DE2034593C3 - Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von ZitronensäureInfo
- Publication number
- DE2034593C3 DE2034593C3 DE2034593A DE2034593A DE2034593C3 DE 2034593 C3 DE2034593 C3 DE 2034593C3 DE 2034593 A DE2034593 A DE 2034593A DE 2034593 A DE2034593 A DE 2034593A DE 2034593 C3 DE2034593 C3 DE 2034593C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- parts
- citric acid
- ifo
- acid
- weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
- Y10S435/923—Candida lipolytica
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
- Y10S435/924—Candida tropicalis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/93—Hansenula
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/938—Pichia
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Die FR-PS 15 71 551 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man einen Stamm, der zur Gattung Candida gehört und Zitronensäure anzureichern und
Kohlenwasserstoffe zu assimilieren vermag, in einem wäßrigen Kulturmedium, das wenigstens eines der
Normalparaffine von C9-20 als Hauptlcohlenstoffquelle
enthält, inokuliert, das Kulturmediuni bei einem pH von etwa 4 bis etwa 7,5 inkubiert, bis Zitronensäure in
wesentlicher Menge in der Kulturbriihe angereichert ist, und die so angereicherte Zitronensäure isoliert. Obwohl
der pH-Wert in der FR-PS als zwischen etwa 4 und etwa 7,5 liegend angegeben wird, liegt der bevorzugte
pH-Bereich zwischen 5 und 6,5 wie aus S. 3, Zeile 7/8 der FR-PS hervorgeht.
Dagegen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Umwandlung von (H-)-Isozitronensäure
in Zitronensäure. Dies ist ein ganz anderes erfinderisches Konzept als das erfinderische Konzept gemäß der
genannten FR-PS.
Ferner wird bemerkt, daß der pH-Bereich von 7,0 bis 9,5, bei dem das vorliegende Verfahren durchgeführt
wird, außerhalb des bevorzugten Bereichs von pH 5 bis 6,5 liegt, bei dem das Verfahren der FR-PS 15 71 551
vorteilhaft durchgeführt wird. Tatsächlich liegen alle Ausführungsbeispiele der FR-PS 15 71551 außerhalb
des pH-Bereichs des vorliegenden Verfahrens. Auch darin unterscheiden sich die beiden Verfahren voneinander.
Für die Großherstellung von Zitronensäure ist jedoch das Verfahren dieser FR-PS nicht immer befriedigend,
da die Ausbeute an Zitronensäure auf Basis der verwendeten Kohlenstoffquellen mit zunehmender
Menge der gleichzeitig gebildeten (+ )-Isozitronensäure niedriger wird.
Die Bemühungen den Nachteil des obengenannten Verfahrens auszuschalten, hatten folgendes Ergebnis:
1) Die Fermentationsmaische gewisser Hefen, die Zellen dieser Hefen sowie eine aus der Maische
oder den Hefezellen stammende verarbeitete Substanz haben die Fähigkeit, ( + )-Isozitronensäure
in Zitronensäure umzuwandeln.
2) Diese Hefen gehören zu den Gattungen Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Trichosporon,
Torulopsis oder Pichia und vermögen (+ Msozitronensäure zu bilden.
3) Die Fähigkeit zur Umwandlung ist bei einem pH-Wert von 7,0-9,5 erhöht
4) Es ist möglich, speziell die (+)-Isozitronensäure in Zitronensäure in hoher Ausbeute umzuwandeln,
indem die Fermentationsmaische, die Hefezellen oder eine daraus stammende verarbeitete Substanz
verwendet werden.
Diese Feststellungen sind sehr überraschend, da angenommen wurde, daß in der Fermentationsbrühe, in
den Hefezellen und in deren verarbeiteten Stoffen verschiedene Arten von enzymatischen Wirkungen
vorliegen, durch die die (+)-Isozitronensäure nicht in Zitronensäure, sondern in andere Substanzen umge-
is wandelt wird.
Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen
zugrunde. Sie ist von praktischem Wert für die Großherstellung von Zitronensäure.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren, wie es im Patentanspruch dargelegt ist
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren, wie es im Patentanspruch dargelegt ist
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit beliebigen Hefen und deren Mutanten durchgeführt
werden, die ( + )-Isozitronensäure anzureichern vermögen und zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces,
Hansenula, Torulopsis, Trichosporon oder Pichia gehören. Von diesen Mikroorganismen sind Hefen der
Gattung Candida für die Zwecke der Erfindung an geeignetsten.
Typische Hefen, die für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind nachstehend als Beispiele
genannt In der folgenden Liste sind die IFO-Nummern die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation,
Osaka.
