DK145468B - Fremgangsmaade til udvinding af en polyvalent proteinaseinhibitor fra dyriske organer - Google Patents

Description

,· ....- ·, ' ψ, ( Φ) (19) DANMARK \£Β/ |j| (12) FREMUEGGELSESSKRiFT αυ 11*5468 Β

DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 521/75 ®1) IntCI.* C 07 G 7/00 (22) Indleveringsdag 15· feb. 1975 (24) Løbedag 15· feb. 1975 (41) Aim. tilgængelig 15. aug. 1975 (44) Fremlagt 22. nov. 1982 (86) International ansøgning nr. -(86) International Indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 14. feb. 1974, 2406971, DE

(71) Ansøger BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSGRAFT, Marburg/Lahn, DE.

(72) Opfinder Oswald Zwiesler, DE: Gerhard Guthoehrleln, DE: Hane-Heir*» rich Nau, DE: Helmut Rinno, DE.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til udvinding af en polyvalent proteinaeeinhi= bitor fra dyriske organer.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af en polyvalent proteinaseinhibitor fra dyriske organer, ved at man adsorberer inhibitoren fra dens vandige opløsninger på en ioribytter.

Den fra dyriske organer udvundne basiske, polyvalente prote— · inaseinhibitor har en væsentlig betydning inden for terapien på g grund af den egenskab, at den hæmmer trypsin, chymotrypsin, kalli- 0 kreinerne fra plasma, organer og urin samt endvidere plasmin.

0 Siden opdagelsen af denne inhibitor er et stort antal frem- f) gangsmåder til dens isolering blevet kendt. Efter ekstraktionen £ af organerne udvindes inhibitoren fra ekstrakten ved fraktionering med organiske opløsningsmidler, såsom alkohol eller acetone, ved j· hjælp af forskellige proteinfældningsmidler, såsom sulfosallcylsyre, thiosalicylsyre, trichloreddikesyre, metaphosphorsyre eller for- 2 145468 skellige salte, ved specifik adsorption eller ved chromatografiske metoder. De fleste af disse fremgangsmåder er imidlertid lidet egnede til teknisk målestok, når man samtidig stiller krav om godt udbytte og simpel gennemførelse.

En fremgangsmåde, der praktisk taget opfylder disse to betingelser, indebærer adsorption af proteinaseinhibitoren fra organekstrakten på carboxymethylcellulose. Fremgangsmådetrinet med adsorption på carboxymethylcellulose kræver imidlertid en lav ionstyrke i opløsningen, som kun kan opnås ved stærk fortynding af organekstrakten. Foruden denne ulempe ved at arbejde med store voluminer og med den store mængde af den ionbytter, der skal anvendes, udgør den stærkt kvældende carboxymethylcelluloses filtrerbarhed et teknisk vanskeligt problem, der især virker tungtvejende ved den regenerering, der skal gennemføres i det alkaliske pH-værdiom-råde. På grund af den polyvalente proteinaseinhibitors kendte basiske egenskab burde det være nærliggende at anvende andre sure ionbyttere, der foreligger i harpiksform, og som ikke viser de skitserede ulemper ved carboxymethylcellulose, i stedet for carboxymethylcellulose til udvindingen af dette stof. De metoder, der er beskrevet i litteraturen til dette formål, har imidlertid vist sig at være særdeles utilfredsstillende. Til adsorptionen af inhibitoren kræves en stor mængde ionbytterharpiks med relativ ringe udbytter og ikke altid tilfredsstillende renhed af produktet til følge, eller også fremstilles et særdeles rent produkt uden hensyn til udbyttet med en væsentlig fraktioneringsindsats, der ikke ville kunne forsvares i en teknisk målestok.

Disse ulemper er også knyttet til den i DE-offentliggø-relsesskrift nr. 2.120.038 beskrevne fremgangsmåde, ifølge hvilken inhibitoren adsorberes på en amfoter ionbytter på polystyrenbasis, f.eks. aminoeddikesyre- eller iminoeddikesyregruppe-holdige ionbyttere. Imidlertid kan det ikke udelukkes, at de pågældende ionbyttere er anvendelige, netop fordi de har amfoter karakter, og man kan altså ikke umiddelbart slutte, hvorledes deres virkning ville være, hvis de indeholdt andre grupper af ikke--amfoter karakter.

U5468

Det har nu vist sig, at de kationbyttere, der som funktionelle grupper bærer sulfonsyre- eller phosphongyregrupper, er særlig egnede til isoleringen af den polyvalente proteinaseinhibitor, fordi de ikke medfører de ovenfor omtalte ulemper.

I overensstemmelse hermed er den her omhandlede fremgangsmåde ejendommelig ved, at man adsorberer på en kationbytter med funktionelle sulfonat- eller phosphonatgrupper ved en pH-værdi på fra 0,5 til 10,5 og eluerer med vand eller en saltopløsning ved en pH-værdi på fra 1 til 13.

Særlig gode resultater opnås ifølge opfindelsen, når man som adsorbent anvender en ethensulfonat/acrylamid-copolymergel, specielt et copolymerisat ud fra ethensulfonsyre og acrylamid (J, et vægtforhold på fra ca. 20:1 til 2:1, fortrinsvis 8:1 - 3:1), der tværbindes med 1-15% formaldehyd, hvilket copolymerisat skal fremstilles ved i princippet kendte fremgangsmåder ifølge eksempel 1 i den foreliggende ansøgning. En egnet kornstørrelse til adsorpti- . onen af proteinaseinhibitoren andrager frå 0,06 til 3 nm.

