CH624991A5

CH624991A5 - Process for the purification of kallidinogenase

Info

Publication number: CH624991A5
Application number: CH1605675A
Authority: CH
Inventors: Kiyochika Tokuyasu; Takeshi Yokobori; Chizuko Nakahara
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1975-12-05
Filing date: 1975-12-10
Publication date: 1981-08-31
Also published as: CA1061269A; FR2334689A1; GB1522359A; FR2334689B1; DE2559588A1; DE2559588B2; GB1522358A; DE2559588C3; DE2555587A1; CA1057221A; DE2555587C3; DE2555587B2; US3994782A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Kallidinogenase (EC 3.4.4.21-Substanz,

bekannt unter der Handelsmarke «Kallikrein») aus Pankreas von Säugetieren. "5

Die Erfindung basiert auf einem Extraktionsverfahren, nach welchem verbesserte Separabilität von Kallidinogenase und damit eine vergrösserte Ausbeute eines Kallidinogenase enthaltenden, wässrigen Extraktes mit vermindertem Anteil von Protein und anderen Verunreinigungen (schwacher Trübung) 50 in einer grösseren Menge als bisher, jedoch unter Verwendung desselben Anteils Extraktionswasser, erhalten werden kann. Der Kallidinogenase enthaltende wässrige Extrakt mit hoher Kallidinogenase-Aktivität kann durch ein einfaches fest/flüssig-Trennverfahren erhalten werden, ohne dass die wässrige Phase 55 in einem besonderen Schritt abgetrennt werden muss, z. B.

durch Zentrifugation. Ferner ist die Kallidinogenase unter diesen Extraktionsbedingungen sehr wärmestabil und zeigt, verglichen mit früheren Verfahren, keine Tendenz zur Denaturierung während der Extraktion. w

Es ist bekannt wie man Kallidinogenase, ein zirkulatori-sches Hormon, aus «Pankreas von Säugetieren» (dieser Ausdruck soll in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden) wie Pankreasgewebe, pulverisierter Pankreas oder ein Kallidinogenase, enthaltender Extrakt von Pankreas, gewinnen m kann und anschliessend die rohe Kallidinogenase reinigen kann.

Das konventionelle Verfahren zur Extraktion von Kallidinogenase aus Pankreas von Säugetieren besteht darin, dass Pankreas mit hohem Fettgehalt einer Behandlung unterworfen wird, wodurch das Fett entfernt werden soll, was ein kompliziertes Vorgehen erfordert, worauf der entfettete Pankreas mit Wasser bei erhöhter Temperatur und bei einem pH-Wert von 4-7 extrahiert wird. Falls keine Behandlung zur Entfernung des Fettes durchgeführt wird, gestaltet sich die Extraktion und anschliessende Separation der wässrigen Phase sehr schwierig. Das Verfahren hat auch den Nachteil, dass nach der Entfettungsbehandlung die Extraktion und anschliessende Separation der wässrigen Phase immer noch schwierig durchzuführen ist und dass die Ausbeute von Kallidinogenase niedrig ist.

Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem die oben genannte Extraktion unter Verwendung einer wässrigen Lösung eines Alkalimetallsalzes, wie Natriumchlorid, oder eines Ammoniumsalzes und in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert von 5,5-9,5 durchgeführt wird (JA-AS 17041/73). Dieses Verfahren bedeutet einen Fortschritt gegenüber dem Verfahren, bei dem keine Salze verwendet werden, die Verwendung organischer Lösungsmittel bringt jedoch bestimmte Nachteile. Es wäre demzufolge ein Verfahren erwünscht, das vor allem in bezug auf die Ausbeute (Aktivität), Wärmestabilität und Trübung der Kallidinogenase während dem Extraktionsschritt verbessert ist.