Candida guilliermondii, IFO 0643
Candida parapsilosis, IFO 0708
Candida tropicalis, IFO 0589
Candida mycoderma, IFO 0842
Candida intermedia, IFO 0761
Candida lipolytica, IFO 1437, ATCC 20114
Candida melibiosa, IFO 0961
Candida brumptii, IFO 0744
Candida sp. IFO 1455
Candida parapsilosis, IFO 0708
Candida tropicalis, IFO 0589
Candida mycoderma, IFO 0842
Candida intermedia, IFO 0761
Candida lipolytica, IFO 1437, ATCC 20114
Candida melibiosa, IFO 0961
Candida brumptii, IFO 0744
Candida sp. IFO 1455
Debaryomyces kloeckeri, IFO 0019
Debaryomyces subglobosus, IFO 0794
Debaryomyces hansenii, IFO 0564 und andere
Debaryomyces subglobosus, IFO 0794
Debaryomyces hansenii, IFO 0564 und andere
Hansenula silvicola, IFO 0807
Hansenula subpelliculosa, IFO 1458
Hansenula swaveolens, IFO 0992
Hansenula miso, IFO 0146
Hansenula subpelliculosa, IFO 1458
Hansenula swaveolens, IFO 0992
Hansenula miso, IFO 0146
Kloeckera apiculata, IFO 0865
Torulopsis famata, IFO 0856
Torulopsis Candida, IFO 0380
Torulopsis ernobii, IFO 0654
Torulopsis Candida, IFO 0380
Torulopsis ernobii, IFO 0654
Pichia polymorpha, IFO 0195
Pichia halophila, IFO 0947
Pichia farinosa, IFO 0465
Pichia halophila, IFO 0947
Pichia farinosa, IFO 0465
Saccharomyces acidifaciens, IFO 0468
Saccharomyces willianus, IFO 0248
Saccharomyces willianus, IFO 0248
Trichosporon behrendii, IFO 0844
Trichosporon capitatum, IFO 0743
Trichosporon capitatum, IFO 0743
Brettanomyces claussenii, IFO 1506
Brettanomyces lambicus, IFO 0797
Brettanomyces lambicus, IFO 0797
Diese Hefen werden aus einem ausgewählten
Medium gezüchtet, das den Eigenschaften der Hefe angepaßt ist Als assimilierbare Kohlenstoffquellen
eignen sich Kohlehydrate wie Glucose und Saccharose, Abfallmelasse, Stärkehydrolysat, Holzhydrolysat, verschiedene
Alkohole wie Äthanol und Glycerin, Fettsäuren, wie Essigsäure und Oleinsäure, öle und Fette wie
Sojabohnenöl und Fischöl, Kohlenwasserstoffe, z. B.
Tetradecan, Hexadecan, Leuchtpetroleum und Gasöl, rohe Fraktionen dieser Kohlenwasserstoffe und die
verschiedensten anderen organischen Verbindungen und Stoffe, die von der Hefe assimiliert werden können,
allein oder in Kombination. Von diesen Kohlenstoffquellen sind paraffinische Kohlenwasserstoffe für die
Großherstellung am vorteilhaftesten.
Als Stickstoffquellen können anorganische Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und
Ammoniumphosphat sowie organische Ammoniumsalze wie Ammoniur/.acetat und andere organische
Stickstoffquellen wie Harnstoff, Hefeextrakt, Maisquellwasser und die Hydrolysate verschiedener Proteine
vorteilhaft aliein oder als Gemisch von 2 oder mehreren verwendet werden.
Es ist zweckmäßig, außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verschiedene anorganische Nährstoffe
dem Medium zuzusetzen. Wenn beispielsweise die verwendete Hefe Vitamine zum Wachstum erfordert,
müssen vorher ausreichende Mengen dieser Vitamine (z. B. Biotin, Pantothenat, Inosit) oder ein Material, das
diese Vitamine enthält, z. B. Hefeextrakt, dem Medium zugesetzt werden.
Der pH-Wert während der Kultivierung liegt gewöhnlich zwischen etwa 3 und 7, vorzugsweise
zwischen etwa 4 und 6,5.
Der pH-Wert des Mediums sinkt mit fortschreitender Fermentation. Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen
erzielt, wenn ein neutrales Salz, z. B. Calciumcarbonat, Calciumacetat oder Natriumacetat, dem Medium vorher
als neutralisierendes Mittel zugesetzt wird. Dieses neutralisierende Mittel kann mehrmals während der
Kultivierungsdauer zugesetzt werden. Natürlich können in Fällen, in denen ein neutralisierendes Mittel während
der Kultivierung zugesetzt wird, auch andere neutralisierende Verbindungen wie Natriumhydroxyd, Calciumhydroxyd
und wäßriges Ammoniak als Teilneutralisatoren verwendet werden.
