DE2034593A1 - Verfahren zur Herstellung von Citro nensaure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Citro nensaureInfo
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Description
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
9. Juli 197Ö Kl/Ax/bz
Takeda Chemical Industries, Ltd.
27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)
In der französischen Patentschrift 1 571 55I wird
festgestellt, daß eine gewisse Hefe Citronensäure und/
oder (-i-)-Isocitronensäure anhäuft. Für die Großherstellung
von Citronensäure ist jedoch das Verfahren
dieses französischen Patents nicht immer befriedigend,
da die Ausbeute an Citronensäure auf Basis der verwendeten Kohlenstoffquellen mit zunehmender Menge der
gleichzeitig gebildeten (+)-Isocitronensäure niedriger wird.
Die Bemühungen der Anmelderin, den Nachteil des oben genannten Verfahrens auszuschalten, hatten folgendes
Ergebnis:
1) Die Permentätionsipaisehe gewisser Hefen, die Zellen
dieser Hefen sowie eine aus der Maische oder den Hefezellen stammende verarbeitete Substanz haben
die Fähigkeit, (-f-)-Isocitronensäure in Citronensäure
umzuwandeln,
2) Diese Hefen gehören zu den Gattungen Candida,
Brettanomyces, Dobaryoinyces, Hansenula, Kloeckera,
Trichosporon, Torulopsis oder Pichia und vermögen
(+)-Ißocltronensäure zu bilden.
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2UJ4.593
3) Die Fähigkeit zur Umwandlung ist bei einem pH-Wert
von 7,0 - 9,f> erhöht.
h) Es ist möglich, speziell die (+)-Tsocitronensäure
in Citronensäure in hoher'Ausbeute umzuwandeln, indem
die Fermentationsmaische, die Hefezellen oder eine daraus stammende verarbeitete Substanz verwendet
werden.
_ Diese Feststellungen sind sehr überraschend, da ange-
™ nommen wurde, daß in der Fermentationsbrühe, in den
Hefezellen und in deren verarbeiteten Stoffen verschiedene Arten von enzymatisehen Wirkungen vorliegen, durch
die die (h)-IsocLtronensäure nicht in Citronensäure,
sondern in andere Substanzen umgewandelt wird.
Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zugrunde. Sie ist von praktischem Wert für die Großherstellung
von Isocitronensäure.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, das dadurch gefc
kennzeichnet ist, daß man (f)-Isocitronensäure mit
einer Fermentationsbrühe einer Hefe, die (+)-Isocitronensäure
anzuhäufen vermag und zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Kloeckera,
Trichosporon, Torulopsis oder Pichla gehört, mit den Zellen dieser Hefe oder einer davon stammenden verarbeiteten
Substanz bei einem pH-Wert von 7»0 - 9*5
in Berührung bringt, wodurch die (+)-Isocitronensäure in Citronensäure umgewandelt wird, und anschließend
die so angehäufte Citronensäure isoliert.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit beliebigen Hefen und deren Mutanten durchgeführt v/erden, die .
(-hj-lsocitroriensäure anzureichern vermögen.und zur
22Si
009**5 j
■ - 3 -
Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula,
Kloeckera, Torulopsis, Trichosporon oder Pichia gehören. Von diesen Mikroorganismen sind Hefen der
Gattung Candida für die Zwecke der Erfindung am geeignetsten.
Typische Hefen, die für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind nachstehend als Beispiele
genannt. In der folgenden Liste sind die IFO-Nummern die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermenta- %
tion, Osaka.
