DE2000494C3 - Verfahren zur Herstellung eines Elastase-Präparates mikrobieller Herkunft - Google Patents

Description

Das Fermentpräparat Elastase findet breite Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, Leichtindustrie, in der Medizin sowie in der Forschung.

In der Nahrungsmittelindustrie verwendet man Elastasc-Präparatc zum Weichmachen von Fleisch, d. h. zur Verbesserung seiner Qualität bei der fermcntativen Behandlung. In der Leichtindustrie verwendet man die Elastase zum Beizen der Rohhäutc. In der Medizin verwendet man die Präparate Elastase zum Entfernen nekrotischer Hautflächen bei Verbrennungsverletzungen, bei Narbenbildung auf der Lunge, zur Entfernung skierotischer Plättchen bei einigen Arten von Arteriosklerose, zur Reinigung von Eiterherden usw.

Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von Elastase rnikrobieller Herkunft durch Kultivierung von Flavobacterium elastolyticum, das aus der gemischten pcriodontalen Kultur von an Periodontitis Erkrankten nach der allgemein bekannten Methode isoliert wurde. Die Kultivierung von Flavobacterium elastolyticum wird auf verschiedene! Medien, darunter auf einem 3°/oigcn Trypsinhydrolysat von Soja oder auf einem Leberhydrolysat durchgeführt.

Dei Fermentation wird während 2 bis 5 Tagen durchgeführt. Dabei kommt es zu maximaler Speicherung des Fermentes in der Kulturflüssigkeit, Dann trennt man die Zellen des Produzenten (Myzel) durch Schleudern ab und fügt in die erhaltene Kulturlösung Ammoniumsulfat hinzu. Dabei scheidet sich ungereinigtes Ferment ab, dessen Reinigung durch Elektrophorese auf Polyvinylchloridgel in 0,01 molarer Lösung von Na^B₄O₇ (pH = 9,2) durchgeführt wird. Das begünstigt "die Entfernung des Pigmentes und einiger nichtelastolytischer Proteinasen. Nach einer solchen Behandlung aber bleibt die Elastase-Fraktion durch andere Fermente verunreinigt. Zu deren Entfernung wird die weitere Behandlung in Gegenwart von Aluminiumoxidgel durchgeführt. Zu diesem Zweck unterwirft man das ungereinigte Ferment, das durch das Ausfällen mit Ammoniumsulfat erhallen wird, einer Dialyse und trocknet lyophil, gibt dann Aluminiumoxidgel, destilliertes Wasser und Ammoniaklösung (pH 7,6 bis 8,0) zu. Das erhaltene Gemisch wird während 15 Minuten geschüttelt, dann im Kühler während einer Nacht stehengelassen. Den Niederschlag trennt man durch Schleudern ab. Der Überstand enthält gereinigte Elastase.

Die Ausbeute an gereinigter Elastase beträgt weniger als 10 ⁰Zo nach der Aktivität.

1 mg Elastase löst bei einer Temperatur von ^25°C 10 mg Elastin (sichtbare Auflösung) während 5 Stunden auf (Mandle and Cohen, American Chemical Sociaty Meeting, Sept. 1959; J. Mandle and B. Cohen, Archiv of Biochemistry and Biophysics, 91, 47 [I960]).

Nachteile des genannten Verfahren sind niedrige Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität, Verwendung eines schwierig herstellbaren Mediums sowie die Kompliziertheit des technologischen Prozesses, der eine Reihe aufwendiger Stufen wie SaIzfäiiung, Dialyse, Schleudern, Elektrophorese und andere enthält.

In Chemical Abstracts, Vol. 69, 1968, Referat Nr. 9050y, fehlen die Angaben über die Ausbeute und clastolytische Aktivität der Endpräparate, was eine vergleichbare Analyse der Vorzüge dieses oder jenes Verfahrens nicht zuläßt. Vor allem ist bekannt, daß in der Regel die Fermentpräparatc, die durch Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln aus der Kulturflüssigkeit erhalten werden, schlecht gereinigt sind und viele Ballasteiweißstoffe enthalten und folglich von einer geringen Aktivität sind. In Archives of Biochem. Biophys., Vol. 120, 1967, S. 69, sind Angaben über die laboratoriumsmäßige Reinigung dos Elastase-Präparatcs von Streptomyces fradiae auf KM-Zellulosc mit dem Ergebnis der Aktivität von 720 Einheiten/mg angeführt. Es muß hervorgehoben werden, daß das erfindungsgemäß hergestellte EIasiase-Präparat mit einer Aküvitätsausbcutc von bis 45°/o eine Aktivität von 150 bis 250 Einheiten/mg besitzt, was die Aktivität der Elastase der Bauchspeicheldrüse der Tiere und die Elastase von Flacobactcrium elastolyticum um das Mehrfache übertrifft. Bei einer weiteren Reinigung des Präparates, z. B. auf KM-Zellulose, erhöht sich die spezifische elastolyüsche Aktivität bis lOOÜ bis 1200 Einheiten/mg.