Die Kultivierung der Hefen wird gewöhnlich unter aeroben Bedingungen durchgeführt Wenn die Bestandteile
des Mediums in Wasser unlöslich oder schwerlöslich sind, sind ausreichendes Rühren und Vermengen
wesentlich. Die übliche Schüttelkultur und die Rührkultur unter Belüftung genügen im wesentlichen diesen
Bedingungen. Hierbei werden zuweilen gute Ergebnisse erzielt, wenn dem Medium vorher ein Antischaummittel
oder eine oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wird. Die Bebrütungstemperatur ist bei den verschiedenen
Hefespezies unterschiedlich, jedoch wird gewöhnlich ein Bereich von 25 bis 35° C bevorzugt.
Die auf diese Weise erhaltene Fermentationsbrühe kann als solche für die Zwecke der Erfindung verwendet
werden. Wenn die Abtrennung der Hefezellen erwünscht ist, kann dies nach beliebigen üblichen
Verfahren, z. B. durch Filtration, Zentrifugierung, Sedimentation und Dekantierung, erfolgen.
Die Fermentationsbrühe oder die Zellen können einer mechanischen oder chemischen Behandlung zur
Dehydratisierung, Reinigung oder Extraktion von aktiven Fraktionen und Stabilisierung der Aktivität
behandelt werden, solange ihre ursprüngliche Fähigkeit, (+)-Isozitronensäure in Zitronensäure umzuwandeln,
nicht beeinträchtigt wird.
Der hier gebrauchte Ausdruck »verarbeitetes Material«
umfaßt alle Präparate in Form von flüssigen Pasten und Pulvern, die beispielsweise durch Behandlung oder
Extraktion mit Lösungsmitteln (z. B. Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Alkohole, Aceton), durch Behandlung
mit oberflächenaktiven Mitteln, chemische Behandlung (z.B. Aussalzen), durch physikalisch-chemisehe
Behandlungen (z. B. verschiedene Arten der Chromatographie, z. B. mit Ionenaustauschercellulose,
Ionenaustauscherharzen und Aktivkohle), durch mechanische Behandlung (z. B. Gefriertrocknung, Mahlen,
Konzentrierung, Trocknen, Ultraschallbehandlung) der Brühe oder Hefezellen herstellbar sind.
Als (+)-Isozitronensäure, die in Zitronensäure
umzuwandeln ist kann die freie Säure, ein Salz dieser Säure oder ein Material, das eine oder beide dieser
Verbindungen enthält verwendet werden, gleichgültig, ob es sich um ein gereinigtes Präparat oder ein rohes
Produkt handelt Wenn beispielsweise die (+)-Isozitronensäure in der in der beschriebenen Weise hergestellten
Kulturbrühe angereichert worden ist, kann die Brühe als solche verwendet werden. Es ist auch möglich,
eine Lösung, eine Aufschlämmung oder eine getrocknete Masse der (-i-)-Isozitronensäure, eines Salzes dieser
Säure oder eines Gemisches dieser Verbindungen zu verwenden, die aus dieser Brühe nach üblichen, allein
oder in Kombination angewandten Verfahren wie Filtration, Zentrifugalabscheidung, Erhitzen, Ausfällung,
Säulenchromatographie, Behandlung mit Aktivkohle, Konzentrierung und Dehydratisierung erhalten werden
können.
Gemäß der Erfindung wird die Umwandlung von (-t-)-Isozitronensäure in Zitronensäure in einem wäßrigen
Medium durchgeführt Die Anteile an (-t-)-Isozitronensäure
und aktiven Materialien, d. h. Fermentationsbrühe, Hefezellen und verarbeiteten Stoffen, sollten so
gewählt werden, daß die Ausbeute an Zitronensäure maximal ist. Im allgemeinen genügen etwa 10 bis 100
Gew.-Teile des aktiven Materials, gerechnet auf Trockenbasis der Hefezellen, pro 100 Gew.-Teile
(+ )-Isozitronenaäure.
Die erforderliche Umwandlungszeit beträgt etwa 0,5 bis 10 Stunden. Der pH-Wert des Umwandlungssystems
kann von neutral bis alkalisch reichen und liegt insbesondere zwischen etwa 7,0 und 9,5.
Die Temperatur liegt zwischen etwa 25 und 45° C. Das Umwandlungssystem kann gegebenenfalls gerührt werden.
Um den pH-Wert des Systems während der gesamten Umwandlungsdauer innerhalb eines geeigneten Bereichs
zu halten, kann eine Pufferlösung verwendet werden, die Phosphate, Tris(hydroxymethyl)aminomethan,
Glycin, Borate, Salzsäure und Natriumhydroxyd in geeigneter Kombination enthält. Es ist auch möglich,
den pH-Wert des Systems während der Umwandlung von Zeit zu Zeit durch Zusatz einer Säure oder eines
alkalischen Reagens während der Reaktion zu korrigie-
Die Zitronensäure und ( + )-Isozitronensäure im System werden nach der Pentabromaceton-Methode
von Kuratomi (Biochem. 27, 72 [1955]) und nach der enzymatischen Methode (Methoden der enzymatischen
Analyse, Seite 318 [Verlag Chemie]) bestimmt.