Andererseits wurden die verschiedensten Vorschläge gemacht bezüglich der Reinigung einer Kallidinogenase enthaltenden wässrigen Phase, wie sie aus dem Pankreas von Säugetieren durch Adsorptions-Elution erhalten wird. So wurden z. B. zwei Typen von Reinigungsverfahren vorgeschlagen, wobei das eine auf der Verwendung von Polysaccharid basiert Zum Beispiel besteht ein solches Verfahren darin, dass die rohe Kallidinogenase an einer schwach basischen Anionenaus-tauschercellulose adsorbiert wird und anschliessend abgetrennt wird (JA-AS 11697/62) und einer Methode, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Blei- oder Zinksalz zu einer wässrigen Lösung, die Kallidinogenase entält, gegeben wird, worauf der resultierende Kallidinogenase-Niederschlag an einem schwach basischen Anionenaustauscher-Celluloseharz oder an kreuzvernetztem Dextran («Sephadex») adsorbiert wird und abgetrennt wird (JA-AS 56889/73). Das andere Reinigungsverfahren basiert auf der Verwendung von Ionenaustauscherharzen und besteht zum Beispiel in einem Verfahren, bei welchem ein Protein-Fällungsmittel zu einem Extrakt des Drüsengewebes von Pankreas gegeben wird, wobei die erhaltene Kallidinogenase in den Mikroporen eines stark basischen Anionenaus-tauscherharzes adsorbiert wird und abgetrennt wird (JA-AS 103715/73).

Die erste der oben genannten Methoden, bei der ein Poly-saccarid verwendet wird, zeigt den Nachteil, dass die physikalische Festigkeit des Ionenaustauschermaterials nicht genügend ist und dass eine Kontamination durch Mikroorganismen auftreten kann, wodurch das ganze Verfahren für kommerzielle Anwendung nicht geeignet ist. Das zweite der oben genannten Verfahren andererseits weist keine der genannten Nachteile auf, ist jedoch ebenfalls unbefriedigend, vor allem in bezug auf die Elution des gewünschten Produkts und die Entfernung unerwünschter Kininase.

Es wurden extensive Studien durchgeführt, um ein Verfahren zur Extraktion und Gewinnung von Kallidinogenase zu finden, das die Nachteile der herkömmlichen Verfahren insbesondere auch bei der Reinigung des Kallidinogenaseextraktes, umgeht.

Es wurde gefunden, dass Kallidinogenase mit grösserer Wärmestabilität, Separabilität und Aktivität durch Extraktion von Pankreas von Säugetieren abgetrennt und gewonnen werden kann, wenn die Extraktion in Gegenwart eines wasserlöslichen Salzes von Magnesium, das ein Metall der dritten Periode

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der zweiten Hauptgruppe des periodischen Systems der Eie- salzes einer Säure extrahiert und die Extraktion bei einer Tem-mente ist, und einer Säure durchgeführt wird. Wir nachfolgend peratur von 45-60 °C und einem pH-Wert von 5-8 während durch vergleichende Versuche erläutert werden soll, wurde einer Dauer von 30 min bis 2 h durchgeführt. Wenn der gefunden, dass nach diesem Verfahren bessere Ergebnisse pH-Wert kleiner ist als 5 oder grösser als 8, neigt die Kallidino-

erzielt werden als bei der Verwendung der Alkalimetallsalze 5 genäse dazu, während der Extraktion deaktiviert zu werden, oder Ammoniumsalze wie oben angegeben und bei herkömmli- oder die Abtrennbarkeit des wässrigen Extraktes wird stark chem Vorgehen und dass die Verbesserungen, wie sie durch erschwert, was eine Reduktion in der Ausbeute von Kallidino-dieses Verfahren erzielt werden, nicht auftreten, wenn Salze genäse bewirkt, und ferner gestaltet sich die Abtrennoperation von Calcium, ein Metall der 4. Periode der II. Hauptgruppe des schwierig. Wenn die Extraktionstemperatur weniger als ca. periodischen Systems der Elemente oder von Aluminium, ein i o 45 °C beträgt, wird es schierig, den wässrigen Extrakt abzutren-Metall der III. Hauptgruppe des periodischen Systems der Eie- nen, und es werden lange Zeiten benötigt für die Separation, mente, verwendet werden. z. B. Stehenlassen des Systems. Dies bewirkt eine Deaktivie-

