DE2555587B2 - Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase - Google Patents

Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase (EC 3.4.4.2!-Substanz), wobei das Pancreas eines Säugetieres mit Wasser in Gegenwart eines Salzes bei einer Temoeratur von etwa 45 bis etwa 60°C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 extrahiert wird.
Es ist bereits bekannt, Kallidinogenase, ein Kreislaufhormon, aus dem »Pancreas von Säugetieren«, wie es hier angegeben wird, beispielsweise dem Pancreas von Säugetieren selbst, einem Pulver des Pancreas oder dem kallidinogenasehaltigen Extrakt des Pancreas zu extrahieren und die extrahierte rohe Kallidinogenase zu reinigen.
Das übliche Verfahren zu Extraktion von Kallidinogenase aus dem Pancreas von Säugetieren umfaßt die Behandlung eines Pancreas mit hohem Fettgehalt zur Fettentfernung, wofür jedoch ein kompliziertes Verfahren erforderlich ist, und die anschließende Extraktion des entfetteten Pancreas mit Wasser bei erhöhter
Temperatur bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 7. Wenn die Behandlung zur Fettentfernung bei diesem Verfahren weggelassen wird, werden Extraktionsarbeitsgang und die Arbeitsweise zur Abtrennung und Sammlung der wäßrigen Phase äußerst schwierig. Das Verfahren zeigt auch den Nachteil, daß selbst nach der Durchführung der Fettentfernungsbehandlung der Extraktionsarbeitsgang und die Abtrennung der wäßrigen Phase noch kompliziert sind und daß die Ausbeute an Kallidinogenase niedrig ist
Gemäß einem verbesserten Verfahren wird der vorstehend beschriebene Extraktionsarbeitsgang unter Anwendung einer wäßrigen Lösung eines Alkalisalzes, wie Natriumchlorid oder eines Ammoniumsalzes in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,7 durchgeführt (vgL J P-Patentveröffentlichung 17 041/73). Obgleich dieses Verfahren gegenüber dem Verfahren, bei welchen» 'leine Salze verwendet werden, überlegen ist, ist es jedoch mit Nachteilen infolge der Anwendung von organischen Lösungsmitteln verbunden. Weitere Verbesserungen hinsichtlieh der Ausbeute (Aktivität), der Wärmesiabüität und der Trübung der Kallidinogenase während der Extraktionsstufe sind noch erwünscht.
Es sind ferner verschiedene Aroeitsweisen hinsichtlich der Reinigung von kallidinogenase-haltigen wäßrigen Extrakten, die aus dem Pancreas von Säugetieren erhalten wurden, durch Absorption-Elution bekannt. Beispielsweise wurden zwei Arten von Reinigungsverfahren angegeben, wovon die eine Art auf der Anwendung eines Nicht-Harz-Matenals vom Polysaccharidtyp beruht, die beispielsweise eine Verfahren umfaßt, wobei die rohe Kallidinogenase an einer schwach basischen Anionenaustauschercellulose adsorbiert wird und abgetrennt wird (vgl. JP-Patentveröffentlichung 11 697/62), und ein Verfahren, welches den Zusatz eines Blei- oder Zinksalzes zu einer wäßrigen kallidinogenase-haltigen Lösung umfaßt, wobei der erhaltene Kaliidinogenaseniederschlag an einer schwach basischen Anionenaustauschcellulose oder einem vernetzten Dextran adsorbiert und abgetrennt wird (vgl. JP-Patentveröffentlichung 56 889/73, entsprechend DE-OS 21 54 557), während die andere Art auf der Anwendung von lonenaustauschharzen beruht, welche beispielsweise ein Verfahren umfassen, das den Zusatz eines Proteinausfällungsmittels zu einem Extrakt von Gewebezellen des Pancreas, Adsorption der erhaltenen Kallidinogenase an einem makroporösen stark basischen Anionenaustauschharz und deren Abtrennung umfaßt (vgl. JP-Patentveröffentlichung 10 37 15/73).
