DE2406971B2 - Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors

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    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
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Description

Die Erfindung betrifft die Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors aus tierischen Organen.
Der aus tierischen Organen gewonnene basische, polyvalente Proteinasen-Inhibitor hat eine hervorragende Bedeutung in der Therapie aufgrund seiner Eigenschaft, Trypsin, Chymotrypsin, die Kallikreine aus Plasma, Organen und Urin, ferner Plasmin zu hemmen.
Seit der Entdeckung dieses Inhibitors sind eine große Anzahl von Verfahren zu seiner Isolierung bekanntgeworden. Nach der Extraktion der Organe wird der Inhibitor aus dem Extrakt durch Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln wie Alkohol der Aceton;
mit Hilfe verschiedener Eiweißfällungsmitte! wie
Sulfosalizylsäure, Thiosalizylsäure, Trichloressigsäure, Metaphosphorsäure oder verschiedener Salze; durch spezifische Adsorption oder durch chromatographische Methoden gewonnen. Die meisten dieser Verfahren sind jedoch für technische Maßstäbe wenig geeignet, wenn gleichzeitig die Forderung nach guter Ausbeute und der Einfachheit der Durchführung erhoben wird.
Ein Verfahren, das diese beiden Bedingungen im wesentlichen erfüllt, beinhaltet die Adsorption des Proteinasen-Inhibitors aus dem Organextrakt an Carboxymethylcellulose. Der Verfahrensschritt der Adsorption an die Carboxymethylcellulose erfordert aber eine niedrige Ionenstärke der Lösung, die nur durch starkes Verdünnen des Organextraktes erreicht werden kann. Neben diesem Nachteil des Arbeitens mit großen Volumina und der großen Menge des einzusetzenden Ionenaustauschers stellt die Filtrierbarkeit der stark quellenden Carboxymethylcellulose ein technisch schwieriges Problem dar, das sich insbesondere bei der Regeneration, die im alkalischen pH-Bereich durchzuführen ist, schwerwiegend auswirkt Aufgrund der bekannten basischen Eigenschaft des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors sollte es naheliegend sein, statt Carboxymethylcellulose andere saure Ionenaustauscher, die in Harzform vorliegen und die die skizzierten Nachteile der Carboxymethylcellulose nicht zeigen, für die Gewinnung dieser Substanz einzusetzen. Die in der Literatur hierfür aufgezeichneten Wege erwiesen sich jedoch als sehr unbefriedigend. Beispiele für solche Verfahren sind in der deutschen Offenlegungsschrift 18 03 547 und in J. B'iol. Chem. 238,3274 (1963) zu finden.
Für die Adsorption des Inhibitors wird eine große
Menge an Austauschharz benötigt, bei relativ schlechten Ausbeuten und nicht immer befriedigender Reinheit des Produkis, oder es wird mit einem erheblichen Fraktionierungsaufwand, der sich im technischen Maßstab nicht vertreten ließe, ohne Rücksicht auf die Ausbeute ein sehr reines Produkt hergestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren hat diese Nachteile nicht. Es wurde nun gefunden, daß diejenigen Kationenaustauscher, die als funktioneile Gruppen Sulfonsäure- oder Phosphonsäurereste tragen, sich für die Isolierung des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors besonders eignen.
Vorteilhaft läßt sich als Adsorbens ein Äthensulfonat/ Acrylamid-Copolymergel verwenden. Das Gel ist ein nach grundsätzlich bekannten Verfahren gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung herzustellendes Copolymerisat aus Äthensulfonsäure und Acrylamid (im Gewichtsverhältnis von etwa 20 :1 bis 2 :1, vorzugsweise 8 : 1 bis 3 :1), das mit 1 — 15% Formaldehyd vernetzt wird. Eine geeignete Korngröße für die Adsorption des Proteinasen-Inhibitors beträgt 0,06 bis 3 mm.
Für das erfindungsgemäße Verfahren haben sich weiterhin als gut geeignet herausgestellt die handelsüblichen Polyphenol-w-Sulfonsäure-Ionenaustauscher, ferner Polystyrol-Sulfonsäure-Harze, insbesondere solche, deren Kapazität durch makroporöse Struktur erhöht ist, oder Polystyrol-Phosphonsäure-Harze. Als
to besonders günstig hat sich eine Korngröße dieser Ionenaustauscher von etwa 0,03 bis 0,08 mm erwiesen.. Gegenüber Carboxymethylcellulose zeichnen sich die erfindungsgemäßen Austauschertypen durch eine wesentlich höhere adsorptive Kapazität aus.