Ferner wurde gefunden, dass bei Verwendung eines gelför- rung der Kallidinogenase und damit eine verminderte Aus-migen schwachbasischen Anionenaustauscherharzes ein gros- beute. Andererseits besteht die Tendenz, dass bei Extraktions-serer Anteil der unerwünschten Kininase vollständig entfernt 15 temperaturen von über 60 °C die Kallidinogenase deaktiviert werden kann durch Auswaschen nach der Adsorption und dass wird und diese Tendenz vergrössert sich, falls nicht die Zeit-die adsorbierte Kallidinogenase mit guter Ausbeute durch dauer des Stehenlassens des Systems verkürzt wird. Diese ver nachfolgendes Eluieren gewonnen werden kann, wobei eben- kürzte Zeitdauer wiederum bewirkt eine ungenügende Separa-falls ein merklicher Zeitgewinn erzielt wird. Es wurde auch tion und damit eine Reduktion in der Ausbeute von Kallidino-

gefunden, dass dieser hohe Reinigungsgrad bei Verwendung 20 genäse.

eines gelförmigen starkbasischen Anionenaustauscherharzes Die Extraktion wird zweckmässig in Gegenwart eines was-

oder eines mikroporösen schwachbasischen Anionenaustau- serlöslichen Salzes von Magnesium mit einer Säure, das zum scherharzes nicht eintritt, sondern dass dies offenbar nur mit Extraktionsmedium gegeben wurde, durchgeführt. Dieses was-dem gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharz serlösliche Magnesiumsalz einer Säure kann z. B. ein Salz, gebil-erzielt werden kann. 25 det aus Magnesium und Säuren wie Mineralsäuren, Kohlen-

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge ein säure und Fettsäuren mit 1 -5 C-Atomen, sein. Spezifische Beiverbessertes Verfahren zur Reinigung der Kallidinogenase ent- spiele für wasserlösliche Magnesiumsalze sind Magnesiumcar-haltenden wässrigen Extrakte, wie sie aus Pankreas von Säuge- bonat, -chlorid, -nitrat, -sulfat, -formiat, -acetat, -propionat, -buty-tieren erhalten werden, wobei man ein gereinigtes Kallidinoge- rat, -lactat, -malat, -Oxalat, -succinat und Magnesiumvalerat. nase-Produkt erhält. Das erfindungsgemässe Reinigungsverfah- 30 Diese Extraktionsmethode liefert eine Kallidinogenase mit ren ist im Patentanspruch 1 definiert. sehr guter Wärmestabilität, Separabilität, geringer Trübung

Die Extraktion und Gewinnung von Kallidinogenase und hoher Kallidinogenase-Aktivität, verglichen mit Produk-

erfolgt zweckmässig, indem Pankreas von Säugetieren mit ten, wie sie bei Verwendung von Alkalimetallsalzen oder

Wasser in Gegenwart von Salzen bei einer Temperatur von Ammoniumsalzen oder auch von Calcium- oder Aluminiumsal-45-60 °C und einem pH-Wert von 5-8 extrahiert wird, wobei 35 zen erhalten werden. Diese Vorzüge können experimentell wie diese Extraktion in Gegenwart eines wasserlöslichen Salzes folgt demonstriert werden :

von Magnesium und einer Säure durchgeführt wird. Das experimentelle Vorgehen besteht darin, dass 500 ml

Wasser zu 100 g gehacktem rohem Pankreasgewebe vom Das verwendete Pankreasgewebe von Säugetieren kann Schwein (essentieller Pankreas-Gehalt: ca. 50%) gegeben wer-ein rohes gehacktes Präparat von Pankreas von Säugetieren, « den, worauf der pH-Wert des Gemisches auf 6 eingestellt wird wie Schweinen, Kühen, Pferden oder Walen, sein, und es kann und die Zugabe eines der in nachfolgender Tabelle I genannten ein durch Aceton behandeltes pulverförmiges Pankreaspro- Salze erfolgt, wonach das Gemisch während 1 h bei 55 °C ste-dukt oder ein wässriger Extrakt von Pankreas sein. Es ist nicht hen gelassen wird, um Extraktion der Kallidinogenase zu errei-notwendig, dass das rohe Pankreasgewebe vorgängig entfettet chen. Die Separabilität, Trübung und relative Kallidinogenase-wird; das in eine gewünschte Form zur erleichterten Extraktion45 Aktivität des Kallidinogenase-enthaltenden wässrigen Extrak-gebrachte Produkt kann direkt eingesetzt werden. tes und die Wärmestabilität der Kallidinogenase werden