Die Erfindung besteht nun in einem Verfahren zur Hersteilung eines Elastase-Präparates mikrobieller Herkunft durch Kultivierung eines Mikroorganismus als Produzent auf einem Nährmedium, das Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze

enthält, unter Belüftung, durch anschließende Abtrennung der Zellen des Produzenten von der Kulturflüssigkeit und durch Isolierung der Elastase aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man als Produzenten der Elastase einen Stamm von Actinomyces rimosus verwendet, daß aus der nach der Abtrennung der Zellen des Produzenten erhaltenen Kulturflüssigkeit die Elastase auf einem Kunstharz-Ionenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol bei einer Temperatur von nicht über 10° C sorbiert wird, daß Elastase mit einer Salzlösung mit einer nicht weniger als lmolaren Konzentration und mit einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4 eluiert, aus dem Eluat mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt, abgetrennt und schließlich getrocknet wird.

Man führt die Sorption zweckmäßig auf einem Kunstharz-IoneniR'stauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol, die in einem Molverhältnis von 1 : 0,2 genommen wurden, mit einem relativen Quellvermögen von 9 bis 11 in der Na⁺-Form durch.

Vorzugsweise führt man die Sorption und die Abtrennung der Elastase bei einer Temperatur von -1-2 bis -t I⁰C durch.

Als Salzlösung verwendet man zweckmäßig eine Lösung der folgenden Zusammensetzung: 1 Mol NaCl, 0,3 Mol NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt ausgeführt:

Die Kultur eines Stammes «cm Actinomyces rimosus züchtet man auf einem Nähnneü.im, das Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

Die Fermentation wird bei einer Temperatur von + 26 bis +28⁰C während 24 Stunden, dann bei + 30 bis +32⁰C durchgeführt; der pH des Mediums wird nicht geregelt. Er steigt während der Fermentation zunächst von 6,8 auf 7,3 imrl sinkt anschließend auf 6,0 bis 6,5 ab. Die Fermentation dauert 5 bis 8 Tage. Die Kultivierung wird unter Belüften unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

Nach beendeter Fermentation wird das Myzel durch Schleudern oder Filtrieren abgetrennt. Zusammen mit dem Myzel wird die Hauptmenge des Antibiotikums entfernt, das in dem Myzel gespeichert wird.

Es hinterbleibt aber in der nach der Abtrennung des Myzels erhaltenen Kühlflüssigkeit ein Teil des Antibiotikums Oxytetracyclin, das während der Fermentation in Lösung geht. Die erhaltene Kulturflüs-Rigkeit leitet man durch eine Kolonne mit dem einen Stark quellbarcn Kationenaustauscher auf der Basis Von Salizylsäure und Phenol darstellenden Kunstharzfonenaustauscher, den man vorher mit l/15molarer Pufferlösung mit einem pH von 6,2 bis 6,4 ausgleicht, Die Sorption und die anschließende Abtrennung des Fermentes wird bei einer Temperatur von nicht über 10⁰C durchgeführt. Die optimale Temperatur der genannten Prozesse ist die Temperatur +2 bis + 4⁰C.

Beim Durchleiten der Kultlirflüssigkeit durch die Kolonne kommt es gleichzeitig zur Sorption der Elastase und des Antibiotikums. Ein Teil der inaktiven Eiweißstoffe tritt hindurch, ohne auf dem Harz sotbiert zu werden. Die Kolonne wird nach beendeter Sorption mit einem schwachen Ammoniakpuffer mit einem pH-Wert von 9,2 zum Entfernen der Pigment stoffe gewaschen. Nach dem Waschen der Kolonne wird die Elastase mit einer Salzlösung mit mindestens 1 molarer Konzentration und einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4 eluiert. Man verwendet zweckmäßig als Salzlösung die Lösung der folgenden Zusammensetzung:

1 Mol NaCl; 0,3 Mol NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4,

Beim Eluieren geht die Elastase in die Salzlösung, während die Ballasteiweiße und Antibiotika auf dem Harz zurückbleiben. Nach einer solchen Behandlung wächst der Reinheitsgrad der Elastase auf das 10- bis 25fache.

Somit findet auf dem Harz in nur einer einzigen technologischen Stufe das Konzentrieren der Elastase und deren Reinigung von dem Antibiotikum, den Pigmenten und dem Ballasteiweiß der Kulturflüssigkeit statt.

Aus dem Eluat, das eine konzentrierte Lösung von Salzen und Elastase darstellt, trennt man die Elastase durch Ausfällen mit drei Volumen von Isopropyl- oder Äthylalkohol bei einer Temperatur von nicht oberhalb +10° C ab.

Das zum Niederschlag ausgefallene Ferment wird durch Schleudern abgetrennt, in etwas Wasser oder in der 0,002molaren Calciumazetatlösung gelöst und lyophil getrocknet.

Nach der Beendigung des Verfahrens wird die Kolonne mit dem Harz mit 0,5 n-NaOH regeneriert, mit Wasser gewaschen und wieder mit 1/I5m-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,2 bis 6,4 ausgeglichen.

Die Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität beträgt 30 bis 45%>. Das erhaltene Elastase-Praparat stellt das hellcremefarbene Pulver dar. 1 mg Elastase löst (sichtbare Auflösung) vollständig 125 bis 200 mg Elastin während 5 Stunden bei einer Temperatur von 25° C auf. Bei einer Temperatur von 40° C löst 1 mg Elastase 150 bis 300 mg Elastin während 1 Stunde auf. Die maximale Wirkung der erhaltenen Elastase tritt bei einem pH von 8,8 sowie bei pH = 6,4 in 0,05- bis 0,1 molarem Tris oder GlyzinpufTer in Erscheinung. Das erhaltene Präparat ist beständig in einem pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 unter Erwärmen bei einer Temperatur von 40° C während 1 Stunde in einer Pufferlösung entsprechenden pH-Wertes.

Die Elastase besitzt eine merkliche Fähigkeit, andere Eiweiße, z. B. das Kasein, zu hydrolysieren. Ihre proteolytische Aktivität nach Kasein entspricht 25 bis 30· ΙΟ"·¹ Milliäquivalent Tyrosin, das während 1 Minute Hydrolyse von Kasein bei einer Temperatur von 40° C, bezogen auf 1 mg Ferment, freigemacht wird. Die maximale Einwirkung auf das Kasein wird bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 bcobbachtet.

Die erhaltene Elastase löst sich völlig in Wasser und Salzlösungen auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, eine hohe Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität zu erzielen, die Technologie der Gewinnung zu vereinfachen, sowie ein Präparat von hohem Reinheitsgrad und hoher Aktivität zu erhalten.

Außerdem macht es die Verwendung eines Stammes von Actinomyces rimosus, der auch ein Produzent des Antibiotikums Oxytetracyclin ist, möglich, den Prozeß gleichzeitig in zwei Richtungen durchzuführen, nämlich die Herstellung des Antibiotikums Oxytetracyclin aus dem Myzel und die Herstellung

des Fermentes Elastase aus der Kulturflüssigkeit nach der Abtrennung des Myzels vorzunehmen.

Es muß auch hervorgehoben werden, daß erftndungsgemäß eine Methode zur Herstellung von Elastase vorgeschlagen wird, die zur technischen Nutzung auf der Basis der gerade produzierenden Oxytetracyclinanlagen geeignet sind.

In diesem Falle bilden die elastolytischen Fermente den Abfall der Basisproduktion, was sich zweifellos auf die Selbstkosten des Antibiotikums und des EIastase-Präparates auswirkt Das Verfahren ist in seiner technologischen Ausführung einfach und günstig. Die Ausbeute des gereinigten Elastase-Präparates ist höher als die der anderen Quellen.

Beispiel

Man verwendet die Kultur Actinomyces rimosus LCT-Hybrid. Zur Inokulaüon verwendet man das Inoculum der ersten Generation. Die Züchtung des Inoculums dauert 48 Stunden.

Zur Fermentation verwendet maD ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung: (in Ma?se-°/o) Stärke 6; Sojamehl 2; Ammoniumsuifat 0,45; Maisextrakt 1,5; Calciumkarbonat 0,8; Wasser bis 100.

Die Fermentation wird bei 26 bis 28° C während der ersten 24 Stunden, dann bei 20 bis 32° C durchgeführt. Der pH-Wert beträgt am Anfang der Fermentation 6,8 bis 7,3, zum Schluß der Fermentation 6,0 bis 6,5. Die Fermentation wird unter sterilen Bedingungen unter aktivem Belüften durchgeführt. Die Fermentation dauert 7 Tage. Dann wird das Myzel durch Filtrieren abgetrennt.

100 1 der erhaltenen Lösung, die 200 · 10⁵ tiinheiten der Elastase-Aktivität, 600 g Eiweiß nach Txwry und 90 g Oxytetracyclin enthält, leitet man durch eine Kr tonne mit einem Kunstharz-Ionenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol (Molverhältnis 1:0,2) mit einem relativen Quellvermögen von 9 bis 11. Die Kolonne (10 · 50 mm) wird vorher mit 1/15 M Phosphatpufier mit einem pH-Wert von 6,3 ausgeglichen. Beim Durchleiten der Lösung durch die Kolonne werden auf dem Kunstharz-Ionenaustauscher 98"/ο der Elastase-Aktivität sowie 42 g Eiweiß und 78 g Oxytetracyclin sorbiert. Das Harz wird mit 121 Ammoniumpuffer der folgenden Zusammensetzung: 0,005 m NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH von 9,2 gewaschen. Mit dem Waschwasser ireten ein Teil der Farbe, 9^β/β Eiweiß und 6°/o Oxytetracyclin aus.

ίο Die Elastase wird mit 101 Puffer der folgenden Zusammensetzung: 1 m NaCl; 0,3 m NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,2 mit einer Geschwindigkeit von 750 ml/h eluiert. Das Eluat enthält 70 · 10⁵ Einheiten der Elastase-Aktivität, 30,6 g (5,1 ·/») Eiweiß nach Lowry und 1,5 g (1,7°/») Oxytetracyclin. Das Eluat neutralisiert man mit verdünnter Essigsäure und gibt unter Rühren 27 1 auf — 15° C abgekühltes jV>propanol zu, hält das Gemisch während 1 Stunde, trennt den Niederschlag

ao durch Separieren ab und löst in 1 1 Lösung von 0,002 m Calciumazetat auf. Alle Operationen werden bei einer Temperatur von nicht über +4⁰C durchgeführt. Die Elastase-Lösung wird lyophil getrocknet. Die Ausbeute an trockenem Präparat beträgt 26 g, die Ausbeute an Endprodukt nach der Aktivität 34 «/0, die Elastase-Aktivität des Endproduktes 260 Einheiten/mg, der Gehalt des Endprouktes an Oxytetracyclin Spuren.

Als ungeeignet für die Eluierung erweisen sich die Salzsysteme, die Ionen von Schwermetallen enthalten, z. B. Salze von Hg, Ag, Cd, Pb, Sn und einige andere, die für den absolut größten Teil der Fermente Gift sind und daher nicht zum Eluieren verwendet werden. Zur Eluierung werden auch die Salze der Metalle nicht verwendet, die bei einem alkalischen pH-Wert Gallerten bilden, z. B. Salze von Fe^{++ +} . Das ist den Spezialisten auf dem Gebiet der Ioncnaustausch-Chromatographie und der Enzymologie bekannt und bedarf keiner weiteren Erläuterungen.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Elastase-Präparates mikrobieller Herkunft durch Kultivierung eines Mikroorganismus als Produzenten auf einem Nährmedium, das Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter Belüftung, durch anschließende Abtrennung der Zellen des Produzenten von der Kulturflüssigkeit und durch Isolierung der Elastase aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man als Produzenten der Elastase einen Stamm von Actinomyces rimosus verwendet, daß aus der nach der Abtrennung der Zellen des Produzenten erhaltenen Kulturflüssigkeit die Elastase auf einem Kunstharz-Ionenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol bei einer Temperatur von nicht über 10⁰C sorbiert wird, daß die Elastase mit einer Salzlösung mit einer nicht weniger als 1 molaren Konzentration und mit einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4 eluiert, aus dem Eluat mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt, abgetrennt und schließlich getrocknet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sorption auf einem Kunsth.irz-Ionenaustauscher auf der Basis von Salizylsäure und Phenol, die in einem Molverhältnis von 1 :0,2 genommen wurden, mit einem relativen Quellvermögen von 9 bis 11 in der Na ⁺-Form durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sorption und die Abtrennung der Elastase bei einer Temperatur von +2 bis +4° C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Salzlösung die Lösung folgender Zusammensetzung verwendet: 1 Mol NaCl, 0,3 Mol NH₄Cl und NH₄OH bis zu einem pH-Wert von 9,0 bis 9,4.