Ferner läßt sich die Filtrationsgeschwindigkeit gegenüber Carboxymethylcellulose sowohl zur Abtrennung von nicht adsorbiertem Material als auch bei der Elution des Inhibitors von den erfindungsgmäß zu
verwendenden Harzen wesentlich erhöhen. Die angeführten ionenaustauscher lassen sich nach der Elution des Inhibitors leicht regenerieren, da die Durchlaufgeschwindigkeit von Lösungen auch im alkalischen Bereich nicht verschlechtert wird. Die Austauscher lassen sich mehrfach zur Gewinnung des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors einsetzen. Dies kann sowohl iin batch- als auch im Säulenverfahren erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteiraisen-lnhibitors aus dessen wäßrigen Lösungen, vorzugsweise aus wäßrigem Extrakt von tierischen Organen, vorzugsweise Rinderlunge, durch Adsorption des Inhibitors an ein Ionenaustauscherharz mit funktiondien Sulfonsäuregruppen oder Phosphonsäuregruppeia bei pH-Werten von 0,5 bis 10,5, vorzugsweise pH-Weiten von 7,5 bis 9,5, Abtrennung des Adsorbens und anschließender Elution mit wäßrigen Salzlösungen bei pH-Werten von 1 bis 13, vorzugsweise pH-Werten von 10 bis 12,5, wobei in der Nähe von pH 12,5 ein Salzzusatz unterbleiben kann, während mit fallendem pH-Wert zur Erhöhung des Elutionsvermögens steigende Mengen Salz zugesetzt werden. Bei Verwendung des Äthensulfonat/Acrylamid-Copolymergels wird beispielsweise bei einem pH-Wert von 3 dem Elutionsmedium etwa 10% Kochsalz zugesetzt Bei Verwendung der PolyphenoI-w-Sulfonsäure-Ionenaustauscher, der Polystyrol-Sulfonsäure-Harze und der Polystyrol-Phosphonsäure-Harze wird beispielsweise bei pH 7,0 die Elution unter Zusatz von etwa 20% Kochsalz oder solchen Mengen eines anderen Salzes, die ein vergleichbares Elutionsvermögen besitzen, durchgeführt. Bei diesen Austauschertypen ist zu berücksichtigen, daß infolge der zur Elution erforderlichen höheren Salzkonzentrationen bei Elutionen unterhalb vom pH-Wert 5 Ausfällungen des Inhibitors auftreten können, die durch ein erhöhtes Elutionsvolumen kompensiert werden müssen, um Ausbeuteverluste möglichst niedrig zu halten.
Das Verfahren ist zur Isolierung des Proteinasen-In hibitors einzusetzen, wobei es sich als zweckmäßig erwiesen hat, als Ausgangsmaterial für die Adsorption des Proteinasen-Inhibitors vorteilhaft einen vorgereinigten tierischen Organextrakt zu verwenden.
Zur Bestimmung des erfindungsgemäß erhaltenen Proteinasen-Inhibitors kann die Hemmung des Plasmins mit Casein als Substrat eingesetzt werden. Hierbei wird festgestellt, inwieweit die Enzymaktivität eines Plasmins, bestimmt nach der Methode von L. F. Remmert und P. P.Cohen, J. Biol.Chem. 181,431 (1949),durch eine zugesetzte Inhibitormenge herabgesetzt wird. Die Hemmung einer Piasmineinheit wird als eine Antiplasmineinheit definiert. Für die spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen Proteinasen-Inhibitors werden die Antiplasmineinheiten (APE)/ml auf einen bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessenen Extinktionswert der Lösung des Inhibitors von 1,0 bezogen. Hiernach, und bezogen auf ΑΡΕ/mg Stickstoff wird gemäß dem vorliegenden Verfahren ein iieinigungsfkator von 20 bis 35 erreicht.