Die Verfahren, bei denen als Adsorptionsmittel ein Nicht-Harzmaterial vom Polysaccharidtyp verwendet wird, haben den Nachteil, daß die physikalische Festigkeit des lonenaustauschmaterials nicht ausreichend ist und eine Verunreinigung durch Mikroorganismen leicht auftritt, so daß sie deshalb für die großtechnische Durchführung nicht geeignet sind. Andererseits hat die andere Art den Vorteil, daß die vorstehenden Störungen vermieden werden, ist jedoch unzufriedenstellend beispielsweise hinsichtlich der Eluierung des gewünschten Produktes und der Entfernung von unerwünschter Kininase.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase, wodurch die Kallidinogenase mit überiegener Wärmestabilität, Aktivität und in guter Abtrennbarkeit abgetrennt und gesammelt werden kann und Kallidino-
genäse von hoher Reinheit gewonnen werden kann.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt gemäß der Erfindung durch die Schaffung eines Verfahrens zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase, wobei das Pancreas von Säugetieren mit Wasser in Gegenwart eines Salzes bei einer Temperatur von etwa 45 bis etwa 65° C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 extrahiert wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Extraktion in Gegenwart eines wasserlöslichen Salzes von Magnesium mit einer Säure durchgeführt wird.
Mit Hilfe des Verfahrens gemäß der Erfindung ergibt sich eine verbesserte Kallidinogenaseabtrennbarkeit (erhöhte Ausbeute), wobei eine kallidinogenase-haltige wäßrige Phase mit verringerten Mengen an Protein und anderen Verunreinigungen (niedere Trübung) in größerer Menge als bei den bisherigen Verfahren bei Anwendung der gleichen Menge als bei den bisherigen Verfahren bei Anwendung der gleichen Menge an Extraktionswasser erhalten werden kann. Ferner kann die kallidinogenase-haltige wäßrige Phase mit hoher KallidinogenascaXtivität in vorteilhafter Weise nach einem einfachen Feststoff-Flüssigkeits-Trennverfahren erhalten werden, ohne daß irgendwelche Maßnahmen zur Abtrennung der wäßrigen Phase, beispielsweise Zentrifugalabtrennung, erforderlich sind. Bei Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist die Kallidinogenase sehr stabil gegenüber Wärme bei den Extraktionsbedingungen im Vergleich zu den bisherigen Arbeitsweisen und sie zeigt in vorteilhafter Weise keine Anfälligkeit für Denaturierung während der Extraktionsstufe.
Wie aus den : achstehenden Vergleichsversuchen hervorgeht, können nach Hern Verfahren gemäß der Erfindung bessere Ergebnisse erzielt werden als im Fall der Anwendung der Alkalisalze oder Ammoniumsalze gemäß der JP-Patentanmeldung 17 041/73, wobei die gemäß der Erfindung erzielbare Verbesserung selbst dann nicht erreicht werden kann, wenn Salze von Calcium oder Aluminium verwendet werden.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Pancreas von Säugetieren kann ein verdünntes oder zerkleinertes Produkt des rohen Pancreas von Säugetieren, wie Schweinen, Kühen, Pferden oder Walen sein oder ein acetonbehandeltes Pancreaspulver oder ein Wasserextrakt des Pancreas. Gemäß der Erfindung ist es nicht notwendig, das rohe Pancreas einer komplizierten Entfettungsbehandlung vorhergehend zu unterziehen, sondern das rohe Pancreas, das zu der gewünschten Form für die Durchführung einer leichten Extraktion verdünnt ist, kann direkt verwendet werden.
Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung wird das Pancreas von Säugetieren unter Zusatz eines wasserlöslichen Magnesiumsalzes einer Säure extrahiert. Die
Extraktion wird bei einer Temperatur von etwa 45 bis etwa 60° C bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 8 während eines Zeitraumes von beispielsweise etwa 30 min bis etwa 2 h ausgeführt Falls der pH-Wert niedriger als etwa 5 oder höher als etwa 8 ist, ist die Kallidinogenase anfällig gegenüber Desaktivierung während des Extraktionsarbeitsganges oder die Abtrennbarkeit der wäßrigen Phase wird schlecht, so daß eine Verminderung der Ausbeute an Kallidinor-enase erzielt wird und ferner wird der Abtrennarbeitsgang schwierig. Falls die Extraktionstemperatur niedriger als etwa 45° C ist, wird die Abtrennbarkeit der wäßrigen Phase schlecht und lange Zeiträume sind zur Abtrennung erforderlich, beispielsweise durch Stehenlassen des Systems. Dadurch ergibt sich eine Desaktivierung der Kallidinogenase und eine verringerte Ausbeute hiervon. Falls andererseits die Extraktionstemperatur etwa 60" C überschreitet, wird die Kallidinogenase leicht desaktiviert und diese Neigung nimmt zu, wenn nicht die erforderliche Zeit zur Abtrennung der Kallidinogenase durch Stehenlassen des Systems verkürzt wird. Jedoch wird durch die Verkürzung des Abtrennungszeitraumes die Abtrennung ungenügend, wodurch eine Verringerung der Ausbeute an Kallidinogenase verursacht wird.
Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wird die Extraktion in Gegenwart eines wasserlöslichen Salzes von Magnesium mit einer Säure, welches dem Extraktionssystem zugesetzt wurde, durchgeführt. Das wasserlösliche Magnesiumsalz einer Säure kann beispielsweise aus Salzen bestehen, die zwischen Magnesium und Säuren, wie Mineralsäuren, Kohlensäure und Fettsäuren mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen gebildet wurden. Spezifische Beispiele für wasserlösliche Magnesiumsalze sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Magnesiumsulfat, Magnesiumformiat, Magnesiumacetat, Magnesiumpropionat, Magnesiumbutyrat, Magnesiumlactat, Magnesiummalat, Magnesiumoxalat, Magnesiumsuccinat und Magnesiumvalei al.
Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erzielbaren Vorteile lassen sich experimentell wie folgt zeigen:
Das Versuchsverfahren besteht darin, daß 500 ml Wasser zu 100 g zerkleinertem rohen Pancreas (essentieller Pancreasgehalt etwa 50%) vom Schwein zugesetzt werden, der pH-Wert des Gemisches auf 6 eingestellt wird, jedes der verschiedenen in Tabelle I aufgeführten Salze zugesetzt wird, das Gemisch I Std. bei 55°C zur Extraktion stehengelassen wird und die Kallidinogenase gesammelt wird. Abtrennbarkeit, Trübung und relative Kallidinogenaseaktivität des kallidinogenasehaltigen wäßrigen Extraktes und Wärmestabilität der Kallidinogenase wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I
Salze Konzentration Kallidinogenasehalligcr wäßriger Extrakt (O. D. 600) Relative Kallidi-
der Salze Abtrennbar- Trübung nogenaseaktivilät
keil (%)
(M) (%) 3,1
Vergleich 1,7 60
Kein Zusatz - 57 1.7 68
Ammoniumchlorid 0,03 65 75
Natriumacetat 0,03 60
Wärmestabilität der K.'.llidinogcnasc (relative verbliebene Aktiviläl
77 70 83
5 Konzentration 25 55 587 6 Kallidinogenasehaltiger wäUriger Extrakt 1,7 Relative Kallidi-
nogenaseaktivitäl 		Wärmestabililät der
der Salze Abtrennbar- Trübung
keil (O.D.600) 		1,6 (%) Kallidinogenase (relative
verbliebene Aktivität
Fortsetzung (M) (%) 1,7 (%)
Salze 1,7 88
0,03 72 1,7 88 86
0,06 70 1,7 70 86
Vergleich 0,03 60 20 75
Natriumchlorid 0,03 75 66 35
Natriumchlorid 0,03 72 70 83
Natriumsulfat 0,03 75 85
Aluminiumacetui 90
Calciumacetat 0,03 81 92 93
Calciumchlorid 0,03 82 98 93
Ei findungsgemäß 0,03 84 100 Ψ,
Magnesiumcarbonat 0,03 85 95 100
Magnesiumchlorid 0,03 84 ,3 97 96
Magnesiumsulfat 0,03 83 ,2 94 98
Magnesiumacetat 0,03 83 ,2 91 95
Magnesiumlactat 0,03 81 ,1 93
Magnesiumpropionat ,2
Magnesiumbutyrat ,/
Magnesiumsuccinat ,2
,2
Die Wärmestabilität der Kallidinogenase ist diejenige der gereinigten, bei 55° C und einem pH-Wert von 6,0 während 60 min gehaltenen Kallidinogenase und angegeben als relative restliche Aktivität (%), wobei die restliche Aktivität der in Gegenwart von Magnesiumacetat erhaltenen Kallidinogenase zu 100% angenommen wurde.