Nach diesen Verfahren wird Pankreas von Säugetieren bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in unten stehender zweckmässig unter Zugabe eines wasserlöslichen Magnesium- Tabelle I aufgeführt.

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Tabelle 1

Salze

Konzentration der Salze (M)

Kallidinogenase enthaltender vässriger Extrakt

WärmeStabilität von Kallidinogenase (relative Restaktivität

Separabilität Oa)

Trübung (O.D. 660)

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Aktivität (*)

Keine Zugabe

57

3,1

60

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Arirnoniurchlorid.

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65

1,7

68

70

Natriumacetat

0,03

60

1,7

75

83

Natriumchlorid

0,03

72

1,7

88

86

Natriumchlorid

0,06

70

1,6

88

86

Natriumsulfat

0,03

60

1,7

70

75

Alurainiunacetat

0,03

75

1,7

20

35

Calciumacetat

0,03

72

1,7

66

83

Calciimdhlorid

0,03

75

1,7

70

85

Magriesiuncarbonat

0,03

81

1,3

90

93

Magnesiurrihlorid

0,03

82

1,2

92

93

Magnesi vmsulfat

0,03

84

1,2

98

97

Magnesiumacetat

0,03

85

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100

Magnesiunlactat

0,03

84

1,2

95

96

Magnesiuiprcpianat

0,03

83

1,2

97

98

Magnesiuributyrat

0,03

83

1,2

94

95

Magnesiumsuccinat

0,03

81

1,2

91

93

Die Wärmestabilität von Kallidinogenase ist diejenige von gereinigter Kallidinogenase, die bei 55 °C und einem pH-Wert von 6 während 60 min stehen gelassen wurde und ist ausgedrückt als relative Restaktivität (%) mit der Restaktivität von Kallidinogenase, die in Gegenwart von Magnesiumacetat erhalten wurde, als 100%.

Die Separabilität (%) bedeutet den prozentualen Anteil des Extraktes bezogen auf die totale Menge der behandelten Lösung. Die Trübung des Extraktes wurde bei 660 nm gemessen. Die Aktivität entspricht der BAEE (Benzol-arginin-äthyl-ester)-Zersetzungs-Aktivität des Extrakts, gemessen in Gegenwart von 0,02Gew.% eines Sojabohnen-Trypsin-Inhibitors. Die BAEE-Zersetzungs-Aktivität des Extraktes, wie er bei Anwendung von Magnesiumacetat erhalten wird, ist als 100% angenommen und der gemessene Einzelwert wird auf diese Basis bezogen. Eine BAEE-Einheit entspricht dem Anteil von Kallidinogenase, der benötigt wird, um ein n Mol von BAEE pro Minute abzubauen, wobei das System bei 37 °C inkubiert ist.

Der bei der Anwendung von Magnesiumacetat erhaltene Extrakt wird gut dialysiert. Die Kallidinogenase-Einheit(KU) des Dialysats, gemessen durch die Blutflussvergrösserungs-

Methode (s. Hiroshi Moriya, «Basic Lectures in the Development of Medicines», Band 5, Pharmacological Tests, S. 974, eine 5o japanische Publikation, 1971 durch Chijin Shokan Company, Tokyo) beträgt 75 000 pro Kg des rohen Pankreas.

Die Wirkung der verwendeten Salze bei der Extraktion von Kallidinogenase bei einem Pulver oder einem wässrigen Extrakt von Schweine-Pankreas war dieselbe wie sie bei der 55 Verwendung von rohem Pankreas wie oben beschrieben erreicht wurde.