Die Umwandlung ist beendet, wenn die Anreicherung
der Zitronensäure eine vorbestimmte Höhe erreicht hat.
Aus diesem System kann die Zitronensäure unmittel-
bar oder nach vorheriger, beispielsweise durch Zentrifugierung oder Filtration vorgenommener Entfernung der
Feststoffe des Systems isoliert werden.
Die Zitronensäure kann beispielsweise durch Filtration, Zentrifugierung, Erhitzen, Fällung, Säulenchromatographie,
Behandlung mit Aktivkohle und Konzentrierung isoliert und gewonnen werden. Zur Erleichterung
der Isolierung kann der pH-Wert der Brühe nach Belieben eingestellt werden. Wenn beispielsweise das
unlösliche Calciumsalz im System vorhanden ist, ist es zweckmäßig, das System anzusäuern, um das Salz löslich
zu machen, und dann die Zellen beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration abzutrennen. Die auf
diese Weise von Feststoffen befreite Lösung kann gegebenenfalls durch Zusatz von Natriumhydroxyd, !5
Calciumcarbonat oder Kalkmilch neutralisiert werden. Aus dem so erhaltenen Gemisch wird die Zitronensäure
und, falls vorhanden, auch die nicht umgesetzte (-H)-Isozitronensäure in Form von Calciumsalzen
ausgefällt, die dann beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren und anschließendes Trocknen isoliert
werden. Hierbei wird ein weißes Pulver von Calciumzitrat oder ein weißes Pulvergemisch von Calciumzitrat
und Calcium-( + )-isozitrat erhalten. Aus diesem Produkt kann beispielsweise durch Neutralisation, Ionenaustauschbehandlung,
Säulenchromatographie, Entfärbung, Filtration und Kondensation reine Zitronensäure
erhalten werden.
Durch Wiederholung dieses Zyklus kann schließlich die gesamte (-i-)-Isozitronensäure in Zitronensäure
umgewandelt werden.
In den folgenden Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.
35
150 Raumteile einer Lösung von 14% Glucose, 0,1% NH4Cl, 0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O und
0,3% Maisquellwasser (pH 5,8) werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 200
Raumteilen hat. Nach der Sterilisation des Fermenters werden 2,5 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat zugesetzt.
Das Medium wird dann mit Candida parapsilosis var. tokyoensis (IFO 1453) geimpft und 5 Tage bei 28°C
bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,5. Bei dieser Fermentation werden 4,1 %
( + )-Isozitronensäure, bezogen auf die Kulturbrühe, und gleichzeitig 1,3% Zitronensäure auf der gleichen Basis
gebildet. 100 Raumteile der Kulturbrühe werden mit 3 η-Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dann zentrifugiert.
Die Zellenfraktion wird in 100 Raumteilen Wasser suspendiert und zentrifugiert. Die Zellen werden
abschließend in 50 Raumteilen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer
bei pH 8,5 suspendiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit zusammengegeben und durch Zusatz einer
wäßrigen 5 n-Natriumhydroxydlösung auf pH 7,0
eingestellt. Das System wird 30 Minuten bei 1000C gehalten, wobei sich eine Fällung bildet. Die Fällung
wird heiß abgenutscht. Hierbei wird ein Gemisch von Calciumisozitrat und Calciumzitrat in fast quantitativer
Ausbeute erhalten.
Dieses Gemisch wird in etwa 10 Raumteilen Wasser suspendiert. Zur Suspension wird tropfenweise 50%ige
Schwefelsäure unter Rühren gegeben, bis das Filtrat bei Zusatz von Bariumchloridlösung leichte Anzeichen von
Sulfatradikalen zeigt. Man erhitzt dann etwa 30 Minuten in siedendem Wasser, entfärbt nach dieser Zeit und
filtriert heiß. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt Während eine gebildete Calciumsulfatfällung
entfernt wird, wird weiter eingeengt, bis ein Sirup von niedriger Konsistenz erhalten wird. In einer
Glaskolonne wird ein Gemisch von 350 Gew.-Teilen ICeselgel von Chromalographiereinheit in 250 Raumteilen
0,5 n-H2SO4 und etwa 2500 Raumteilen Chloroform,
das 15% n-Butanol enthält, gegeben. Auf die Säule wird
ein Gemisch einer Lösung des obengenannten Konzentrats in etwa 20 Raumteilen 0,5 JvH2SO4 und 30
Gew.-Teilen des gleichen Kieselgels von Chromatographiereinheit zusammen mit einer geringen Chloroformmenge
gegeben. Das Chlororform läßt man durch seine Schwere nach unten ablaufen.