Die Abtrennbarkeit (%) gibt den Prozentsatz der Menge des Extraktes, bezogen auf die Gesamtmenge der behandelten Flüssigkeit, an. Die Trübung des Extraktes wurde bei 660 nm gemessen. Die Aktivität ist die BAEE-Zersetzungsaktivität (Benzoylargininäthylester) des Extraktes, gemessen in Gegenwart von 0,02% Sojabohnentrypsin als Hemmstoff. Die BAEE-Zersetzungsaktivität des in Gegenwart von Magnesiumacetat erhaltenen Extraktes wurde zu 100% angenommen und der gemessene Wert auf diese Basis umgewandelt Eine BAEE-Einheit ist die erforderliche Kallidinogenasemenge, um 1 μ-Mol BAEE je min zu zersetzen, wenn die Kallidinogenase zur Einwirkung auf BAEE bei 37°C gebracht wird.
Der in Gegenwart von Magnesiumacetat erhaltene Extrakt wird gut dialysiert. Die Kallidinogenaseeinheit (KU) des Dialysats wird bestimmt durch die Erhöhung des Blutströmungsverfahrens (siehe Hiroshi Moriya, »Basic Lectures in the Development of Medicines«, Bd. 5, Pharmacological tests, S. 974, JP-Veröffentlichung aus 1971 der Chijin Shokan Company, Tokyo) und beträgt 75 000 je kg kg des rohen Pancreas
Der Effekt der Salze, die zur Extraktion der Kallidinogenase aus einem Pulver oder Wasserextrakt von Schweinepancreas verwendet werden, zeigte die gleiche Tendenz wie im Fall der Anwendung des vorstehend beschriebenen rohen Pancreas.
Vorzugsweise ist die Menge des wasserlöslichen Magnesium-Säure-Salzes so, daß die Konzentration dieses Salzes mindestens etwa 0,02 Mol und üblicherweise etwa 0,02 b,s etwa 1 Mol je I Wasser beträgt. Die
geeignete Konzentration kann innerhalb dieses Bereiches entsprechend der Art des einzusetzenden Salzes gewählt werden. Das Salz kann in höheren Konzentrationen angewandt werden, jedoch wird kein merklicher Anstieg des Effektes bei einer Erhöhung der Konzentration erhalten. Wenn die Konzentration des Salzes weniger als etwa 0,02 Mol je 1 Wasser ist, wird die Kallidinogenaseextraktionswirksamkeit schlecht und die Abtrennbarkeit der kallidinogenabe-ha.iigen wäßrigen Phase von den unerwünschten Komponenten wird schlecht. Weiterhin führt dies zu einer Erhöhung der Menge des im wäßrigen Extrakt gelösten Proteins. Infolgedessen wird die Nachbehandlung des wäßrigen Extraktes kompliziert und die Ausbeute an Kallidinogenase zeigt einen Abfall.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist ein Verfahren vorgesehen, bei welchem man die wäßrigi; Phase eines kallidinogenasehaltigen wäßrigen, nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Extrakts, der aus dem Pancreas von Säugetieren erhalten wurde, einer Adsorptions-Elutions-Behandlung unter Anwendung eines Anionenaustauscherharzes unterzieht, wobei die die wäßrige Phase das kallidinogenase-haltigen wäßrigen Extraktes in Kontakt mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz vo;n Geltyp zur Adsorption der Kallidinogenasefraktion an dem Harz gebracht wird und die Kallidinogenase mit einer wäßrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwachen Säure eluiert und die Kallidinogenase gesammelt wird.