Candida guilliermondil, IPO Ö643 Candida parapsilosis, TFO 0?08
Candida tropicalIs, IFO O589
Candida mycoderma, IFO O842
Candida intermedia, TFO O76I
Candida lipolytica, IFO 1^57, ATCC 201IM
Candida melibiosa, IPO O96I
Candida brumptil, IFO 07^^
Candida sp. IFO 1455 und andere Candida-Spezies
Debaryomyces kloeckeri, IFO OOI9
Debaryomyces subglobosus, IFO 0794
Debaryo'myces hansenii, IFO OfjtWt und andere Debarypmyces
Spezies
Hansenxilc sllvicola, IFO 08ογ
Hansenula subpelliculosa, IFO 1456
Hanrenula iu.-aveolens, .'IFO 0992
Hansenula miso, IFO 0146 und andere Hansenula-Spc-z-ies
Kloeckera apiculata, IFO O8ö5 und andei'e IQoeckera-
ßpezies
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Torulopsis famata, IFO O856
Torulopsis Candida, IPO O38O
Torulopsis Candida, IPO O38O
Torulopsis ernobii, IFO 0654 und andere Torulopsis-
Spezies
Pichia polymorpha, IFO 0195
Plchia halophila, IFO 0947
Pichia farinosa, IFO 0465 und andere Pichia-Spezies
Saccharomyces acidifaciens, IFO 0468
Saceharomyces willianus, IFO 0248 und andere Saccharo-
myces-Spezies
Trlchosporon behrendii, IFO 0844 Trichosporon capita turn, IFO O?4j5 und andere Trichospo-
ron-Spezies
Brettanomyces elaussenii, IFO I506
Brettanomyces lambicus, IFO O797 und andere Brettano-
myces-Spezies
Diese Hefen werden aus einem ausgewählten Medium gezUchtetj,
das den Eigenschaften der Hefe angepaßt ist. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlehydrate
wie Glucose, Saccharose usw., Abfallmelasse, Stärkehydrolysat, Holzhydrolysat, verschiedene Alkohole
wie Äthanol und Glycerin, Fettsäuren, wie Essigsäure und Oleinsäure, öle und Fette wie Sojabohnenöl
und Fischöl, Kohlenwasserstoffe, z. B. Tetradecan,
Hexadecan, Leuchtpetroleum und Gasöl, rohe Fraktionen
dieser Kohlenwasserstoffe und die verschiedensten anderen organischen Verbindungen und Stoffe, die von der
Hefe assimiliert werden können, allein oder in Kombination. Von diesen Kohlenstof!'quellen sind paraffinische Kohlenwasserstoffe für die Großherstellung am
vorteilhaftesten.
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Als Stickstoffquellen können anorganische Ammoniumsalze
wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw. sowie organische Ammoniumsalze wie Ammoniumacetat
und andere organische Stickstoffquellen wie Harnstoff, Hefeextrakt, Maisquellwasser und die Hydrolysate verschiedener
Proteine vorteilhaft allein oder als Gemisch von 2 oder mehreren verwendet werden.
Es ist zweckmäßig, außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
verschiedene anorganische· Nährstoffe dem *
Medium zuzusetzen. Wenn beispielsweise die verwendete Hefe Vitamine zum Wachstum erfordert, müssen vorher ausreichende
Mengen dieser Vitamine (z. B. Biotin, Pantothenat, Inosit) oder ein Material, das diese Vitamine
enthält, z. B. Hefeextrakt, dem Medium zugesetzt werden.
Der pH-Wert während der Kultivierung liegt gewöhnlich
zwischen etwa j5 und 7* vorzugsweise zwischen etwa 4 und
6,5.
Der pH-Wert des Mediums sinkt mit fortschreitender Fermentation*
Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen er- i
zielt, wenn ein neutrales Salz, ζ. B. Kaliumcarbonat,
Kalziumacetat oder Natriumacetat, dem Medium vorher als
neutralisierendes Mittel zugesetzt wird. Dieses neutralisierende Mittel kann mehrmals während der Kultivierungsdauer zugesetzt werden. Natürlich können in Fällen, in
denen ein neutralisierendes Mittel während der Kultivierung zugesetzt wird, auch andere neutralisierende Verbindungen
wie Natriumhydroxyd, Kalziumhydroxyd und wäßriges Ammoniak als Teilneutralisatoren verwendet werden.
Die Kultivierung der Hefen wird gewöhnlich unter aeroben
Bedingungen durchgeführt..Wenn die Bestandteile des Mediums
in Wasser unlöslich oder schwerlöslich sind, sind
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ausreichendes Rühren und Vermengen wesentlich« Die übliche Schüttelkultur und die· Rührkultur unter Belüftung
genügen im wesentlichen diesen Bedingungen. Hierbei werden zuweilen gute Ergebnisse erzielt, wenn dem Medium
vorher ein Antischaummittel oder eine oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wird. Die BebrUtungstemperatur ist·
bei den verschiedenen Hefespezies unterschiedlich, jedoch wird gewöhnlich ein Bereich von 25 bis 35 C bevorzugt.