Das erfindungsgemäß erhaltene Eluat kann beispielsweise durch Gelchromatographie weiter gereinigt werden, wodruch der Inhibitor in hoher Reinheit mit guter Ausbeute erhalten werden kann. Danach kann ein Inhibitor von etwa 170 APE/ml bei E280 = l.Ogewonnen werden. Diese Reinheit des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors erlaubt dessen therapeutische Anwendung bei Menschen.
Die Erfindung soll an nachstehenden Beispielen erläutert werden.
Beispiel 1
A. Herstellung eines Copolymerisates aus
Äthensulfonat und Acrylamid
85GT (Gewichtsteile) einer 25%igen wäßrigen
Lösung des N Α-Salzes von Äthensulfonsäure werden mit 40%iger H2SO4 auf pH 63
gestellt Man löst darin
53GT Acrylamid und erwärmt auf 450C Die
Polymerisation wird durch Zugabe von
0,425 GT Ammoniumperoxidisulfatund
0,085GT Natriumdisulfit gestartet Der Ansatz erwärmt sich auf 98° C Zur Vervollständigung der Polymerisation werden
0,0425 GT Ammoniumperoxidisulfat und
0,0085 GT Natriumdisulfit zugegeben, 2 Std. bei 85° C nachgerührt und dann abgekühlt
B. Vernetzung mit Formaldehyd und
thermische Nachbehandlung
13,6GT 28%ige Formaldehyd-Lösung wird zu der Copolymerlösung gegeben und bei 25°C 15
Std. stehengelassen. Das erhaltene gel trocknet man bei 8O0C im Vakuum und erhitzt zuletzt das trockene Produkt 30 Minuten auf 1500C Es wird gemahlen und jo klassiert Besonders geeignet für die Gewinnung des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors ist die Fraktion mit der Korngröße 0,06—0,3 mm. Vor der Verwendung wird das vernetzte Produkt durch Waschen mit J5 entsalztem Wasser gequollen und von
wasserlöslichen Nebenprodukten befreit.
Beispiel 2
Zu 16501 eines Lungengewebe-Rohextraktes, der 12 χ 106 Antiplasmineinheiten enthält, werden 33 kg des feuchten Äthensulfonat/Acrylamid-Copolymergels (hergestellt gemäß Beispiel 1) zugefügt. Man läßt die Mischung 30 Min. rühren und anschließend 30 Min. zur Sedimentation des Adsorbens ruhig stehen. Danach können 12501 des Überstandes abgehebert werden. Zur Entfernung der restlichen überstehenden Lösung wird das Adsorbens abfiltriert. Die Elution des Proteinasen-Inhibitors erfolgt mit 120 1 entionisiertem Wasser, wobei der pH-Wert der Suspension mit konzentrierter Natronlauge auf pH 12,5 eingestellt wird. Das Eluat enthält 95% der im Extrakt vorhandenen Inhibitormenge mit einer Reinheit von 60 ΑΡΕ/ml bei E2so = 1,0.
Das auf die vorher beschriebene Weise gewonnene Eluat kann vorteilhaft durch Gelchromatographie, beispielsweise über Sephadex (*) G-50 (Deutsche Pharmacia, Frankfurt/M.), von höhermolekularen Verunreinigungen befreit werden. Dabei erhält man die Wirksubstanz in einer Reinheit von 140—200 APE/ml
bo bei E280 = 1,0 in einer Ausbeute von über 50% bezogen auf den Rohextrakt.
Falls gewünscht oder erforderlich läßt sich der so erhaltene Proteinasen-Inhibitor einem Verfahren der Pyrogen-Entfernung unterwerfen, auf eine therapeu-
b5 tisch übliche Konzentration von 250 ΑΡΕ/ml einstellen, steril filtrieren und in Ampullen abfüllen.
Der Proteinasen-Inhibitor ist in dieser Form parenteral, insbesondere intravenös applizierbar.
Γ 5 24 Menge % Wasser
pH 12,5 		NaCl 10% pH 8,5 100 06 971 5 Ausbeute 15 6 pH pH
4,5 8,5 		werden unterschiedliche )ei EIuL zeigt beispielhaft einige
Ausbeute % Ausbeute % 98 Mengen verschiedener Ionenaustauscher zugesetzt und
Bei Vanation der Adsorptions- und Elutionsbedingun 72 Adsorption *) 5% NaCl
OO 0/ 		% 91 % 99 %*) 20 im wesentlichen gemäß Beispiel 2 aulgearbeitet Die Proteinasen-Inhibitor
gen werden die folgenden Ergebnisse erhalten 100 100 83 pH-Werten bei pH 84 und Elution bei verschiedenen folgende Zusammenstellung Aus- Reinh.