Vorzugsweise beträgt der Anteil des wasserlöslichen Magnesiumsalzes mindestens 0,02 Mol und gebräuchlicherweise 0,02-1 Mol. Eine geeignete Konzentration kann in die-„o sem Bereich gewählt werden, je nach Typus des verwendeten Salzes. Das Salz kann auch in höheren Konzentrationen verwendet werden, jedoch konnte keine Vergrösserung der erwünschten Effekte damit erreicht werden. Wenn die Konzentration des Salzes weniger als ca. 0,02 Mol beträgt, wird die b3 Extraktionswirkung in bezug auf Kallidinogenase sehr schwach und ebenso wird die gewünschte Separabilität der Kallidinogenase enthaltenden wässrigen Phase von unerwünschten Komponenten schwach. Ferner führt es dazu, dass der Anteil der

gelösten Proteine in wässrigen Extrakt erhöht ist. Die Nachbehandlung des wässrigen Extraktes wird dadurch erschwert und die Ausbeute von Kallidinogenase wird dadurch erniedrigt.

Die Reinigung des wie beschrieben erhaltenen, Kallidinogenase enthaltenden wässrigen Extraktes erfolgt durch eine Adsorptions/Elutions-Behandlung, unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes nach dem im Patentanspruch 1 definierten erfindungsgemässen Verfahren.

Es wurde gefunden, dass bei vergleichsweiser Verwendung eines mikroporösen starkbasischen oder schwachbasischen Anionenaustauscherharzes die Elution der adsorbierten Kallidinogenase sehr langsam erfolgt, und dass für vollständige Elution und Separation eine grosse Menge von Lösungsmittel und eine lange Zeitdauer benötigt werden und ferner Verunreinigungen mit' der abgetrennten Kallidinogenase mitgeschleppt werden. Bei der erfindungsgemässen Verwendung des gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharzes jedoch kann die darauf adsorbierte Kallidinogenase unter Verwendung einer wässrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwachen Säure als Elutionsmittel leicht und rasch gewonnen und ohne Schwierigkeiten von allfälligen Verunreinigungen getrennt werden.

Die dem erfindungsgemässen Verfahren entsprechende Reinigungsmethode kann durchgeführt werden, indem der Kallidinogenase enthaltende wässrige Extrakt auf eine Säule mit dem gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharz gegeben wird, wodurch ein Kontakt zwischen wässrigen Extrakt und Ionenaustauscherharz bewirkt und die Kallidino-genase-Fraktion am Ionenaustauscherharz adsorbiert wird. Diese Adsorptionsoperation erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von mehr als ca. 4 aber weniger als ca. 8, im besonderen von 5-7 und speziell bevorzugt von 6± 0,5. Bei pH-Werten, die ausserhalb dem genannten Intervall liegen, wird die Kallidinogenase deaktiviert und bei einem pH-Wert von mehr als ca. 8 nimmt der Anteil der nicht-adsorbierten Kallidinogenase zu. Als Folge davon erhält man eine Abnahme in Ausbeute und Reinheit der Kallidinogenase.

Die auf dem gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharz adsorbierte Kallidinogenase wird unter Verwendung einer wässrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwache Säure, vorzugsweise bei einem pH von 6 bis 7,

eluiert. Die Temperatur, bei der die Adsorption und die nachfolgende Elution durchgeführt werden, kann irgendeine Temperatur sein, bei der die Kallidinogenase nicht zersetzt wird. Normalerweise werden diese Operationen bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das Salz kann aus dem Eluat durch Dialyse oder

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Ultrafiltration entfernt werden und das erhaltene Produkt kann bei einer Temperatur unterhalb der Zersetzungstemperatur der Kallidinogenase, normalerweise unterhalb 60 °C, getrocknet werden. Diese Trocknung kann z. B. durch Lyophilisation oder Sprühtrocknen erfolgen.

Das gelförmige schwachbasische Anionenaustauscherharz, das im beschriebenen Reinigungsverfahren eingesetzt wird, ist vorzugsweise ein Harz mit einer sekundären oder tertiären-Aminogruppe als Austauschergruppe, Beispiele dafür sind Divinylbenzol-acrylat-Harze («Diaion WA 10», «Diaion WA 11», von Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) und Styrol-divinylbenzol-Harze («Amberlite IR 45», «Amberlite IRA 47», «Amberlite IRX 68», von Rohm & Haas Co., USA).