Die auf diese Weise erhaltene FermentationsbrUhe kann
als solche für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Wenn die Abtrennung der Hefezellen erwünscht ist, kann
dies nach beliebigen üblichen Verfahren, z. B. durch Filtration, Zentrifugierung, Sedimentation und Dekantierung,
erfolgen.
Die Fermentationsbrühe oder die Zellen können einer mechanischen oder chemischen Behandlung zur Dehydratisierung,
Reinigung oder Extraktion von aktiven Fraktionen, Stabilisierung der Aktivität usw. behandelt werden, solange
ihre ursprüngliche Fähigkeit, (+)-Isocitronensäure in Citronensäure umzuwandeln, nicht beeinträchtigt wird.
Der hieygebrauchte Ausdruck "verarbeitete Stoffe" umfaßt
alle Präparate in Form von flüssigen Pasten und Pulvern, die beispielsweise durch Behandlung oder Extraktion mit
Lösungsmitteln (z. B. Chloroform,, Benzol, Kthylacetat,
Alkohole, Aceton), durch "Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln, chemische Behandlung (z. B. Aussalzen), durch
physikalisch-chemische Behandlungen (z. B. verschiedene Arten der Chromatographie, z. B, mit Ionenaustauschercellulose,
Ionenaustauscherharzen und Aktivkohle), durch mechanische Behandlung (z. B. Gefriertrocknung, Mahlen,
Konzentrierung, Trocknen, Ultraschallbehandlung) der Brühe oder Hefezellen herstellbar sind.
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Als (+)-Isocitronensäure, die in Citronensäure umzuwandeln ist, kann die freie Säure, ein Salz dieser Säure
oder ein Material, das eine oder beide dieser Verbindungen
enthält, verwendet werden, gleichgültig, ob es sich um ein gereinigtes Präparat oder ein rohes Produkt handelt.
Wenn beispielsweise die (+)-Isocitronensäure in der in der beschriebenen Weise hergestellten KuIturbrühe
angehäuft worden ist, kann die Brühe als solche verwendet werden. Es ist auch möglich, eine Lösung, eine Aufschlämmung
oder eine getrocknete Masse der (+)-Isocitro- g
nensäure, eines Salzes dieser Säure oder eines Gemisches dieser Verbindungen zu verwenden, die aus dieser Brühe
nach üblichen, allein oder in Kombination angewandten Verfahren wie Filtration, Zentrifugalabscheidung, Erhitzen,
Ausfällung, Säulenchromatographie, Behandlung mit Aktivkohle, Konzentrierung und Dehydratisierung erhalten
werden können.
Gemäß der Erfindung wird die Umwandlung von (+)-Isocitronensäure in Citronensäure in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Anteile an (+)-Isocitronensäure und aktiven
Materialien, d. h. Fermentationsbrühe, Hefezellen und verarbeiteten Stoffen, sollten so gewählt werden, daß {
die Ausbeute an Citronensäure maximal ist. Im allgemeinen genügen etwa 10 bis 100 Gew.-Teile des aktiven Materials,
gerechnet auf Trockenbasis der Hefezellen, pro 100 Gew„-Teile
(+)-Isocitronensäure.
Die erforderliche Umwandlungszeit beträgt etwa 0,5 bis
10 Stunden. Der pH-Wert des Umwandlungssystems kann von
neutral bis alkalisch reichen und liegt insbesondere zwischen etwa7,0 und 9*5·
Die Temperatur liegt im allgemeinen zwischen etwa 15 und
50°C, zweckmäßig zwischen etwa 25 und A5°G. Das. Umwand-.
lungssystem kann gegebenenfalls gerührt weifden., ,-.; ....
009885/2258 '
Um den pH-Wert des Systems während der gesamten Umwandlungsdauer innerhalb eines geeigneten Bereichs zu halten,
kann eine Pufferlösung verwendet werden, die Phosphate, Iris(hydroxymethyl)aminomethan, Glycin, Borate,
Salzsäure, Natriumhydroxyd usw. in geeigneter Kombination enthält. Es ist auch möglich, .den pH-Wert des .
Systems während der Umwandlung von Zeit zu Zeit durch Zusatz einer Säure oder eines alkalischen Reagens während
der Reaktion zu korrigieren.
Die Citronensäure und (+)-Isocitronensäure im System werden nach der Pentabromaceton-Methode von Kuratomi
(Biochem. 27, 72 (1955)) und nach der enzymatlschen Methode
(Methoden der enzymatischen Analyse, Seite 318
(Verlag Chemie)) bestimmt.