Nach diesem Durchgang läßt man durch die jKJeselgelschicht von oben 2 Elutionsmittel (verschiedene
Mischungen von n-Butanol und Chloroform), von denen das eine 25% n-Butanol und das andere 35%
n-Butanol enthält, mit 0,5 n-H2SO4 in dieser Reihenfolge,
falls notwendig unter Druck, durchlaufen. Mit dem zweiten Elutionsmittel, das 35% n-Butanol enthält,
werden zwei saure Fraktionen eluiert
Von den beiden Fraktionen wird die zweite Fraktion in eine wäßrige Phase überführt, die dann unter
vermindertem Druck eingeengt wird, wobei 2.5 Gew.-Teile Isozitronensäure in Form eines Sirups
erhalten werden. Aus der vorhergehenden sauren Fraktion werden etwa 0,7 Gew.-Teile Zitronensäure
isoliert
Die erhaltene Isozitronensäure wird in 25 Raumteilen Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzsäure-Puffer bei
pH 8,5 gelöst. Die Lösung wird mit der vorher abgetrennten Zellensuspension vereinigt Das Gemisch
wird mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und 6 Stunden bei 320C stehengelassen. Dieses
Reaktionsgemisch enthält 1,96 Gew.-Teile Zitronensäure. Die Zellen werden abfiltriert und das Filtrat wird in
der oben beschriebenen Weise behandelt wobei 1,05 Gew.-Teile Zitronensäure erhalten werden.
Diese Ausbeute zusammen mit der vorher erhaltenen Ausbeute von 0,7 Gew.-Teilen ergibt eine Gesamtausbeute
von 1,75 Gew.-Teilen Zitronensäure.
In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat, werden 150 Raumteile eines
Mediums, das aus 8% eines Ci2- Cie-n-Paraffingemisches
(Reinheit 92%), 0,3% NH4CI, 0,05% KH2PO4,
0,05% MgSO4 · 7 H20,0,05% FeSO4 · 7 H2O und 0,5%
CaCO3 besteht (pH 6,5) und mit 0,00004 Gew.-Teilen
Bromkresolgrün sterilisiert worden ist, mit Candida lipolytica (IFO 1437) geimpft Das Medium wird 3 Tage
bebrütet und während der Bebrütung mit NH4OH bei einer gelblichgrünen Farbe (entsprechend pH 4 — 5)
gehalten. Nach dieser Bebrütungszeit enthält die Kulturbrühe 49 mg Zitronensäure/ml und 52 mg Isozitronensäure/ml.
Die Kulturbrühe hat einen pH-Wert von 4,5. 100 Raumteile der Kulturbrühe werden zur
Entfernung der Zellen durch Filterpapier abgenutscht. Das Filtrat wird durch Zusatz von Ca(OH)2 auf pH 7,5
eingestellt. Es wird dann unter leicht vermindertem Druck zum Sieden erhitzt. Nach 30 Minuten wird das
System gekühlt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und in einem Luftstrom getrocknet. Hierbei wird
Calciumzitrat erhalten, das 4,7 Gew.-Teile Zitronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumteilen Wasser
suspendiert. Die Suspension wird mit 5n-H2SO4
neutralisiert. Nach Zusatz von 1 Gew.-Teil Aktivkohle
zur überstehenden Flüssigkeit wird filtriert. Das Filtrat
wird unter vermindertem Druck auf einen Sirup von niedriger Konsistenz eingeengt (wobei eine etwa
gebildete Fällung aus Calciumsulfat von Zeit zu Zeit abfiltriert wird). Das Konzentrat wird in einem
Kühlschrank stehengelassen, worauf 4,05 Gew.-Teile kristalline Zitronensäure (ohne Kristallwasser) erhalten
werden.
Das Filtrat, aus dem das Caldciumzitrat entfernt worden ist, enthält 4,8 Gew.-Teile Isozitronensäure. Zu
diesem Filtrat wird die gesamte Zellenmenge gegeben, die aus der obengenannten Kulturbrühe abgetrennt
worden ist (100 Raumteile), worauf mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt wird. Nach Zusatz von
1% Chloroform (Volumen/Volumen) wird das Gemisch 4 Stunden bei 320C stehengelassen. Nach dieser Zeit
werden die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird in der gleichen Weise, wie vorstehend für die Isolierung der
Zitronensäure beschrieben, aufgearbeitet Hierbei werden 3,9 Gew.-Teile kristalline Zitronensäure (ohne
Kristallwasser) erhalten.
100 Raumteile der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühe werden mit 5 n-NaOh auf pH 8,5
eingestellt, worauf 1 Volum-°/o Benzol zugesetzt wird. Das System wird in einem Fermenter 4 Stunden
stehengelassen. Nach dieser Zeit enthält es 83 mg Zitronensäure/ml und 17 mg Isozitronensäure/ml. Diese
Werte stellen erhebliche Verbesserungen dar.
Die Gesamtmenge der Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei
Zitronensäure in einer Ausbeute, die 6,9 Gew.-Teilen wasserfreien Kristallen entspricht, erhalten wird.
