden Formen verwendet werden:

Einfache Tabletten (Träger: Getreidestärke, Talk),

Zäpfchen (glutenisiert und umhüllt mit Isoke-

ratol),

Drausetabletten (Träger: Natriumbicarbonat, Citronensäure oder jeder andere I rager, :o der in Wasser in Lösung gebracht, zu einem Freisetzen von CO2 führt).

Kapseln (Träger: Paraffinöl).

Diese verschiedenen Formen enthalten die Lipase mit _>ϊ Dosen von 2500, 5000, 25 000 und 50 000 Einheiten und ihre therapeutischen Indikationen sind:

Alle Pankreasinsuffizienzen, welche gegebenenfalls von Steatorrhöen begleite: sind, Dyspepsien,

Assimilationsstörungen der Lipide.

Überempfindlichkeit für Fett, Dyslipemien und Absorptionsstörtingen der Lipide beiGastrektomien.

Die Dosierung beträgt zwei bis fünf Tabletten oder Kapseln täglich.

Außerordentlich hoch gereinigte Formen mit 2 500 000 bis 3 000 000 je Gramm werden aus Lipasen mit 10 000 bis 30 000 Einheiten je Gramm dadurch hergestellt, daß sie auf Kati0nenaustauscherhar7.cn, fixiert werden und durch einen geeigneten Puffer mit einem pH-Wert zwischen 5 und 6 gewählt werden, worauf die mineralischen Elemente des verwendeten Puffers durch irgendeine herkömmliche Methode entfernt werden, insbesondere durch Leiten über ein Molekularsieb, durch Dialyse usw.

Diese gereinigten Präparate werden in injizierbarer Form verwendet, wobei die Lipase in Form von lyophilisiertem Pulver benutzt wird, das /um sofortigen Gebrauch in einer physiologischen Lösung oder in einem Puffer gelöst wird.

Die therapeutischen Indikationen sind die folgend:n:

Xanthomatosen,

Arteriosklerosen.

ernste Pankreasinsuffizienzen, essentielle Hyperlipidemien,

familiäre Dyslipidemien.

Hierzu 3 Matt Zcichnuimcn

Claims

Patentansprüche;

J, Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines stabilen gereinigten Lipase-Präparates hoher Aktivität, wobei eine wäßrige Nährlösung bis zur konstanten enzymatischen Aktivität der lipase in dem Medium aerob fermentiert wird, das Medium anschließend durch Filtrieren abgetrennt und aus dem Filtrat das Lipase-Präparat gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Rhizopus arrhizus Fischer, der bei dem Laboratoire de Cryptogamie in Paris, mit der Hinterlegungsnummer 1916 deponiert ist, einsetzt.
2. Pharmazeutisches Mittel zur Behandlung von gastrointentestinalen Störungen, Dyspepsien und Verdauungsallergien, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Lipase-Präparat, das nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt worden ist, enthält