Zur Demonstration der Wirkung der gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharze wurde das folgende Experiment unter Verwendung von «DIAION WA 10» als gelförmi-ges schwachbasisches Anionenaustauscherharz nach dem erfindungsgemässen Verfahren durchgeführt, und zum Vergleich wurden ein mikroporöses schwachbasisches Anionenaustauscherharz («DIAION WA 30» von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), ein gelförmiges starkbasisches Anionenaustauscherharz («DIAION SA 21 A» von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) und ein makroporöses starkbasisches Anionenaustauscherharz («DIAION HPA 10» von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) verwendet.

Das experimentelle Vorgehen bestand darin, dass 300 ml eines Extraktes des rohen Schweine-Pankreas (3 BAEE-Einhei-ten/ml von Kallidinogenase) auf eine Säule (3 x 25 cm), die je mit einem der oben genannten Ionenaustauscherharze gefüllt war, gegeben wurde, worauf das Harz mit einer 0,2M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0) gewaschen wurde. Anschliessend erfolgte die Elution des Extrakes unter Verwendung einer 0,4M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0) bei einer Durchflussrate von 50 ml/h, wobei das Eluat in Fraktionen von je 19 ml aufgefangen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle 2 aufgeführt.

Die in Tabelle 2 aufgeführten Kallidinogenase-Einheiten entsprechend BAEE-Einheiten.

Die Carboxypeptidase (CPase) ist in HPLA-Einheiten ausgedrückt. Eine HPLA-Einheit entspricht dem Anteil von CPase, die benötigt wird um ein n. Mol von Hippuryl-L-ß-phenyl-lactat pro Minute zu zersetzen.

Die Messung der HPLA-Zersetzungsaktivität wird für das vorliegende Verfahren als Methode zum Nachweis einer Kini-nase-Fraktion in der Chromatographie verwendet.

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Die in Klammern angegebenen Zahlen bedeuten gewichts-mässig die prozentualen Anteile des eluierten Enzyms, bezogen auf den Anteil des Enzyms, der auf dem Ionenaustauscherharz adsorbiert ist

Die biologische Aktivität der Kallidinogenase in denjenigen eluierten Fraktionen, die eine BAEE-Zersetzungsaktivität zeigen, wurden durch die Methode des erhöhten Blutflusses bestimmt und die biologische Aktivität der Kininase in denjenigen eluierten Fraktionen, die eine HPLA-Zersetzungsaktivität aufwiesen, wurden durch eine Methode der Schrumpfung des b5 glatten Uterusmuskels der Ratte bestimmt (s. Hiroshi Moriya, «Basic Lectures in the Development of Medicines», Band 5, Pharmacological Test Methods, S. 974, eine japanische Publikation von Chijin Shokan Company, Tokyo, in 1971).

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Aus den in Tabelle 2 gegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Reinigungsmethode entsprechend dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung eines gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharzes, ca. 99% der Kallidinogenase eluiert und im ersten Anteil von 304 ml isoliert werden können und dass die Elution und Gewinnung viel besser war als bei vergleichsweiser Verwendung des gelförmigen starkbasischen Anionenaustauscherharzes, des makroporösen starkbasischen Anionenaustauscherharzes oder des makroporösen schwachbasischen Anionenaustauscherharzes. Die Ergebnisse zeigen auch, dass der Anteil von CPase, einer unerwünschten Verunreinigung beim Durchführen des erfindungsgemässen Verfahrens viel kleiner ist als bei den Vergleichsversuchen; bei der Auswaschung des Harzes vorgängig der Elution kann der grösste Teil (98%) der adsorbierten CPase entfernt werden. Nahezu der ganze Anteil (98%) der Kallidinogenase kann eluiert und in einem frühen Stadium der Elution gewonnen werden und der Anteil von CPase ist sehr klein (0,6%) und schliesslich ist die Qualität der gereinigten Kallidinogenase wie sie nach einem Zyklus der Adsorptions-Elutions-Operation erhalten wird, sehr gut.