In einen Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, werden 100 Raumteile einer Lösung
gegeben, die 0,3% NH4Cl, 0,1% KH2PO4, 0,1%
MgSO4 · 7 H2O und 0,1 % Hefeextrakt in Leitungswasser
enthält. Nach der Sterilisation werden 100 Raumteile einer 25%igen sterilen Lösung von Calciumacetatmonohydrat
in jeden Kolben gegeben. Alle Kolben werden mit Candida IFO-1455 geimpft Der geimpfte Fermenter
wird 7 Tage bebrütet Nach dieser Zeit hat die Fermentationsbrühe einen pH-Wert von 5,5. Bei dieser
Fermentation werden 2,8% Isozitronensäure, bezogen auf die Kulturbrühe, erhalten.
Bei diesem Versuch wird keine Zitronensäure festgestellt 100 Raumteile der Kulturbrühe werden 30
Minuten einer Ultraschallbehandlung bei 19 kHz unterworfen. Nach dieser Zeit wird die Kuiturbrühe auf pH
84 eingestellt Sie wird 4 Stunden bei 320C stehengelassen,
worauf die Ausbeute an Zitronensäure mit 2,4% ermittelt wird. Die Zitronensäure wird auf die in Beispiel
2 beschriebene Weise aus der Kulturbrühe isoliert Hierbei werden 824% der in der Probe der Kulturbrühe
enthaltenen Zitronensäure in Form von Kristallen erhalten.
Eine Lösung, die 0,1% NH4NO3, 0,05% KH2PO4,
0,05% MgSO4 - 7 HaO und 03% Maisquellwasser in
Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt 150 Raumteile der Lösung werden in einen Fermenter
gegeben, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, worauf 9 Gew.-Teile Glycerin oder 9 Raumteile
Äthanol zugesetzt werden. Nach der Sterilisation werden 4,5 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat in den
Fermenter gegeben. Der Fermenter wird mit Hansenula subpelliculosa (IFO 1458) geimpft Das geimpfte
Medium wird 5 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,5.
Bei diesem Fermentationsversuch werden bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 1,5%
Isozitronensäure und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 1,4% Isozitronensäure erhalten. Zitronensäure
wird gleichzeitig gebildet, aber ihre Menge beträgt bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle
0,9% der Kulturbrühe und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 0,5%. Die Kulturbrühe
wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei stets reine Zitronensäure in einer
Ausbeute von 83 bis 85% erhalten wird. Die überstehenden Flüssigkeiten, die nach der Ausfüllung
des Calciumzitrats bei dem vorstehend beschriebenen Versuch erhalten werden, werden für jede Probe der
Kulturbrühe zusammengegeben. Zu 100 Raumteilen der vereinigten überstehenden Flüssigkeit werden 3 Teile
(auf nasser Basis) der Zellen von Pichia polymorpha IFO 0195 gegeben, die 3 Tage bei 28°C auf einem Medium
(pH 6) kultiviert worden sind, das aus einer Lösung von 6% Glucose, 6% Calciumacetatmonohydrat, 0,05%
NH4Cl, 0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO4 ■ 7 H2O und
0,2% Maisquellwasser besteht. Die Flüssigkeit wird dann mit wäßrigem Ammoniak auf pH 84 eingestellt
Die Gemische werden 5 Stunden bei 34° C stehengelassen.
Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Zitronensäure 1,2% bzw. 0,69%. Diese Reaktionsgemische
werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet Die Ausbeuten an Zitronensäure betragen
86% bzw. 83%, bezogen auf die Gemische.
Eine Lösung, die 12% Glucose, 0,1% NH4CI, 0,05%
KH2PO4, 0.05% MgSO4 · 7 H2O und 0,2% Maisquellwasser
in Leitungswasser enthält wird auf pH 5,8 eingestellt Je 150 Raumteile der Lösungen werden in
Fermenter gegeben, die ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen haben, worauf sterilisiert wird. In jeden
Fermenter werden 6 Gew.-Teile steriles Calciumcarbonat gegeben, worauf die Medien mit Debaryomyces
kloeckeri IFO 0015, Trichosporon behrendii IFO 0844 bzw. Brettanomyces claussenii IFO 1506 geimpft
werden. Jeder geimpfte Fermenter wird 5 Tage bebrütet
Die Bildung an (+)-Isozitronensäure beträgt 0,6% bei Debaryomyces kloeckeri, 1,0% für Trichosporon behrendii
und 1,0% bei Brettanomyces clausseniL Gleichzeitig wird Zitronensäure in einer Ausbeute Von 0,5%
bei Debaryomyces, 0,6% bei Trichosporon und 1 % bei Brettanomyces claussenii gebildet Die Fermentationsbrühen
werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei Zitronensäure in fast quantitativer
Ausbeute bei den Mikroorganismen erhalten wird. Wenn die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen
Isozitronensäurefraktionen (d.h. nach Ausfüllung von
Calciumzitrat erhaltene überstehende Flüssigkeiten und die Mutterlaugen nach der Kristallisation der Zitronensäure)
für jeden Mikroorganismus vereinigt werden, wird festgestellt, daß 97% der in jeder Kulturbrühe
gebildeten Isozitronensäure darin enthalten sind.