Geinäß der Erfindung wurde festgestellt, daß bei Verwendung des schwach basischen Aniorxnaustauschharzes vom Geltyp ein größererTeü der unerwünschten Kininase vollständig in der Waschstufe nach der Adsorption entfernt werden kann und daß die adsorbierte Kailidinogenase mit guter Wirksamkeit und in gutem Gewinnungsausmaß bei einer anschließenden Eluierstufe eluiert und zurückgewonnen werden kann,
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was weniger zeitraubend als bei den bisher bekannten Verfahren ist. Es wurde auch gefunden, daß dieser überlegene Reinigungseffekt nicht erhalten wird, wenn ein stark basisches Anionenaustauschharz vom Geltyp oder ein makroporöses schwach basisches Anionenaus- j tauschharz verwendet werden. Vielmehr wird dieser einzigartige Effekt lediglich mit einem erfindungsgemäß eingesetzten schwach basischen Anionenaustauschharz vom Geltyp erzielt.
Es wurde gefunden, daß mit einem makroporösen, in stark basischen Anionenaustauschharz und einem makroporösen, schwach basischen AniuiieMauMami-n· harz, wie in der DE-OS 21 54 557 verwendet, die Eliiicrung der daran adsorbierten Kallidinogenase langsam ist und daß zur vollständigen Eluierung und r Abtrennung eine große Menge an Lösungsmittel und ein langer Zeitraum erforderlich ist, und weiterhin die abgetrennte Kallidinogenase Verunreinigungen enthält, wohingegen bei Anwendung eines schwach basischen Änionenausiauschharzes vom Gcityp die daran adsor- _>n biene Kallidinogenase sehr rasch unter Anwendung einer wäßrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwachen Säure als Eluicrungsmittel eluiert und leicht von den Verunreinigungen abgetrennt werden kann.
Entsprechend dem Reinigungsverfahren gemäß der y, Erfindung wird die kallidinogenase-haltige wäßrige Extrakt durch eine Kolonne eines schwach basischen Anionenaustauschharz.es vom Geltyp geführt, um den Kontakt zwischen dem wäßrigen Extrakt und dem Ionenaustauschharz sicherzustellen und dadurch die in Kallidinogenasefraktion an das Ionenaustauschharz zu adsorbieren. Vorzugsweise wird der Adsorptionsarbeitsgang bei einem pH-Wert von mehr als etwa 4, jedoch unterhalb etwa 8, insbesondere etwa 5 bis etwa 7. und besonders bevorzugt etwa 6 ±0,5 ausgeführt. Bei r> pH-Werten außerhalb der angegebenen Bereiche wird die Kallidinogenase desaktiviert und bei einem pH-Wert von höher als etwa 8 nimmt die Menge der nicht adsorbierten Kallidinogenase zu. Infolgedessen werden Ausbeute und Reinheit der Kallidinogenase -in verringert.
Die an dem schwach basischen Anionenaustauschharz vom Geltyp adsorbierte Kallidinogenase wird unter Anwendung einer wäßrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwachen Säure bei einem j'. pH-Wert von etwa 6 bis etwa 7 eluiert. Die Temperatur, bei der die Adsorption und Elution ausgeführt wird, kann jede Temperatur sein, bei der sich die Kaüidinogenase nicht zersetzt. Üblicherweise werden diese Arbeitsgänge bei Raumtemperatur ausgeführt. Das Salz >n kann aus dem Eluat durch Maßnahmen, wie Dialyse oder Ultrafiltration abgetrennt werden und das erhaltene Produkt kann bei Temperaturen unterhalb der Zersetzungstemperatur der Kallidinogenase, üblicherweise unterhalb ezwa 60° C, getrocknet werden. Die Trocknung kann beispielsweise durch Lyophilisiening oder Sprühtrocknungsverfahren erfolgen.