Die Umwandlung ist beendet, wenn die Anreicherung der Citronensäure eine vorbestimmte Höhe erreicht hat.
Aus diesem System kann die Citronensäure unmittelbar oder nach vorheriger, beispielsweise durch Zentrifugierung
oder Filtration vorgenommener Entfernung der Peststoffe des Systems isoliert werden.
Die Citronensäure kann beispielsweise durch Filtration, Zentrifugierung, Erhitzen, Fällung, Säulenchromatögraphie,
Behandlung mit Aktivkohle und Konzentrierung isoliert und gewonnen werden. Zur Erleichterung der Isolierung
kann der pH-Wert der Brühe nach Belieben eingestellt werden. Wenn beispielsweise das unlösliche Kalziumsalz
im System vorhanden ist, ist es zweckmäßig, das System anzusäuern, um das Salz löslich zu machen,
und dann die Zellen beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration abzutrennen. Die auf diese Welse von
Feststoffen befreite Lösung kann gegebenenfalls durch
Zusatz von Natriumhydroxyds Kaliumcarbonat oder KaIk-
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milch neutralisiert werden. Aus dem so erhaltenen Gemisch
wird die Citronensäure und, falls vorhanden, auch die nicht umgesetzte (+)-Isocitronensäure in Form von Kalziumsalzen
ausgefällt, die dann beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren und anschließendes Trocknen
isoliert werden. Hierbei wird ein weißes Pulver von Kaiziumcitrat oder ein weißes Pulvergemisch von Kalziumcitrat
und "Kalzium-(+)-isocitrat erhalten. Dieses Produkt kann beispielsweise durch Neutralisation, Ionenaus
tauschbehandlung, Säulenchromatographie, Entfärbung, g
Filtration, Kondensation usw. in reine Citronensäure überführt werden.
Bei diesem Verfahren kann die isolierte (+)-Isocitronensäure
so geführt werden, daß sie in Citronensäure umgewandelt wird. Durch Wiederholung dieses Zyklus kann
schließlich die gesamte (+)-Isocitronensäure in Citronensäure umgewandelt werden*
In den folgenden Beispielen verhalten sich Gewichtsteile
zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.
Beispiel 1 ■ ■
150 Raumteile einer Lösung von 3Λ % Glucose, 0,1 $
NH^Cl, 0,05 % KH2PO,, 0,05 % MgSO1^. TH2O und 0,3 % Maisquellwasser
(pH 5*8) werden in einen Fermenter gegeben,
der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat. Nach der Sterilisation des Fermenters werden 2,5 Gew.-Teile
steriles Kaliumcarbonat zugesetzt. Das Meditun wird dann mit Candida parapsilosis var. tokyoensis (IFO 1^53) geimpft
und 5 Tage bei 280C bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 5*5· Bei dieser
Fermentation werden l\t 1 % (-f)-Isocitronensäure, bezogen
auf die Kulturbrühe, und gleichzeitig 1,5 % Citronensäure auf der;gleichen Basis gebildet. 100 Raumteile
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der Kulturbrühe werden mit 3n-Salzsäure auf pH 2,0
eingestellt und dann zentrifugiert.
Die Zellenfraktion wird in 100 Raumteilen Wasser suspendiert und zentrifugiert. Die Zellen werden abschließend
in 50 Raumteilen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer
bei pH 8,5 suspendiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit zusammengegeben und durch Zusatz einer wäßrigen
5 n-Natriumhydroxydlösung auf pH 7»0 eingestellt. Das
System wird 30 Minuten bei 1000C gehalten, wobei sich
eine Fällung bildet. Die Fällung wird heiß abgenutscht. Hierbei wird ein Gemisch von Kalziumisocitrat und KaI-ziumcitrat
in fast quantitativer Ausbeute erhalten.