Zu jedem der vorstehenden Produkte wird die Gesamtmenge der nassen Zellen gegeben, die durch
Zentrifugieren jeder Kulturbrühe für 20 Minuten bei 5000 UpM erhalten werden, so daß die Produkte in der
gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, reagieren können. Es wird festgestellt, daß bei den Mikroorganismen
die Isozitronensäure mit einem Umsatz von etwa 83% in Zitronensäure umgewandeil: wird. Jedes der
Reaktionsprodukte wird einer Behandlung in der oben beschriebenen Weise zur Isolierung der Zitronensäure
unterworfen. Hierbei wird Zitronensäure in einer Ausbeute von 85% erhalten.
Eine Lösung, die 20% Melasseabfälle von Rohrzucker (12% reduzierender Zucker als Glucose), 0,10% NH4Cl,
0,05% KH2PO4 und 0,05% MgSO4 in Leitungswasser
enthält, wird auf pH 5,5 eingestellt. 200 Raumteile der Lösung werden in einen Fermenter gegeben, der ein
Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, worauf sterilisiert wird.
In den Fermenter werden dann 6,0 Gew.-Teile steriles
Calciumcarbonat gegeben. Zum Impfen des Mediums wird Candida guilliermondii var. membranaefaciens IFO
1454 verwendet. Der Fermenter wird auf die oben beschriebene Weise mechanisch geschüttelt. Nach
beendeter Kultivierung hat die Kulturbrühe einen pH-Wertvon5,5.
Bei dieser Fermentation werden 3,75% Zitronensäure (gerechnet als Zitronensäure ohne Kristallwasser),
bezogen auf die Kulturbrühe, erhalten. Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise werden aus dieser
Kulturbrühe 9,4 Gew.-Teile (Trochengewicht) Calciumzitrat pro 200 Raumteile Kulturbrühe isoliert. Diese
Menge entspricht 7,2 Gew.-Teilen Zitronensäure (ohne Kristallwasser).
Die abgetrennten nassen Zellen werden gefriergetrocknet und gelagert. In 100 Raumteilen Dinatriumphosphat-Monokaliumphosphat-Puffer,
der einen pH-Wert von 8,5 hat, werden 5 Gew.-Teile Monocaliumisozitrat gelöst. Zur Lösung werden 5 Gew.-Teile
der aufbewahrten trockenen Zellen gegeben. Das Gemisch wird gut gerührt und mit Natriumhydroxydlösung
genau auf pH 8,5 eingestellt.
Das Gemisch wird 5 Stunden bei 32°C stehengelassen, worauf der Mikroorganismus abfiltriert wird. Die
überstehende Flüssigkeit wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt, wobei 3,55 Gew.-Teile
Zitronensäure erhalten werden.
In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat. werden 150 Raumteile eines
Mediums, das 8% eines C^-Cie-n-Paraffingemisches
(Reinheit 92%), 0,3% NH4Cl, 0,05% KH2PO4, 0,05%
MgSO4 · 7 H2O, 0,05% FeSO4 · 7 H2O und 0,5%
CaCO3 enthält (pH 6,5), mit Torulopsis Candida IFO 0380
geimpft, worauf 3 Tage auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise bebrütet wird. Nach der Bebrütungszeit
enthält die Kulturbrühe 21 mg Zitronensäure/ml und 28 mg(+)-Isozitronensäure/mI. 100 Raumtei-Ie
der Kulturbrühe werden mit 5 n-NaOH auf pH 8,5 eingestellt, worauf 1 Raumteil Xylol zugesetzt wird. Das
Gemisch wird unter Rühren bei 35° C stehengelassen. Hierbei werden 41 mg Zitronensäure/ml und 8 mg
(+)-Isozitronensäure/ml erhalten.
Durch Aufarbeitung des Reaktionsgsgemisches auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise werden 3,4
Gew.-Teile Zitronensäure (ohne Kristallwasser) erhalten.