Das bei der Durchführung des vorstehenden Reinigungsverfahrens eingesetzte schwach basischen Anionenaustauschharz vom Geltyp besteht vorzugsweise aus einem Harz mit einem sekundären oder tertiären Amin als Austauschgruppe und Beispiele hierfür sind Harze von Divinylbenzolacrylattyp und Harze vom Styroldivinylbenzoltyp.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von bs Beispielen näher erläutert. In diesen Beispielen betrugen die essentiellen Pancreasgehalte etwa 50 Gew.-%, bezogen auf eingesetztes Pancreas. Das Pancreas wurde ohne Entfernung des Fettes verwendet.
Die Kininaseaktivität ist in Kininaseeinheiten angegeben. Eine Kininaseeinheit ist die erforderliche Menge, um 1 ng Bradykinin je min zu zersetzen.
Beispiel 1
500 g rohes Schweinepancreas wurde zerschnitzelt und 2000 ml Wasser wurden zugesetzt. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,0 eingestellt. 12 g (Konzentration 0,05 Mol) Magnesiumsulfat wurden zu dem vorstehenden Gemisch zugesetzt und alles gründlich vermischt. Das Gemisch wurde bei etwa 50 C während 1.5 h stehengelassen. Der als Bodenschicht abgeschiedene Extrakt wurde abgenommen und die Kallidinogenase wurde in einer Menge entsprechend 36 000 Kallidinogcnasecinheiten (KU) erhalten.
Beispiel 2
500 g rohes Schweinepancreas wurde zerschnitzelt und 20(XJ ml Wasser wurden zugesetzt. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,0 eingestellt. 13 g (Konzentration 0,03 Mol) Magnesiumacetat wurden zum Gemisch zugegeben und alles gründlich vermischt. Das Gemisch wurde bei etwa 55°C während 1 h stehengelassen. Der als Bodenschicht abgetrennte Extrakt wurde abgenommen und Kallidinogenase wurde in einer Menge entsprechend 37 000 KU erhalten.
Beispiel 3
100 g acetongetrocknetes Pulver von Schweinepancreas wurde mit 3000 ml Wasser vermischt und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6 eingestellt. 16 g (Konzentration 0,025 Mol Magnesitimacetat wurden zu dem Gemisch zugegeben und alles gut vermischt. Das Gemisch wurde bei etwa 500C während 1.5 Std. stehengelassen. Der als Bodenschicht abgeschiedene Extrakt wurde abgenommen und Kallidinogenase in einei Menge entsprechend 73 000 KU erhalten.
Beispiel 4
3000 ml Wasser wurden zu 100 g eines wäßrigen Extraktes von Schweinepancreas zugesetzt und der pH des Gemisches auf 6 eingestellt. !8 g (Konzentration 0,05 Mol) Magnesiumsulfat wurden zum Gemisch zugegeben und alles gut vermischt. Das Gemisch wurde bei etwa 47°C während 2 Std. stehengelassen. Der als Bodenschicht abgeschiedene Extrakt wurde abgenommen und Kaüidinogenase wurde in einer Menge entsprechend 72 000 KU erhalten.
Beispiel 5
300 g rohes Schweinepancreas wurde zerschnnzelt und 900 ml Wasser zugesetzt und der pH-Wert des Gemisches auf 6 eingestellt 6,25 g (Konzentration 0,03 Mol) Magnesiumacetat wurden zum Gemisch zugegeben und alles gründlich vermischt. Das Gemisch wurde bei etwa 50° C während 1,5 Std. stehengelassen. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur zur Entfernung der das Fett enthaltenden Oberschicht stehengelassen. Die Bodenschicht wurde einer Zentrifugalabscheidung unterworfen, wobei 80Ci ml des Extraktes erhalten wurden. Der Extrakt wurde durch eine Kolonne (3 χ 25 cm) eines schwach basischen Anionenaustauschharzes vom Geltyp (Harz vom Divinylbenzolacrylat-Typ), gepuffert mit einer O,15m-Lösung von Ammoniumacetat (pH 6,0), gegeben und nach der Wäsche des Harzes mit einer O^m-Ammoniumacetatlösung (pH 6,0) wurde der Extrakt mit einer O,4m-Ammo-
ίο
niumacetatlösung eluiert (pll 6,0).
Das Salz wurde aus dem Eluat entfernt und die erhaltene Kallidinogenasefraktion lyophilisiert, wobei 148 mg (117,7 KU/mg) Kallidinogenase erhalten wurden. Die Kininase-Einheit dieses Produktes je Kallidinogenase-Einheit (KU) betrug lediglich 0,5.
Beispiel 6
30 g eines acetongetrockneten Pancreaspulvers wurden gut mit ihrer 30fachen Wassermenge vermischt und der pH-Wert des Gemisches auf 6 eingestellt, 3,2 g (Konzentration 0,05 Mol) Magnesiumsulfat wurden zum Gemisch zugesetzt und alles gründlich vermischt. Das Gemisch wurde bei etwa 45°C während 2 Std. stehengelassen. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur stehengelassen und die Oberschicht, welche Feststoffe, wie unlösliches Protein enthielt, wurde entfernt. Die Bodenschicht wurde einer Zentrifugalabtrennung unterworfen und 55O ml F.xtrakl nrhnltrn I), r Extrakt wurde durch eine Kolonne (3 χ 25 cm) eines schwach basischen Anionenaustauschharzes vom Geltyp (Harz vom Styroldivinylben/.ol-Typ). gepuffert mit einer 0,15m-Ammoniumacetatlösung (pH 6,0), gegeben und nach der Wäsche des Harzes mit 600 ml einer 0,2m-Ammoniumacetatlösung (pH 6,0) wurde der Extrakt mit einer O,4m-Ammoniumacetatlösung (pH 6.0) eluiert.
Das Salz wurde aus dem Eluat entfernt und die erhaltene Kallidinogenasefrakiion lyophilisiert, so daß 156 mg (142,3 KU/mg) Kallidinogenase erhalten wurder Die Kininase-Einheit dieses Produktes je Kallidinogenase-Einheit (KU) betrug lediglich 1.
Beispiel 7
Die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Extrakte wurden jeweils in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 eluiert und getrocknet, wobei 257 mg bzw. 241 mg Kallidinogenase erhallen wurden. Die Kallidinugenaseaktivitäten betrugen 108,3 KU/mg bzw. 126,2 KU/mg.
Beispiels
Der in Beispiel 3 erhaltene Extrakt wurde in der
gleichen Weise wie in Beispiel 6 eluiert und getrocknet und dabei 355 mg Kallidinogenase erhalten. Die Kallidinogenaseaktivität dieses Produktes betrug
ίο 98,5 KU/mg.
Verglcichsversiich
Zum Nachweis, daß lediglich bei Verwendung des schwach basischen Anionaustauschharzes vom Geltyp ι ί gemäß der Erfindung die Eluierung und Rückgewinnung der Kallidinogenase in zufriedenstellendem Rückgewinnungsausmaß und mühelos durchführbar ist, wurde der folgende Versuch unter Verwendung der nachstehen-Hpn Λ ninnpnniKtaiiQrhhiiryp aiisapffihrt;
~" (I) Schwachbasisches polysaccharidfreies Anionenaustauschharz vom Geltyp (ein Harz vom Divinyl-
benzolacrylat-Typ).
(2) Schwachbasischer, makroporöser, vernetzter Poly-
saccharid-Anionenaustauscher.
"' (3) Schwachbasischer, makroporöser Polysaecharid-Anionenaustauscher.
20 I eines Extraktes von rohem Pancreas, gewonnen von Schweinen (3 BAEE Einheiten/ml als Kallidinoge-
i( nase und 210 HPLA Einheiten/ml als CPace) wurden durch eine Kolonne (10 χ 130 cm, 10 1) aus jeweils einem der vorstehend angegebenen Anionenaustauschharzen geleitet, worauf das Harz mit 25 I einer wäßrigen Lösung von O,2m-Ammoniumacetat (pH 6,0) gewaschen
r> und jeweils 15 I Eluat gesammelt wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:
Tabelle Il Erfindung CPase Vergleich 1 CPase i. Vergleich 2 3 CPase 15 Std.
Harz 1 980 x 103 Harz 2 3,100XlO3 Harz schwach basisches makro 103 2,300 X 103 Rückgew.)
Ionenaustauscher poröses Polysaccharid
Eigenschaften des Ionenaus 960 2,760 2,:>50
tauschers (98) (89) 201 (91)
schwach basisch, poly- schwach basisches makro-
Menge des Schweine- saccharidfreier Gel-Typ 5 pnröses vernetztes PoIy- 220 KA 140
pancreaseextraktes (0,5) saccharid (7) 57 x (5)
Enzym 201 0 201 62 56
Menge des adsorbierten (0) (2) 4,5 (2)
Enzyms KA* 0 κ Α 16 (8) 14
Menge des während des 57 X 103 (0) 58 x 103 (0,5) (0,5)
Waschens eluierten Enzyms 30
Menge des eluierten Enzyms 0 0 (53)
1. Fraktion (0) (0) 18
0-151 (32)
2. Fraktion 56,5 30 2,3
15-301 (99) (52) (4)
3. Fraktion 0 24 etwa
30-45I (0) (41) (89%
Zeitdauer für die Eluierung 0 3
und Rückgewinnung von (0) (5)
1,5 Std. etwa 30 Std
99% KA
il
12
Fortsetzung
Erfindung
Vergleich I
Vergleich 2
Grad der Schwierigkeit in der Regenerierung des Ionenaustauschers innt.halb der Säule
KA* = Kallicliongenase.
leicht
unmöglich
schwierig
In der vorstehenden Tabelle Il bedeuten die in Klammern gesetzten Zahlen die Prozentangaben der Menge des eluicrten Enzyms bezogen auf die Menge Jos an das lonenaustauscherharz adsorbierten Enzyms.

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase (EC 3.4.4.21 -Substanz), wobei das Pancreas eines Säugetieres mit Wasser in Gegenwart eines Salzes bei einer Temperatur von etwa 45 bis etwa 600C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 extrahiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in Gegenwatt tines wasserlöslichen Salzes von Magnesium mit einer Säure durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Magnesiumsalz ein Magnesiumsalz von Mineralsäuren oder ein Magnesiumsalz von Fettsäuren mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Konzentration des Salzes von etwa 0,02 bis etwa 1 Mol je I Wasser angewandt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Magnesiumsalz Magnesiumcarbonate Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Magnesiumsulfat, Magnesiumformiat, Magnesiumacetat, Magnesiumpropionat, Magnesiumbutyrat, Magnesiumlactat, Magnesiummaleat, Magnesiumoxalat, Magnesiumsuccinat und/oder Magnesiumvalerat angewandt werden.
5. Verfahren zur Extraktion und Sammlung von Kallidinogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Phase eines kallidinogenase-haltigen wäßrigen, nach einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 erhaltenen Extrakts, der aus dem Pancreas von Säugetieren erhalten wurde, einer Adsorptions-Elutions-Behandlung unter Anwendung eines Anionenaustauschharzes unterzieht, wobei die wäßrige Phase des kallidinogenasehaltigen wäßrigen Extraktes in Kontakt mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz vom Geltyp zur Adsorption der Kallidinogenasefraktion an dem Harz gebracht wird und die Kallidinogenase mit einer wäßrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwachen Säure eluiert und die Kallidinogenase gesammelt wird.
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