100 91 72 5%igen Koc unter Verwendung einer 10%igen bzw. der durchgeführten Versuche: Wasser beut«: APE/ml
100 93 77 fi3al7loQiiniy Reaktionsbedingungen 10 %NaCl % bei
Adsorption Elution 100 88 64 IliMlf.lUjUIig Menge Ads. I pH 3,0 ^280 = I
pH 94 96 71 pH Wasser 92 60
93 96 85 pH pH
1,0 3,0 		3 bis 11 pH 12,5
93 64 52 Wasser
04 93 64 7 66 % 73 Zu jeweils 5 1 eines Lungengewebe-Rohextraktes, der 20 8,5 10 % NaCI 81 70
i U 89 90 1 etwa 6 ΑΡΕ/ml enthält, pH 4,5
I 2'5 89 66 1 Wasser 82 71
i 3,5 52 18 20 8,5 pH 12,5
C t 4'5 15 4 funktionelle Gruppe Wasser
i 5'5 1 1 20 8,5 10 % NaCl 92 10
I 6'5 Ionenaustauscher Beispiele pH 4,5
Bezeichnung Wasser 85 13
I 8'5 Sulfonsäure 20 4,5 pH 12,5
1 9'5 Wasser
E 104 20 4,5 20 % NaCI 90 53
S 114 Copolymergel Sulfonsäure pH 7,0
': 12,0 nach Beispiel 1 Wasser 65 52
Beispiel Sulfonsäure 2 8,5 pH 12,5
Copolymergel Wasser
nach Beispiel 1 2 8,5 pH 12,5 94 32
Copolymergel Sulfonsäure
nach Beispiel 1 75 53
3 Sulfonsäure 4 8,5
Copolymergel
nach Beispiel 1 6 8,5
Copolymergel Sulfonsäure
nach Beispiel 1
5 Sulfonsäure
Bio-Rex®40*)
6 Bio-Rex®40*) Sulfonsäure
7 Phosphonsäure
AG® MP-50*)
, California, USA.
8 Bio-Rex®63*)
9 *) Bio-Rad Laboratories, Richmonc
10
U

Claims (10)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors aus tierischen Organen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Inhibitor aus dessen wäßrigen Lösungen durch Adsorption an einen Ionenaustauscher mit funktioneilen Sulfonat- oder Phosphonatgruppen bei pH 0,5 bis 10,5 adsorbiert und mit Wasser oder einer Salzlösung bei pH 1 bis 13 eluiert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbens ein Äthensulfonat/Acrylamid-Copolymergel verwendet wird.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Adsorption ein Gel, hergestellt durch Copolymerisation aus Äthensulfonsäure und Acrylamid im Gewichtsverhältnis von 20 :1 bis 2 :1 und anschließende Vernetzung mit 1 — 15% Formaldehyd, verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbens ein Polyphenol-to-Sulfonsäure-Ionenaustauscher verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbens ein Polystyrol-Sulfonsäure-Ionenaustauscher, vorteilhaft mit makroporöser Struktur, verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbens ein Polystyrol-Phosphonsäure-Ionenaustauscher verwendet wird.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution bei etwa pH 12,5 mit Wasser ohne Zusatz von Salzen durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Elutionslösung bei fallendem pH-Wert steigende Mengen Salze enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung des Äthensulfonat/ Acrylamid-Copolymergels nach Anspruch 3 die Elution des Proteinasen-Inhibitors mit einer 10%igen Kochsalzlösung bei pH 3,0 vorgenommen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung von Polyphenol-ω-Sulfonsäure-Ionenaustauschern, von Polystyrol-Sulfonsäure-Harzen oder Polystyrol-Phosphonsäure-Harzen die Elution des Proteinasen-Inhibitors mit einer 20°/oigen Kochsalzlösung bei pH 7,0 vorgenommen wird.
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