Dieses Gemisch wird in etwa 10 Raumteilen V/asser suspendiert. Zur Suspension wird tropfenweise 50$ige Schwefelsäure
unter Rühren gegeben, bis das Filtrat bei Zusatz von Bariumchloridlösung leichte Anzeichen von Sulfatradikalen
zeigt. Man erhitzt dann etwa JO Minuten in
siedendem V/asser, entfärbt nach dieser Zelt und filtriert heiß. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck
eingeengt. Während eine gebildete Kalziumsulfatfällung entfernt wird, wird weiter eingeengt, bis ein Sirup von
niedriger Konsistenz erhalten wird. In einer Glaskolonne wird ein Gemisch von 35° Gew.-Teilen Kieselgel von Chromatographiereinheit
in 25n Raumteilen 0,5 n-HoS0j, und
etwa 2500 Raumteilen Chloroform, das 15 % n-Butanol enthält,
gegeben. Auf die Säule wird ein Gemisch einer Lösung des oben genannten Konzentrats in etwa 20 Raumteilen
0,5 n-IIgSO^ und ^O Gew.-Teilen des gleichen Kieselgels
von Chromatographiereinheit zusammen mit einer geringen Chloroformmenge gegeben, Das Chloroform läßt
man durch seine Schwere nach unten ablaufen.
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- li -
Nach diesem Durchgang läßt man durch die Kieselgelschicht
von oben 2 Elutionsmittel (verschiedene Mischungen von
n-Butanol und Chloroform), von denen das eine 25 # n-Butanol
und das andere 35 % n-Butanol enthält, mit 0,5
n-HpSOh in dieser Reihenfolge, falls notwendig unter
Druck, durchlaufen. Mit dem zweiten Elutionsmittel, das 35 % n-Butanol enthält, werden zwei saure Fraktionen
eluiert.
Von den beiden Fraktionen wird die zweite Fraktion in eine wäßrige Phase überführt, die dann unter vermindertem
Druck eingeengt wird, wobei 2,5 Gew.-Teile Isoci-.tronensäure
in Form eines Sirups erhalten werden. Aus der vorhergehenden sauren Fraktion werden etwa 0,7 Gew.-Teile
Citronensäure isoliert.
Die erhaltene Isocil-ronensäure wird in 25 Raumteileri
Trls(hydroxyrnethyl)amlnomethan-Salzsäure-Puffer bei pH 8*5 gelöst. Die Lösung wird mit der vorher abgetrennten
Zellensuspension vereinigt. Das Gemisch wird mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und 6 Stunden bei
32°C stehengelassen. Dieses Reaktionsgemisch enthält
1,96 Gew.-Teile Citronensäure. Die Zellen werden abfiltrier
Vund das Filtrat wird in der oben beschriebenen *
Weise behandelt, wobei 1,05 Gew.-Teile Citronensäure erhalten werden.
Diese Ausbeute zusammen tr.it der vorher erhaltenen Ausbeute
von 0,7 Gew,-Teilen ergibt eine Gesamtausbeute von 1,75 Gew.-Teilen Citronensäure.
In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200
Raumteilen hat, werden I50 Raumteile eines Mediums, das
aus 8 $ eines Cj^-Cjg-n-Paraffingemisches (Reinheit
92 %), 0,3 £ NH4Cl, 0,05 JS KH2PO4, 0,05 % MgSO4. 7H2O,
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"^ r ' ^ BAD ORIGINAL
"^ r ' ^ BAD ORIGINAL
0,05 % PeSO^·7HgO und 0,5 % CaCO, besteht (pH 6,5) und
mit 0,00004 Gew.-Teilen BromkresolgrUn sterilisiert worden ist, mit Candida lipolytica (IPO 1437) geimpft.
Das. Medium wird 3 Tage bebrütet und während der BebrUtung
mit NH^OH bei einer gelblichgrünen Farbe (entsprechend pH 4 - 5) gehalten. Nach dieser Bebrütungszeit
enthält die Kulturbrühe 49 mg Citronensäure/ml und
52 mg Isocitronensäure/ml. Die Kulturbrühe hat einen
pH-Wert von 4,5. 100 Raumteile der Kulturbrühe werden zur Entfernung der Zellen durch Filterpapier abgenutscht.
Das Piltrat wird durch Zusatz von Ca(OH)2 auf pH 7,5 eingestellt. Es wird dann unter leicht vermindertem
Druck zum Sieden erhitzt. Nach 30 Minuten wird das System
gekühlt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und in ' einem Luftstrom getrocknet. Hierbei wird Kalziumcitrat
erhalten, das 4,7 Gew.-Teile Citronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumteilen Wasser suspendiert. Die Suspension
wird mit 5n-H2S0^ neutralisiert. Nach Zusatz
von 1 Gew.-Teil Aktivkohle zur überstehenden Flüssigkeit wird filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem
Druck auf einen Sirup von niedriger Konsistenz eingeengt, (wobei eine etwa gebildete Fällung aus Kalziumsulfat
von Zeit zu Zeit abfiltriert wird). Das Konzentrat
wird in einem Kühlschrank stehengelassen, worauf 4,05 Gew.-Teile kristalline Citronensäure (als Citrppensäureanhydrat)
erhalten werden. .-.—.„,.
Das Filtrat, aus dem das Kalziumcitrat entfernt worden ist, enthält 4,8 Gew.-Teile Isocitronensäure. Zu diesem
Piltrat wird die gesamte Zellenmenge gegeben, die aus
der oben genannten Kulturbrühe abgetrennt worden ist (100 Raumteile), worauf mit wäßrigem Ammoniak auf pH
8,5 eingestellt wird. Nach Zusatz von 1 % Chloroform
(Volumen/Volumen) wird das Gemisch 4 Stunden bei 320C
stehengelassen. Nach dieser Zeit werden die Zellen ab» '
0 0 9 8 8 5/2258 ,
filtriert. Das Filtrat wird in der gleichen Weise, wie
vorstehend für die Isolierung der Citronensäure beschrieben, aufgearbeitet. Hierbei werden 3*9 Gew.-Teile
kristalline Citronensäure (als Anhydrat) erhalten.
100 Raumteile der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühe
werden mit 5n-NaOH auf pH 8,5 eingestellt, worauf
1 Volum-# Benzol zugesetzt wird. Das System wird in
einem Fermenter 4 Stunden stehengelassen. Nach dieser |
Zeit enthält es 83 mg Citronensäure/ml und I.7 mg Isocitronensäure/ml.
Diese Werte stellen erhebliche Verbesserungen dar.
Die Gesamtmenge der Kulturbrühe wird auf die in Beispiel
2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei Citronensäure
in einer Ausbeute, die 6,9 Gew.-Teilen wasserfreien Kristallen entspricht, erhalten wird.
• Beispiel 4
In einen Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 300
Raumteilen hat, werden 100 Raumteile einer Lösung gegeben, die 0,3 % NH^Cl, 0,1 % KHgPO^, 0,1 % MgSO^-THgO
und 0,1 $> Hefeextrakt in Leitungswasser enthält. Nach
der Sterilisation werden 100 Raumteile einer 25#igen
sterilen Lösung von Kalziumacetatmonohydrat in jeden
Kolben gegeben. Alle Kolben v/erden mit Candida IFO-1455
geimpft. Der geimpfte Fermenter wird 7 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Fermentationsbrühe einen pH-Wert
von 5*5· Bei dieser Fermentation werden 2,8 % Isocitronehsäure,
bezogen auf die KulturbrUhe, erhalten.
Bei diesem Versuch wird keine Citronensäure festgestellt.
100 Raumteile der KulturbrUhe werden 30 Minuten einer
0Q9885/225e
Ultraschallbehandlung bei 19 kHz unterworfen. Nach dieser
Zeit wird die Kulturbrühe· auf pH 8,5 eingestellt. Sie wird 4 Stunden bei 32°c stehengelassen, worauf die
Ausbeute an Citronensäure mit 2,4 % ermittelt wird. Die
Citronensäure wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aus der Kulturbrühe isoliert. Hierbei werden
82,5 % der in der Probe der Kulturbrühe enthaltenen Citronensäure
in Form von Kristallen erhalten.
Eine Lösung, die 0,1 % NH^NO , 0,05 % KHgPO^, 0,05 %
MgSO^'7HgO und 0,3 % Maisquellwasser in Leitungswasser
enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt. I50 Raümteile der
Lösung werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen
von 300 Raumteilen hat, worauf 9 Gew.-Teile
Glycerin oder 9 Raumteile Äthanol zugesetzt v/erden. Nach der Sterilisation werden 4,5 Gew.-Teile
steriles Kaliumcarbonat in den Fermenter gegeben. Der Fermenter wird mit Hansenula subpelliculosa (IFO 1458)
geimpft. Das geimpfte Medium wird 5 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,5·
Bei diesem Fermentationsversuch werden bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 1,5 % Isocitronensäure
und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 1,4 % Iso.citronensäure erhalten. Citronensäure
wird gleichzeitig gebildet, aber ihre Menge beträgt bei
Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 0,9 % der Kulturbrühe und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle
0,5 %. Die Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei stets
reine Citronensäure in einer Ausbeute von 83 bis 85 %
erhalten wird. Die überstehenden Flüssigkeiten, die nach der Ausfällung des Kalzlumcitrats bei dem vorstehend
beschriebenen Versuch erhalten werden, werden für
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jede Probe der KuIturbrUhe zusammengegeben. Zu 100 Raum- '
teilen der vereinigten überstehenden Flüssigkeit werden
3 Teile (auf nasser Basis) der Zellen von >ichia polymorpha
IPO 0195 gegeben, die 3 Tage bei 28°C auf einem
Medium (pH 6) kultiviert worden sind, das aus einer Lösung von 6 % Glucose, 6 % Kalziumacetatmonohydrat,
0,05 % NH4Cl, 0,05 % KH2PO4, Oi05 % MgSO4-TH3O und 0,2$
Maisquellwasser besteht. Die Flüssigkeit wird dann mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt.
Die Gemische werden 5 Stunden bei j54°C stehengelassen. ^
Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Citronensäure
1,2 % bzw. 0,69 #. Diese Reaktionsgemische werden auf
die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Ausbeuten an Citronensäure betragen 86 $>
bzw. 83 %, bezogen
auf die Oemische.
Eine T.ösung, die 12 % Glucose, 0,1 % NH4Cl, 0,05 %
KH3PO4, 0,05 1ί>
MgSO4TTHgO und 0,2 % Maisquellwasser in
Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt.
Je 15° Raumteile der Lösungen werden in Fermenter gege- -
ben, "dieeln Fassungsvermögen von 300 Raumteilen haben,
worauf sterilisiert wird. In jeden Fermenter werden 6 Gew.-Teile steriles Kaliumcarbonat gegeben, worauf.die
Medien mit Debaryomyces kloeckeri IFO OOI5, Trlchosporon
behrendii IFO 081U bzw. Brettanomyces claussenii IFO
15061- geimpft v.-erden. Jeder geimpfte Fermenter wird 5
Tage bebrütet.
Die Bildung an (+)-Isocitronensäure beträgt Ο,ό % bei
Debaryomyces kloeckeri, 1,0 # für Trichosporon behrendii
und 1,0 it· .bei Brettanbmyces claussenii. Gleichzeitig,,
wird'Citronensäure in einer Ausbeute von °».5/$ bei
Debaryoffiycc ε, 0,6 $ί bei Trichp'sporon und 1 % bei . ,
009885/2258 -; 'j :; .;-,-1 ■ ■_..,., BAD ORIGINAL
2Ü34 593
Brettanomyces claussenii gebildet. Die Fermentationsbrühen werden auf die in Beispiel 2 beschriebene V/eise
aufgearbeitet, wobei Citronensäure in fast quantitativer
Ausbeute bei „ .den Mikroorganismen erhalten wird.
Wenn die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Isocitronensäurefraktionen (d. h, nach Ausfällung von
Kalziumcitrat erhaltene überstehende Flüssigkeiten und die Mutterlaugen nach der Kristallisation der Citronensäure)
für jeden Mikroorganismus vereinigt werden, wird festgestellt, daß 97 % der in jeder Kulturbrühe gebildeten
Isocitronensaure darin enthalten sind.
Zu jedem der vorstehenden Produkte wird die Gesamtmenge der nassen Zellen gegeben, die durch Zentrifugieren
Jeder Kulturbrühe für 20 Minuten bei 5000 UpM erhalten
werden, so daß die Produkte in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, reagieren können.
Es wird festgestellt, daß bei den Mikroorganismen .
die Isocitronensaure mit einem Umsatz von etwa 83 % in
Citronensäure umgewandelt wird. Jedes der Reaktionsprodukte
wird einer Behandlung in der oben beschriebenen Weise zur Isolierung der Citronensäure unterworfen. Hierbei
wird Citronensäure in einer Ausbeute von 85 %, erhalten.
Eine Lösung, die 20 % Melasseabfälle von Rohrzucker (12 # reduzierender Zucker als Glucose), 0,10 % NH24Cl,
0,05 % KHpPO^ und 0,05 '% MgSO2, in Leitungswasser enthält,
wird auf pH 5,5 eingestellt. 200 Raumteile.der Lösung
werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, worauf sterilisiert wird.
In den Hermenter werden dann 6,0 Gew.-Teile steriles
Kaliumcarbonat gegeben. Zum Impfen des Mediums wird
'■'■".. 009885/2258
-λ---. BADORIQINÄL
-λ---. BADORIQINÄL
Candida guilliermondii var« membranaefaclens IFO
verwendet. Der Fermenter wird auf die oben beschriebene
Weise mechanisch geschüttelt. Nach beendeter Kultivierung
hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 5,5·
Bei dieser Fermentation werden J, 75 % Citronensäure
(gerechnet als Cltronensäureanhydrat), bezogen auf die
Kulturbrühe, erhalten. Auf die in Beispiel 2 beschriebene
Weise werden aus dieser Kulturbrühe 9,4 Gew.-Teile
(Trockengewicht) Kalziumcitrat pro 200 Raumteile Kulturbrühe
isoliert. Diese Menge entspricht 7*2 Gew.-Teilen
Citronensäureanhydrat. *
Die abgetrennten nassen Zellen werden gefriergetrocknet
und gelagert. In 100 Raurnteilen Dinatriumphosphat-Monakaliumphosphat-Puffer,
der einen pH-Wert von 8,5 hat, werden 5 Gew,—Teile Monokaliumisocitrat gelöst» Zur
Lösung werden 5 Gew.-Teile der aufbewahrten trockenen
fellengegeben % Das Gemisch wird gut gerührt und mit
Nafcpiumhydroj{;ydlösung genau auf pH 8,5 eingestellt*
Das Gemisch wird 5 Stunden bei J2°G stehengelassen,
worauf der Mikroorganismus abfiltriert wird. Die überstehende
Flüssigkeit wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt, wobei 5,55 Gew.-Teile Citronensäure erhalten werden*
In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat, werden 150 Raumteile eines Mediums, das
8 % eines C^-i^g-ri-Paraffingemisches (Reinheit 92 %),
0,:5 % NH!fC:i, 0,05 % KIIpPO^, 0,05 % MgSO4-TH2O, 0,05 $
FeSO1 »THgO und 0,5 J^'GaCO^ enfchält (pil 6,5), mit
earulida IFO OpOO .-jaiüipft.» worauf .5 Tage auf
00.9-885/2.2SÖ- " : BAD
die in Beispiel 2 beschriebene Weise bebrütet wird..
Nach der Bebrütungszeit enthält die KulturbrÜhe 21 rag
Citronensäure/ml und 28 mg (+)-Isocitronensäure/ml,,
100 Raumteile der KulturbrUhe werden mit 5n-NaOH auf
pH 8,5 eingestellt, v/orauf I Raumteil Xylol zugesetzt wird. Das Gemisch wird unter Rühren bei 35 ''C stehengelassen.
Hierbei werden 4-1 mg Citronensäure/ml und 8 mg (O-Isocitronensäure/ml erhalten.
Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die in
Beispiel 1 beschriebene V/eise werden 3«Λ Gew..-Teile
Citronensäure (als Anhydrat) erhalten.
ij 5 / 2 2 S S : . BAD ORIGINAL
Claims (3)
1) Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch
■ gekennzeichnet, daß man (+)-Isocitronensäure mit einer Fermentationsbrühe einer Hefe, die (+)-Iso~
citronensäure anzuhäufen vermag und zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula,
Kloeckera, Trichosporon, Torulopsis oder Pichia gehört,
mit den Zellen dieser Hefe oder einer davon stammenden verarbeiteten Substanz bei einem pH-Wert
von 7,0 - 9»5.in Berührung bringt, wodurch die (+)- ™
Isocitronensaure in Citronensäure umgewandelt wird,
und anschließend die so angehäufte Citronensäure isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Kulturbrühe, die etwa 10 - 100 Gew.-Teile Hefezellen (auf Trockenbasis), etwa 10 bis
Gew.-Teile Hefezellen oder ein verarbeitetes Material, das aus dieser Menge der KulturbrUhe oder der
Zellen erhalten worden ist, mit 100 Gev/.-Teilen ( + )-.-Isocitronensaure
in Berührung bringt.
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung bei einer Temperatur zwischen
etwa 25 und 45°C durchgeführt wird. '
0 G 3 8.8 5/2258 BAD ORIGINAL
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