Claims (1)
1
Patentanspruch:
Patentanspruch:
Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet,
daß man 100 Gew.-Teile (+)-Isozitronensäure
mit einer Fermeuiationsbrühe einer Hefe, die zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces,
Hansenula, Trichosporon, Torulopsis oder Pichia gehört und die 10 bis 100 Gew.-Teile
Hefezellen (auf Trockenbasis) oder ein verarbeitetes Material, das aus dieser Menge der Kulturbrühe
oder der Zellen erhalten worden ist, enthält, bei einem pH-Wert von 7,0 bis 9,5 in Berührung bringt
und bei einer Temperatur zwischen 25 und 45° C behandelt und anschließend die so aus (+)-Isozitronensäure
gebildete und angereicherte Zitronensäure isoliert
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP44056272A JPS5144195B1 (de) | 1969-07-15 | 1969-07-15 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2034593A1 DE2034593A1 (de) | 1971-01-28 |
DE2034593B2 DE2034593B2 (de) | 1980-11-06 |
DE2034593C3 true DE2034593C3 (de) | 1981-10-15 |
Family
ID=13022438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2034593A Expired DE2034593C3 (de) | 1969-07-15 | 1970-07-11 | Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3733253A (de) |
JP (1) | JPS5144195B1 (de) |
BE (1) | BE753506A (de) |
DE (1) | DE2034593C3 (de) |
FR (1) | FR2055133A5 (de) |
GB (1) | GB1257900A (de) |
NL (1) | NL173067C (de) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BE757141A (fr) * | 1969-10-23 | 1971-04-07 | Pfizer | Procede de fermentation pour la production de l'acide citrique |
JPS519029B2 (de) * | 1973-02-14 | 1976-03-23 | ||
JPS5946598B2 (ja) * | 1977-12-14 | 1984-11-13 | 株式会社バイオリサ−チセンタ− | 微生物による長鎖脂肪酸類の製造法 |
US4414329A (en) * | 1980-01-15 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
US4985365A (en) * | 1981-11-28 | 1991-01-15 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Process for producing optically active benzyl alcohol compound |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4942556B1 (de) * | 1967-06-07 | 1974-11-15 |
-
1969
- 1969-07-15 JP JP44056272A patent/JPS5144195B1/ja active Pending
-
1970
- 1970-07-11 DE DE2034593A patent/DE2034593C3/de not_active Expired
- 1970-07-13 GB GB1257900D patent/GB1257900A/en not_active Expired
- 1970-07-14 NL NLAANVRAGE7010395,A patent/NL173067C/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-07-15 BE BE753506D patent/BE753506A/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-07-15 US US00055229A patent/US3733253A/en not_active Expired - Lifetime
- 1970-07-15 FR FR7026022A patent/FR2055133A5/fr not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2034593B2 (de) | 1980-11-06 |
FR2055133A5 (de) | 1971-05-07 |
BE753506A (fr) | 1970-12-16 |
JPS5144195B1 (de) | 1976-11-26 |
GB1257900A (de) | 1971-12-22 |
NL7010395A (de) | 1971-01-19 |
NL173067B (nl) | 1983-07-01 |
NL173067C (nl) | 1983-12-01 |
DE2034593A1 (de) | 1971-01-28 |
US3733253A (en) | 1973-05-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3853921T2 (de) | Verfahren zur produktion von ethanol, glycerin und bernsteinsäure. | |
DE69833489T2 (de) | Verfahren zur umwandlung von biomassa in chemikalien und brennstoffe | |
DE69226224T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Chitosan | |
EP0144017B1 (de) | Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure | |
DE3486359T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Riboflavin. | |
DE2034593C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure | |
EP0149744A1 (de) | Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure | |
DE69424765T2 (de) | Kontinuierliches Fermentationsverfahren für die optimale gleichzeitige Herstellung von Propionsäure und Vitamin B12 | |
CH629852A5 (de) | Verfahren zur herstellung von ubichinon-10. | |
DE2004299C3 (de) | Verfahren zum aeroben Züchten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen | |
DE2303495C2 (de) | Herstellung von Ergosterin und seinen Estern | |
DE1926178A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Arabit | |
DE1695326A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Nicotinsaeureamidadenindinucleotid | |
DE2357345A1 (de) | Verfahren zur biotechnischen herstellung von hefe und deren verwendung | |
DE3041224A1 (de) | Verfahren zur fermentativen herstellung von d(-)- (beta) -hydroxyisobuttersaeure | |
DE2456139A1 (de) | Neues verfahren zur herstellung des antibiotikums 20.798 r.p. | |
DE2202701C3 (de) | Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zitronensäure | |
DE2120676A1 (de) | Verfahren zur asymmetrischen Reduktion von Seco Steroiden | |
US2970946A (en) | Process for the production of tetracycline by fermentation | |
DE1925952C3 (de) | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit | |
DE2000879A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Uridin-5'-diphospho-glucose | |
DE1070176B (de) | Verfahren zur Herstellung neuer Steroidverbindungen der 1, 4 - Pregnadienreihe | |
DE1517837C (de) | Verfahren zur biochemischen Herstellung von delta-(N-Acetyl)-L-Ornithin | |
DE1517825C (de) | Verfahren zur biotechnischen Her stellung von L Valin | |
DE2054785C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5 '-diphospho-cholin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |