DE2034593A1 - Verfahren zur Herstellung von Citro nensaure - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR-ING. TH. MEYER DR. FUES DlPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

9. Juli 197Ö Kl/Ax/bz

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

In der französischen Patentschrift 1 571 55I wird festgestellt, daß eine gewisse Hefe Citronensäure und/ oder (-i-)-Isocitronensäure anhäuft. Für die Großherstellung von Citronensäure ist jedoch das Verfahren dieses französischen Patents nicht immer befriedigend, da die Ausbeute an Citronensäure auf Basis der verwendeten Kohlenstoffquellen mit zunehmender Menge der gleichzeitig gebildeten (+)-Isocitronensäure niedriger wird.

Die Bemühungen der Anmelderin, den Nachteil des oben genannten Verfahrens auszuschalten, hatten folgendes Ergebnis:

1) Die Permentätionsipaisehe gewisser Hefen, die Zellen dieser Hefen sowie eine aus der Maische oder den Hefezellen stammende verarbeitete Substanz haben die Fähigkeit, (-f-)-Isocitronensäure in Citronensäure umzuwandeln,

2) Diese Hefen gehören zu den Gattungen Candida, Brettanomyces, Dobaryoinyces, Hansenula, Kloeckera, Trichosporon, Torulopsis oder Pichia und vermögen (+)-Ißocltronensäure zu bilden.

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3) Die Fähigkeit zur Umwandlung ist bei einem pH-Wert von 7,0 - 9,f> erhöht.

h) Es ist möglich, speziell die (+)-Tsocitronensäure in Citronensäure in hoher'Ausbeute umzuwandeln, indem die Fermentationsmaische, die Hefezellen oder eine daraus stammende verarbeitete Substanz verwendet werden.

_ Diese Feststellungen sind sehr überraschend, da ange-

™ nommen wurde, daß in der Fermentationsbrühe, in den

Hefezellen und in deren verarbeiteten Stoffen verschiedene Arten von enzymatisehen Wirkungen vorliegen, durch die die (h)-IsocLtronensäure nicht in Citronensäure, sondern in andere Substanzen umgewandelt wird.

Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zugrunde. Sie ist von praktischem Wert für die Großherstellung von Isocitronensäure.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, das dadurch gefc kennzeichnet ist, daß man (f)-Isocitronensäure mit

einer Fermentationsbrühe einer Hefe, die (+)-Isocitronensäure anzuhäufen vermag und zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Kloeckera, Trichosporon, Torulopsis oder Pichla gehört, mit den Zellen dieser Hefe oder einer davon stammenden verarbeiteten Substanz bei einem pH-Wert von 7»0 - 9*5 in Berührung bringt, wodurch die (+)-Isocitronensäure in Citronensäure umgewandelt wird, und anschließend die so angehäufte Citronensäure isoliert.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit beliebigen Hefen und deren Mutanten durchgeführt v/erden, die . (-hj-lsocitroriensäure anzureichern vermögen.und zur

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■ - 3 -

Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Kloeckera, Torulopsis, Trichosporon oder Pichia gehören. Von diesen Mikroorganismen sind Hefen der Gattung Candida für die Zwecke der Erfindung am geeignetsten.

Typische Hefen, die für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind nachstehend als Beispiele genannt. In der folgenden Liste sind die IFO-Nummern die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermenta- %

tion, Osaka.

Candida guilliermondil, IPO Ö643 Candida parapsilosis, TFO 0?08

Candida tropicalIs, IFO O589

Candida mycoderma, IFO O842

Candida intermedia, TFO O76I

Candida lipolytica, IFO 1^57, ATCC 201IM Candida melibiosa, IPO O96I

Candida brumptil, IFO 07^^

Candida sp. IFO 1455 und andere Candida-Spezies

Debaryomyces kloeckeri, IFO OOI9 Debaryomyces subglobosus, IFO 0794 Debaryo'myces hansenii, IFO OfjtWt und andere Debarypmyces

Spezies

Hansenxilc sllvicola, IFO 08ογ

Hansenula subpelliculosa, IFO 1456

Hanrenula iu.-aveolens, .'IFO 0992

Hansenula miso, IFO 0146 und andere Hansenula-Spc-z-ies

Kloeckera apiculata, IFO O8ö5 und andei'e IQoeckera-

ßpezies

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Torulopsis famata, IFO O856
Torulopsis Candida, IPO O38O

Torulopsis ernobii, IFO 0654 und andere Torulopsis-

Spezies

Pichia polymorpha, IFO 0195

Plchia halophila, IFO 0947

Pichia farinosa, IFO 0465 und andere Pichia-Spezies

Saccharomyces acidifaciens, IFO 0468 Saceharomyces willianus, IFO 0248 und andere Saccharo-

myces-Spezies

Trlchosporon behrendii, IFO 0844 Trichosporon capita turn, IFO O?4j5 und andere Trichospo-

ron-Spezies

Brettanomyces elaussenii, IFO I506 Brettanomyces lambicus, IFO O797 und andere Brettano-

myces-Spezies

Diese Hefen werden aus einem ausgewählten Medium gezUchtetj, das den Eigenschaften der Hefe angepaßt ist. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlehydrate wie Glucose, Saccharose usw., Abfallmelasse, Stärkehydrolysat, Holzhydrolysat, verschiedene Alkohole wie Äthanol und Glycerin, Fettsäuren, wie Essigsäure und Oleinsäure, öle und Fette wie Sojabohnenöl und Fischöl, Kohlenwasserstoffe, z. B. Tetradecan, Hexadecan, Leuchtpetroleum und Gasöl, rohe Fraktionen dieser Kohlenwasserstoffe und die verschiedensten anderen organischen Verbindungen und Stoffe, die von der Hefe assimiliert werden können, allein oder in Kombination. Von diesen Kohlenstof!'quellen sind paraffinische Kohlenwasserstoffe für die Großherstellung am vorteilhaftesten.

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Als Stickstoffquellen können anorganische Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw. sowie organische Ammoniumsalze wie Ammoniumacetat und andere organische Stickstoffquellen wie Harnstoff, Hefeextrakt, Maisquellwasser und die Hydrolysate verschiedener Proteine vorteilhaft allein oder als Gemisch von 2 oder mehreren verwendet werden.

Es ist zweckmäßig, außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verschiedene anorganische· Nährstoffe dem * Medium zuzusetzen. Wenn beispielsweise die verwendete Hefe Vitamine zum Wachstum erfordert, müssen vorher ausreichende Mengen dieser Vitamine (z. B. Biotin, Pantothenat, Inosit) oder ein Material, das diese Vitamine enthält, z. B. Hefeextrakt, dem Medium zugesetzt werden.

Der pH-Wert während der Kultivierung liegt gewöhnlich zwischen etwa j5 und 7* vorzugsweise zwischen etwa 4 und 6,5.

Der pH-Wert des Mediums sinkt mit fortschreitender Fermentation* Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen er- i zielt, wenn ein neutrales Salz, ζ. B. Kaliumcarbonat, Kalziumacetat oder Natriumacetat, dem Medium vorher als neutralisierendes Mittel zugesetzt wird. Dieses neutralisierende Mittel kann mehrmals während der Kultivierungsdauer zugesetzt werden. Natürlich können in Fällen, in denen ein neutralisierendes Mittel während der Kultivierung zugesetzt wird, auch andere neutralisierende Verbindungen wie Natriumhydroxyd, Kalziumhydroxyd und wäßriges Ammoniak als Teilneutralisatoren verwendet werden.

Die Kultivierung der Hefen wird gewöhnlich unter aeroben Bedingungen durchgeführt..Wenn die Bestandteile des Mediums in Wasser unlöslich oder schwerlöslich sind, sind

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ausreichendes Rühren und Vermengen wesentlich« Die übliche Schüttelkultur und die· Rührkultur unter Belüftung genügen im wesentlichen diesen Bedingungen. Hierbei werden zuweilen gute Ergebnisse erzielt, wenn dem Medium vorher ein Antischaummittel oder eine oberflächenaktive Verbindung zugesetzt wird. Die BebrUtungstemperatur ist· bei den verschiedenen Hefespezies unterschiedlich, jedoch wird gewöhnlich ein Bereich von 25 bis 35 C bevorzugt.

Die auf diese Weise erhaltene FermentationsbrUhe kann als solche für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Wenn die Abtrennung der Hefezellen erwünscht ist, kann dies nach beliebigen üblichen Verfahren, z. B. durch Filtration, Zentrifugierung, Sedimentation und Dekantierung, erfolgen.

Die Fermentationsbrühe oder die Zellen können einer mechanischen oder chemischen Behandlung zur Dehydratisierung, Reinigung oder Extraktion von aktiven Fraktionen, Stabilisierung der Aktivität usw. behandelt werden, solange ihre ursprüngliche Fähigkeit, (+)-Isocitronensäure in Citronensäure umzuwandeln, nicht beeinträchtigt wird.

Der hieygebrauchte Ausdruck "verarbeitete Stoffe" umfaßt alle Präparate in Form von flüssigen Pasten und Pulvern, die beispielsweise durch Behandlung oder Extraktion mit Lösungsmitteln (z. B. Chloroform,, Benzol, Kthylacetat, Alkohole, Aceton), durch "Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln, chemische Behandlung (z. B. Aussalzen), durch physikalisch-chemische Behandlungen (z. B. verschiedene Arten der Chromatographie, z. B, mit Ionenaustauschercellulose, Ionenaustauscherharzen und Aktivkohle), durch mechanische Behandlung (z. B. Gefriertrocknung, Mahlen, Konzentrierung, Trocknen, Ultraschallbehandlung) der Brühe oder Hefezellen herstellbar sind.

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Als (+)-Isocitronensäure, die in Citronensäure umzuwandeln ist, kann die freie Säure, ein Salz dieser Säure oder ein Material, das eine oder beide dieser Verbindungen enthält, verwendet werden, gleichgültig, ob es sich um ein gereinigtes Präparat oder ein rohes Produkt handelt. Wenn beispielsweise die (+)-Isocitronensäure in der in der beschriebenen Weise hergestellten KuIturbrühe angehäuft worden ist, kann die Brühe als solche verwendet werden. Es ist auch möglich, eine Lösung, eine Aufschlämmung oder eine getrocknete Masse der (+)-Isocitro- g nensäure, eines Salzes dieser Säure oder eines Gemisches dieser Verbindungen zu verwenden, die aus dieser Brühe nach üblichen, allein oder in Kombination angewandten Verfahren wie Filtration, Zentrifugalabscheidung, Erhitzen, Ausfällung, Säulenchromatographie, Behandlung mit Aktivkohle, Konzentrierung und Dehydratisierung erhalten werden können.

Gemäß der Erfindung wird die Umwandlung von (+)-Isocitronensäure in Citronensäure in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Anteile an (+)-Isocitronensäure und aktiven Materialien, d. h. Fermentationsbrühe, Hefezellen und verarbeiteten Stoffen, sollten so gewählt werden, daß {

die Ausbeute an Citronensäure maximal ist. Im allgemeinen genügen etwa 10 bis 100 Gew.-Teile des aktiven Materials, gerechnet auf Trockenbasis der Hefezellen, pro 100 Gew„-Teile (+)-Isocitronensäure.

Die erforderliche Umwandlungszeit beträgt etwa 0,5 bis 10 Stunden. Der pH-Wert des Umwandlungssystems kann von neutral bis alkalisch reichen und liegt insbesondere zwischen etwa7,0 und 9*5·

Die Temperatur liegt im allgemeinen zwischen etwa 15 und 50°C, zweckmäßig zwischen etwa 25 und A5°G. Das. Umwand-. lungssystem kann gegebenenfalls gerührt weifden., ,-.; .... 009885/2258 '

Um den pH-Wert des Systems während der gesamten Umwandlungsdauer innerhalb eines geeigneten Bereichs zu halten, kann eine Pufferlösung verwendet werden, die Phosphate, Iris(hydroxymethyl)aminomethan, Glycin, Borate, Salzsäure, Natriumhydroxyd usw. in geeigneter Kombination enthält. Es ist auch möglich, .den pH-Wert des . Systems während der Umwandlung von Zeit zu Zeit durch Zusatz einer Säure oder eines alkalischen Reagens während der Reaktion zu korrigieren.

Die Citronensäure und (+)-Isocitronensäure im System werden nach der Pentabromaceton-Methode von Kuratomi (Biochem. 27, 72 (1955)) und nach der enzymatlschen Methode (Methoden der enzymatischen Analyse, Seite 318 (Verlag Chemie)) bestimmt.

Die Umwandlung ist beendet, wenn die Anreicherung der Citronensäure eine vorbestimmte Höhe erreicht hat.

Aus diesem System kann die Citronensäure unmittelbar oder nach vorheriger, beispielsweise durch Zentrifugierung oder Filtration vorgenommener Entfernung der Peststoffe des Systems isoliert werden.

Die Citronensäure kann beispielsweise durch Filtration, Zentrifugierung, Erhitzen, Fällung, Säulenchromatögraphie, Behandlung mit Aktivkohle und Konzentrierung isoliert und gewonnen werden. Zur Erleichterung der Isolierung kann der pH-Wert der Brühe nach Belieben eingestellt werden. Wenn beispielsweise das unlösliche Kalziumsalz im System vorhanden ist, ist es zweckmäßig, das System anzusäuern, um das Salz löslich zu machen, und dann die Zellen beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration abzutrennen. Die auf diese Welse von Feststoffen befreite Lösung kann gegebenenfalls durch Zusatz von Natriumhydroxyds Kaliumcarbonat oder KaIk-

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milch neutralisiert werden. Aus dem so erhaltenen Gemisch wird die Citronensäure und, falls vorhanden, auch die nicht umgesetzte (+)-Isocitronensäure in Form von Kalziumsalzen ausgefällt, die dann beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren und anschließendes Trocknen isoliert werden. Hierbei wird ein weißes Pulver von Kaiziumcitrat oder ein weißes Pulvergemisch von Kalziumcitrat und "Kalzium-(+)-isocitrat erhalten. Dieses Produkt kann beispielsweise durch Neutralisation, Ionenaus tauschbehandlung, Säulenchromatographie, Entfärbung, g Filtration, Kondensation usw. in reine Citronensäure überführt werden.

Bei diesem Verfahren kann die isolierte (+)-Isocitronensäure so geführt werden, daß sie in Citronensäure umgewandelt wird. Durch Wiederholung dieses Zyklus kann schließlich die gesamte (+)-Isocitronensäure in Citronensäure umgewandelt werden*

In den folgenden Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1 ■ ■

150 Raumteile einer Lösung von 3Λ % Glucose, 0,1 $ NH^Cl, 0,05 % KH₂PO,, 0,05 % MgSO₁^. TH₂O und 0,3 % Maisquellwasser (pH 5*8) werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat. Nach der Sterilisation des Fermenters werden 2,5 Gew.-Teile steriles Kaliumcarbonat zugesetzt. Das Meditun wird dann mit Candida parapsilosis var. tokyoensis (IFO 1^53) geimpft und 5 Tage bei 28⁰C bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 5*5· Bei dieser Fermentation werden ^l\_t 1 % (-f)-Isocitronensäure, bezogen auf die Kulturbrühe, und gleichzeitig 1,5 % Citronensäure auf der;gleichen Basis gebildet. 100 Raumteile

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der Kulturbrühe werden mit 3n-Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dann zentrifugiert.

Die Zellenfraktion wird in 100 Raumteilen Wasser suspendiert und zentrifugiert. Die Zellen werden abschließend in 50 Raumteilen Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer bei pH 8,5 suspendiert.

Die überstehende Flüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit zusammengegeben und durch Zusatz einer wäßrigen 5 n-Natriumhydroxydlösung auf pH 7»0 eingestellt. Das System wird 30 Minuten bei 100⁰C gehalten, wobei sich eine Fällung bildet. Die Fällung wird heiß abgenutscht. Hierbei wird ein Gemisch von Kalziumisocitrat und KaI-ziumcitrat in fast quantitativer Ausbeute erhalten.

Dieses Gemisch wird in etwa 10 Raumteilen V/asser suspendiert. Zur Suspension wird tropfenweise 50$ige Schwefelsäure unter Rühren gegeben, bis das Filtrat bei Zusatz von Bariumchloridlösung leichte Anzeichen von Sulfatradikalen zeigt. Man erhitzt dann etwa JO Minuten in siedendem V/asser, entfärbt nach dieser Zelt und filtriert heiß. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Während eine gebildete Kalziumsulfatfällung entfernt wird, wird weiter eingeengt, bis ein Sirup von niedriger Konsistenz erhalten wird. In einer Glaskolonne wird ein Gemisch von 35° Gew.-Teilen Kieselgel von Chromatographiereinheit in 25ⁿ Raumteilen 0,5 n-H_oS0j, und etwa 2500 Raumteilen Chloroform, das 15 % n-Butanol enthält, gegeben. Auf die Säule wird ein Gemisch einer Lösung des oben genannten Konzentrats in etwa 20 Raumteilen 0,5 n-IIgSO^ und ^O Gew.-Teilen des gleichen Kieselgels von Chromatographiereinheit zusammen mit einer geringen Chloroformmenge gegeben, Das Chloroform läßt man durch seine Schwere nach unten ablaufen.

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Nach diesem Durchgang läßt man durch die Kieselgelschicht von oben 2 Elutionsmittel (verschiedene Mischungen von n-Butanol und Chloroform), von denen das eine 25 # n-Butanol und das andere 35 % n-Butanol enthält, mit 0,5 n-HpSOh in dieser Reihenfolge, falls notwendig unter Druck, durchlaufen. Mit dem zweiten Elutionsmittel, das 35 % n-Butanol enthält, werden zwei saure Fraktionen eluiert.

Von den beiden Fraktionen wird die zweite Fraktion in eine wäßrige Phase überführt, die dann unter vermindertem Druck eingeengt wird, wobei 2,5 Gew.-Teile Isoci-.tronensäure in Form eines Sirups erhalten werden. Aus der vorhergehenden sauren Fraktion werden etwa 0,7 Gew.-Teile Citronensäure isoliert.

Die erhaltene Isocil-ronensäure wird in 25 Raumteileri Trls(hydroxyrnethyl)amlnomethan-Salzsäure-Puffer bei pH 8*5 gelöst. Die Lösung wird mit der vorher abgetrennten Zellensuspension vereinigt. Das Gemisch wird mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und 6 Stunden bei 32°C stehengelassen. Dieses Reaktionsgemisch enthält 1,96 Gew.-Teile Citronensäure. Die Zellen werden abfiltrier Vund das Filtrat wird in der oben beschriebenen * Weise behandelt, wobei 1,05 Gew.-Teile Citronensäure erhalten werden.

Diese Ausbeute zusammen tr.it der vorher erhaltenen Ausbeute von 0,7 Gew,-Teilen ergibt eine Gesamtausbeute von 1,75 Gew.-Teilen Citronensäure.

Beispiel 2

In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat, werden I50 Raumteile eines Mediums, das aus 8 $ eines Cj^-Cjg-n-Paraffingemisches (Reinheit 92 %), 0,3 £ NH₄Cl, 0,05 JS KH₂PO₄, 0,05 % MgSO₄. 7H₂O,

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0,05 % PeSO^·7HgO und 0,5 % CaCO, besteht (pH 6,5) und mit 0,00004 Gew.-Teilen BromkresolgrUn sterilisiert worden ist, mit Candida lipolytica (IPO 1437) geimpft. Das. Medium wird 3 Tage bebrütet und während der BebrUtung mit NH^OH bei einer gelblichgrünen Farbe (entsprechend pH 4 - 5) gehalten. Nach dieser Bebrütungszeit enthält die Kulturbrühe 49 mg Citronensäure/ml und 52 mg Isocitronensäure/ml. Die Kulturbrühe hat einen pH-Wert von 4,5. 100 Raumteile der Kulturbrühe werden zur Entfernung der Zellen durch Filterpapier abgenutscht. Das Piltrat wird durch Zusatz von Ca(OH)₂ auf pH 7,5 eingestellt. Es wird dann unter leicht vermindertem Druck zum Sieden erhitzt. Nach 30 Minuten wird das System gekühlt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und in ' einem Luftstrom getrocknet. Hierbei wird Kalziumcitrat erhalten, das 4,7 Gew.-Teile Citronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumteilen Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 5n-H₂S0^ neutralisiert. Nach Zusatz von 1 Gew.-Teil Aktivkohle zur überstehenden Flüssigkeit wird filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck auf einen Sirup von niedriger Konsistenz eingeengt, (wobei eine etwa gebildete Fällung aus Kalziumsulfat von Zeit zu Zeit abfiltriert wird). Das Konzentrat wird in einem Kühlschrank stehengelassen, worauf 4,05 Gew.-Teile kristalline Citronensäure (als Citrppensäureanhydrat) erhalten werden. .-.—.„,.

Das Filtrat, aus dem das Kalziumcitrat entfernt worden ist, enthält 4,8 Gew.-Teile Isocitronensäure. Zu diesem Piltrat wird die gesamte Zellenmenge gegeben, die aus der oben genannten Kulturbrühe abgetrennt worden ist (100 Raumteile), worauf mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt wird. Nach Zusatz von 1 % Chloroform (Volumen/Volumen) wird das Gemisch 4 Stunden bei 32⁰C stehengelassen. Nach dieser Zeit werden die Zellen ab» '

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filtriert. Das Filtrat wird in der gleichen Weise, wie vorstehend für die Isolierung der Citronensäure beschrieben, aufgearbeitet. Hierbei werden 3*9 Gew.-Teile kristalline Citronensäure (als Anhydrat) erhalten.

Beispiel 3

100 Raumteile der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Kulturbrühe werden mit 5n-NaOH auf pH 8,5 eingestellt, worauf

1 Volum-# Benzol zugesetzt wird. Das System wird in

einem Fermenter 4 Stunden stehengelassen. Nach dieser |

Zeit enthält es 83 mg Citronensäure/ml und I.7 mg Isocitronensäure/ml. Diese Werte stellen erhebliche Verbesserungen dar.

Die Gesamtmenge der Kulturbrühe wird auf die in Beispiel

2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei Citronensäure in einer Ausbeute, die 6,9 Gew.-Teilen wasserfreien Kristallen entspricht, erhalten wird.

• Beispiel 4

In einen Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, werden 100 Raumteile einer Lösung gegeben, die 0,3 % NH^Cl, 0,1 % KHgPO^, 0,1 % MgSO^-THgO und 0,1 $> Hefeextrakt in Leitungswasser enthält. Nach der Sterilisation werden 100 Raumteile einer 25#igen sterilen Lösung von Kalziumacetatmonohydrat in jeden Kolben gegeben. Alle Kolben v/erden mit Candida IFO-1455 geimpft. Der geimpfte Fermenter wird 7 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Fermentationsbrühe einen pH-Wert von 5*5· Bei dieser Fermentation werden 2,8 % Isocitronehsäure, bezogen auf die KulturbrUhe, erhalten.

Bei diesem Versuch wird keine Citronensäure festgestellt. 100 Raumteile der KulturbrUhe werden 30 Minuten einer

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Ultraschallbehandlung bei 19 kHz unterworfen. Nach dieser Zeit wird die Kulturbrühe· auf pH 8,5 eingestellt. Sie wird 4 Stunden bei 32°c stehengelassen, worauf die Ausbeute an Citronensäure mit 2,4 % ermittelt wird. Die Citronensäure wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aus der Kulturbrühe isoliert. Hierbei werden 82,5 % der in der Probe der Kulturbrühe enthaltenen Citronensäure in Form von Kristallen erhalten.

Beispiel 5

Eine Lösung, die 0,1 % NH^NO , 0,05 % KHgPO^, 0,05 % MgSO^'7HgO und 0,3 % Maisquellwasser in Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt. I50 Raümteile der Lösung werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, worauf 9 Gew.-Teile Glycerin oder 9 Raumteile Äthanol zugesetzt v/erden. Nach der Sterilisation werden 4,5 Gew.-Teile steriles Kaliumcarbonat in den Fermenter gegeben. Der Fermenter wird mit Hansenula subpelliculosa (IFO 1458) geimpft. Das geimpfte Medium wird 5 Tage bebrütet. Nach dieser Zeit hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,5·

Bei diesem Fermentationsversuch werden bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 1,5 % Isocitronensäure und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 1,4 % Iso.citronensäure erhalten. Citronensäure wird gleichzeitig gebildet, aber ihre Menge beträgt bei Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle 0,9 % der Kulturbrühe und bei Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle 0,5 %. Die Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei stets reine Citronensäure in einer Ausbeute von 83 bis 85 % erhalten wird. Die überstehenden Flüssigkeiten, die nach der Ausfällung des Kalzlumcitrats bei dem vorstehend beschriebenen Versuch erhalten werden, werden für

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jede Probe der KuIturbrUhe zusammengegeben. Zu 100 Raum- ' teilen der vereinigten überstehenden Flüssigkeit werden 3 Teile (auf nasser Basis) der Zellen von >ichia polymorpha IPO 0195 gegeben, die 3 Tage bei 28°C auf einem Medium (pH 6) kultiviert worden sind, das aus einer Lösung von 6 % Glucose, 6 % Kalziumacetatmonohydrat, 0,05 % NH₄Cl, 0,05 % KH₂PO₄, Oi05 % MgSO₄-TH₃O und 0,2$ Maisquellwasser besteht. Die Flüssigkeit wird dann mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt.

Die Gemische werden 5 Stunden bei j54°C stehengelassen. ^

Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Citronensäure 1,2 % bzw. 0,69 #. Diese Reaktionsgemische werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Ausbeuten an Citronensäure betragen 86 $> bzw. 83 %, bezogen auf die Oemische.

Beispiel 6

Eine T.ösung, die 12 % Glucose, 0,1 % NH₄Cl, 0,05 % KH₃PO₄, 0,05 1ί> MgSO₄TTHgO und 0,2 % Maisquellwasser in Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,8 eingestellt.

Je 15° Raumteile der Lösungen werden in Fermenter gege- -

ben, "dieeln Fassungsvermögen von 300 Raumteilen haben, worauf sterilisiert wird. In jeden Fermenter werden 6 Gew.-Teile steriles Kaliumcarbonat gegeben, worauf.die Medien mit Debaryomyces kloeckeri IFO OOI5, Trlchosporon behrendii IFO 08¹U bzw. Brettanomyces claussenii IFO 15061- geimpft v.-erden. Jeder geimpfte Fermenter wird 5 Tage bebrütet.

Die Bildung an (+)-Isocitronensäure beträgt Ο,ό % bei Debaryomyces kloeckeri, 1,0 # für Trichosporon behrendii und 1,0 it· .bei Brettanbmyces claussenii. Gleichzeitig,, wird'Citronensäure in einer Ausbeute von °».5/$ bei Debaryoffiycc ε, 0,6 $ί bei Trichp'sporon und 1 % bei . ,

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Brettanomyces claussenii gebildet. Die Fermentationsbrühen werden auf die in Beispiel 2 beschriebene V/eise aufgearbeitet, wobei Citronensäure in fast quantitativer Ausbeute bei „ .den Mikroorganismen erhalten wird. Wenn die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Isocitronensäurefraktionen (d. h, nach Ausfällung von Kalziumcitrat erhaltene überstehende Flüssigkeiten und die Mutterlaugen nach der Kristallisation der Citronensäure) für jeden Mikroorganismus vereinigt werden, wird festgestellt, daß 97 % der in jeder Kulturbrühe gebildeten Isocitronensaure darin enthalten sind.

Zu jedem der vorstehenden Produkte wird die Gesamtmenge der nassen Zellen gegeben, die durch Zentrifugieren Jeder Kulturbrühe für 20 Minuten bei 5000 UpM erhalten werden, so daß die Produkte in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, reagieren können. Es wird festgestellt, daß bei den Mikroorganismen . die Isocitronensaure mit einem Umsatz von etwa 83 % in Citronensäure umgewandelt wird. Jedes der Reaktionsprodukte wird einer Behandlung in der oben beschriebenen Weise zur Isolierung der Citronensäure unterworfen. Hierbei wird Citronensäure in einer Ausbeute von 85 %, erhalten.

Beispiel 7

Eine Lösung, die 20 % Melasseabfälle von Rohrzucker (12 # reduzierender Zucker als Glucose), 0,10 % NH₂₄Cl, 0,05 % KHpPO^ und 0,05 '% MgSO₂, in Leitungswasser enthält, wird auf pH 5,5 eingestellt. 200 Raumteile.der Lösung werden in einen Fermenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat, worauf sterilisiert wird.

In den Hermenter werden dann 6,0 Gew.-Teile steriles Kaliumcarbonat gegeben. Zum Impfen des Mediums wird

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-λ---. BADORIQINÄL

Candida guilliermondii var« membranaefaclens IFO verwendet. Der Fermenter wird auf die oben beschriebene Weise mechanisch geschüttelt. Nach beendeter Kultivierung hat die Kulturbrühe einen pH-Wert von 5,5·

Bei dieser Fermentation werden J, 75 % Citronensäure (gerechnet als Cltronensäureanhydrat), bezogen auf die Kulturbrühe, erhalten. Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise werden aus dieser Kulturbrühe 9,4 Gew.-Teile (Trockengewicht) Kalziumcitrat pro 200 Raumteile Kulturbrühe isoliert. Diese Menge entspricht 7*2 Gew.-Teilen Citronensäureanhydrat. *

Die abgetrennten nassen Zellen werden gefriergetrocknet und gelagert. In 100 Raurnteilen Dinatriumphosphat-Monakaliumphosphat-Puffer, der einen pH-Wert von 8,5 hat, werden 5 Gew,—Teile Monokaliumisocitrat gelöst» Zur Lösung werden 5 Gew.-Teile der aufbewahrten trockenen fellengegeben _% Das Gemisch wird gut gerührt und mit Nafcpiumhydroj{;ydlösung genau auf pH 8,5 eingestellt*

Das Gemisch wird 5 Stunden bei J2°G stehengelassen, worauf der Mikroorganismus abfiltriert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt, wobei 5,55 Gew.-Teile Citronensäure erhalten werden*

Beispiel 8

In einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat, werden 150 Raumteile eines Mediums, das 8 % eines C^-i^g-ri-Paraffingemisches (Reinheit 92 %), 0,:5 % NH_!fC:i, 0,05 % KIIpPO^, 0,05 % MgSO₄-TH₂O, 0,05 $ FeSO₁ »THgO und 0,5 J^'GaCO^ enfchält (pil 6,5), mit earulida IFO OpOO .-jaiüipft.» worauf .5 Tage auf

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die in Beispiel 2 beschriebene Weise bebrütet wird.. Nach der Bebrütungszeit enthält die KulturbrÜhe 21 rag Citronensäure/ml und 28 mg (+)-Isocitronensäure/ml,, 100 Raumteile der KulturbrUhe werden mit 5n-NaOH auf pH 8,5 eingestellt, v/orauf I Raumteil Xylol zugesetzt wird. Das Gemisch wird unter Rühren bei 35 ''C stehengelassen. Hierbei werden 4-1 mg Citronensäure/ml und 8 mg (O-Isocitronensäure/ml erhalten.

Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die in Beispiel 1 beschriebene V/eise werden 3«Λ Gew..-Teile Citronensäure (als Anhydrat) erhalten.

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Claims (3)

-.19- Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch ■ gekennzeichnet, daß man (+)-Isocitronensäure mit einer Fermentationsbrühe einer Hefe, die (+)-Iso~ citronensäure anzuhäufen vermag und zur Gattung Candida, Brettanomyces, Debaryomyces, Hansenula, Kloeckera, Trichosporon, Torulopsis oder Pichia gehört, mit den Zellen dieser Hefe oder einer davon stammenden verarbeiteten Substanz bei einem pH-Wert von 7,0 - 9»5.in Berührung bringt, wodurch die (+)- ™

Isocitronensaure in Citronensäure umgewandelt wird, und anschließend die so angehäufte Citronensäure isoliert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kulturbrühe, die etwa 10 - 100 Gew.-Teile Hefezellen (auf Trockenbasis), etwa 10 bis Gew.-Teile Hefezellen oder ein verarbeitetes Material, das aus dieser Menge der KulturbrUhe oder der Zellen erhalten worden ist, mit 100 Gev/.-Teilen ( + )-.-Isocitronensaure in Berührung bringt.

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 45°C durchgeführt wird. '

0 G 3 8.8 5/2258 BAD ORIGINAL