Die folgenden Methoden und Beispiele sollen das erfin-dungsgemässe Verfahren näher erläutern. Darin betrug die essentiellen Pankreas-Gehalte ca. 50 Gew.%, bezogen auf den verwendeten Pankreas. Der Pankreas wurde ohne vorgängiges Entfetten verwendet.

Die Kininase-Aktivität ist in Kininase-Einheiten ausgedrückt. Eine Kininase-Einheit ist der Anteil von Kininase, der benötigt wird, um 1 ng Bradykinin pro Minute freizusetzen.

Methode A

500 g roher Schweine-Pankreas wurde gehackt und 2000 ml Wasser zugegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,0 eingestellt, worauf 12 g (Konzentration 0,05 M) Magnesiumsulfat zum Gemisch gegeben wurden, worauf dieses gut durchgemischt wurde. Das Gemisch wurde bei ca. 50 °C während 1,5 h stehen gelassen, die Extrakte wurden aus der Unterschicht abgetrennt, und Kallidinogenase wurde in einem Anteil, entsprechend 36,000 Kallidinogenase-Einheiten (KU) gewonnen.

Methode B

500 g roher Schweine-Pankreas wurden gehackt und 2000 ml Wasser zugegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,0 eingestellt, worauf 13 g (Konzentration 0,03 M) Magnesiumacetat zugegeben wurden und gut durchmischt wurde. Das Gemisch wurde bei ca. 55 °C während 1 h stehen gelassen. Die in einer unteren Schicht vorliegenden Extrakte wurden abgetrennt und ergaben Kallidinogenase in einem Anteil entsprechend 37,000 KU.

Methode C

100 g eines mit Aceton getrockneten Pulvers von Schweine-Pankreas wurden mit 3000 ml Wasser gemischt, und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6 eingestellt. 16 g (Konzentration 0,025 M) Magnesiumacetat wurden zugegeben, und das Ganze wurde gut durchmischt. Das Gemisch wurde anschliessend bei ca. 50 °C während 1,5 h stehen gelassen, worauf die Extrakte in einer unteren Schicht abgetrennt wurden. Man erhielt Kallidinogenase in einem Anteil entsprechend 73.000 KU.

Methode D

3000 ml Wasser wurden zu 100 g eines wässrigen Extrakts von Schweine-Pankreas gegeben und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6 eingestellt. 18 g (Konzentration 0,05 M) Magnesiumsulfat wurden zum Gemisch gegeben, und das Ganze wurde gut durchmischt. Das Gemisch wurde bei ca. 47 °C während 2 h stehen gelassen, worauf die Extrakte in einer unteren Schicht abgetrennt wurden. Man erhielt Kallidinogenase in einem Anteil, entsprechend 72.000 KU.

Beispiel 1

300 g roher Schweine-Pankreas wurde gehackt und 900 ml Wasser wurden zugegeben, und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 6 eingestellt. 6,25 g (Konzentration 0,03 M) Magnesiumacetat wurden zum Gemisch gegeben und das Ganze gut durchmischt. Anschliessend wurde bei ca. 50 °C während 1,5 h stehen gelassen. Anschliessend wurden bei Zimmertemperatur die gebildete Fettschicht an der Oberfläche entfernt und die untere Schicht zentrifugiert, wobei man 800 ml Extrakt erhielt. Dieser Extrakt wurde auf eine Säule (3 x 25 cm) eines gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharzes («DIAION WA 10») gepuffert mit einer 0,15M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0), gegeben und nach Auswaschen des Harzes mit einer 0,2M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0) wurde der Extrakt mit einer 0,4M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0) eluiert.

Das Salz wurde aus dem Eluat entfernt und die zurückbleibende Kallidinogenase-Fraktion wurde lyophilisiert, wobei man 148 mg (117,7 KU/mg) Kallidinogenase erhielt. Die Kininase-Einheit dieses Produkts pro Kallidinogenase-Einheit (KU) betrug nur 0,5.

Beispiel 2

30 g eines mit Aceton getrockneten Pulvers von Pankreas wurden mit der 20fachen Menge Wasser gemischt, worauf der pH-Wert des Gemisches auf 6 eingestellt wurde. 3,2 g (Konzentration 0,05 M) Magnesiumsulfat wurden zugegeben, und das Ganze wurde gut durchmischt. Daraufhin wurde bei ca. 45 °C während 2 h stehen gelassen. Anschliessend wurden bei Zimmertemperatur die an der Oberfläche befindlichen Feststoffe, wie unlösliche Proteine, abgetrennt. Die untere Schicht wurde zentrifugiert, wobei man 550 ml eines Extrakts erhielt. Dieser Extrakt wurde auf eine Säule (3 x 25 cm) eines gelförmigen schwachbasischen Anionenaustauscherharzes («Amberlite IRX-68») gepuffert mit einer 0,15M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0), gegeben und nach Waschen des Harzes mit einer 0,2M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0) wurde der Extrakt mit einer 0,4M-Lösung von Ammoniumacetat (pH-Wert 6,0) eluiert.

Das Salz wurde aus dem Eluat entfernt und die resultierende Kallidinogenase-Fraktion wurde lyophilisiert, wobei man 156 g (142,3 KU/mg) von Kallidinogenase erhielt. Die Kininase-Einheit dieses Produkts pro Kallidinogenase-Einheit (KU)

betrug nur 1.

Beipiel 3

Die in den Methoden A und B erhaltenen Extrakte wurden wie in Beispiel 1 beschrieben eluiert und getrocknet, wobei man 257 mg bzw. 241 mg Kallidinogenase erhielt, die Kallidino-genase-Aktivität betrugen 108.3 KU/mg bzw. 126.2 KU/mg.

Beispiel 4

Der in Methode C erhaltene Extrakt wurde wie in Beispiel 2 beschrieben eluiert und getrocknet, wobei man 355 mg Kallidinogenase erhielt. Die Kallidinogenase-Aktivität dieses Produkts betrug 98,5 KU/mg.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Reinigung von Kallidinogenase, wobei der durch Extraktion von Pankreas von Säugetieren erhaltene, Kallidinogenase enthaltende wässrige Extrakt einer Adsorptions/ Elutions-Behandlung unter Verwendung eines Anionenaustau- 5 scherharzes unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, dass man den wässrigen, Kallidinogenase enthaltenden Extrakt mit einem gelförmigen, schwachbasischen Anionenaustauscher-harz in Kontakt bringt, so dass die Kallidinogenasefraktion am genannten Harz adsorbiert wird, und dass man die reine Kalli- 10 dinogenase durch Elution mit einer wässrigen Lösung eines Ammoniumsalzes einer schwachen Säure gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man für die Elution ein Ammoniumsalz einer schwachen anorganischen Säure oder einer Fettsäure mit 1 -5 C-Atomen 15 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Ammoniumcarbonat, -bicarbonat, - borat, mono- oder dibasisches Ammoniumphosphat, Ammoniumphosphit, -hypo-phosphit, -formiat, -acetat, -bimalat, -citrat, -lactat, -Oxalat, -suc- 20 cinat, -tartrat oder -valerat verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man einen Extrakt verwendet, der durch Extraktion von Pankreas von Säugetieren mit Wasser bei einer Temperatur von 45-60 °C und einem pH-Wert von 5-8 in Gegenwart eines 25 wasserlöslichen Magnesiumsalzes einer Säure erhalten wurde.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

dass die Extraktion in Gegenwart eines Magnesiumsalzes einer Mineralsäure oder einer Fettsäure mit 1-5 C-Atomen erfolgte.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, » dass die Konzentration des Magnesiumsalzes 0,02-1 mol pro Liter Wasser betrug.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

dass die Extraktion in Gegenwart von Magnesiumcarbonat, -chlorid, -nitrat, -sulfat, -formiat, -acetat, -propionat, -butyrat, 35 -lactat, -maleat, -Oxalat, -succinat oder -valerat erfolgte.

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