Specielt velegnet ifølge opfindelsen er endvidere de handelsgængse polyphenol-U/-sulfonsyre-ionbyttere, endvidere polystyren--sulfonsyre-harpikser, specielt hvis dens kapacitet er forhøjet på grund af makroporøs struktur, eller polystyren-phosphonsyre-harpik-ser. En kornstørrelse af disse ionbyttere på fra ca. 0,03 til 0,08 mm har vist sig særlig gunstig.

Over for carboxymethylcellulose udmærker de her omhandlede ionbyttertyper sig ved en væsentlig højere adsorptionskapacitet.

Endvidere kan filtreringshastigheden forøges væsentligt i forhold til carboxymethylcellulose, både til fraskillelse af ikke adsorberet materiale og ved eluering af inhibitoren ffa de harpikser, der skal anvendes ifølge opfindelsen. De angivne ionbyttere kan let regenereres efter elueringen af inhibitoren, fordi gennemløbshastigheden af opløsningerne ikke forringes, end ikke i det alkaliske område. Ionbytterne kan anvendes flere gange til udvinding af den polyvalente proteinaseinhibitor. Dette kan ske ske ved såvel charge- som søjlefremgangsmåden.

145468 4

Den her omhandlede fremgangsmåde til udvinding af en polyvalent proteinaseinhibitor finder fortrinsvis anvendelse på en vandig ekstrakt af dyriske organer, fortrinsvis okselunger, ved adsorption af inhibitoren på en ionbytterharpiks med funktionelle sulfonsyre-grupper eller phosphonsyregrupper ved pH-værdier på fra 0,5 til 10,5, fortrinsvis pH-værdier på fra 7,5 til 9,5, fraskillelse af adsorben-ten og påfølgende eluering med vandige saltopløsninger ved pH-værdier på fra 1 til 13, fortrinsvis pH-værdier på fra 10 til 12,5, idet det er en yderligere fordel, at en salttilsætning kan udelades ved en pH-værdi i nærheden af 12,5, og at stigende mængder salt kan tilsættes ved faldende pH-værdi til forhøjelse af elueringsevnen. Elueringen kan således i hvert enkelt tilfælde gennemføres ved den specielt ønskede pH-værdi. Ved anvendelse af ethensulfonat/acry1-amid-copolymergelen kan ca. 10% kogsalt tilsættes elueringsme-diet ved en pH-værdi på 3. Ved anvendelse af polyphenol-u?-sulfon-syre-ionbytterne, polystyren-sulfonsyre-harpikserne og polystyren--phosphonsyre-harpikserne kan elueringen gennemføres under tilsætning af ca. 20% kogsalt eller sådanne mængder af et andet salt, som har en sammenlignelig elueringsevne, ved en pH-værdi på 7,0. Ved disse byttertyper skal man tage hensyn til, at der som følge af de til elueringen nødvendige højere saltkoncentrationer kan optræde udfældninger af inhibitoren ved elueringer ved en pH-værdi på under 5, hvilke udfældninger skal udlignes ved hjælp af et forhøjet eluerings-volumen, for at udbyttetabene kan holdes så lave som muligt.

Fremgangsmåden skal anvendes til isolering af protein-aseinhibitoren, idet det har vist sig at være hensigtsmæssigt og fordelagtigt at anvende en forrenset dyrisk organekstrakt som udgangsmateriale til adsorptionen af proteinaseinhibitoren.

Til bestemmelse af koncentrationen af den proteinaseinhibitor, der fremkommer ved opfindelsen, kan man anvende hæmningen af plasminet med casein som substrat. Herved fastslås det, hvor vidt et plasmins enzymaktivitet, bestemt efter metoden ifølge L.F. Remmert og P.P. Cohen, J. Biol. Chem. 181, 431 (1949), nedsættes af en tilsat inhibitormængde. Haamningen af én plasminenhed defineres som én anti-plasminenhed. Til opnåelse af den specifikke aktivitet, dvs. renheden af den her omhandlede proteinaseinhibitor henføres antiplasminenhe- 145468 5 derne (APE)/ml til en ved en bølgelængde på 280 nm målt ekstinktionsværdi ΔE2g0 af inhibitoropløsningen på 1,0. Δ E£gQ er altså enheden for den optiske ekstinktion, og i det anvendte apparat er lysgeft-nemgangen 1 cm. Renheden er altså defineret ved koncentrationen divideret med ekstinktionen ved 280 nm. Herefter, og beregnet på"AFB/-ml nitrogen, opnås ved den her omhandlede fremgangsmåde en rensrilngs- faktor på fra ca. 5 til ca. 45. ' ',4

Det eluat, der fremkommer ifølge opfindelsen, kan f-.eks.

renses yderligere ved gelchromatografi, hvorved inhibitoren.kan. . fås med godt udbytte i høj renhed. Derefter kan man udvinde en inhibitor på ca. 170 APE/ml ved AEqsq = 1*0· Denne renhed af den poly-τ valente proteinaseinhibitor tillader dens terapeutiske anvendelse; på mennesker. . r;:i

Opfindelsen belyses ved hjælp af nedenstående eksempler.

Eksempel 1 r~ A. Fremstilling af et copolymerisat ud fra ethensulfonat og aCrylainid: 85 VD (vægtdele) af en 25%’s vandig opløsning af Na-saltet af ethensulfonsyre indstilles på en pH-værdi på 6-,9 - med 40%'s H2SO^. Deri opløses 5,3 VD acrylamid, og der opvarmes til 45°C. Polymer isationø»,. startes ved tilsætning af 0,425 VD ammoniumperoxydisulfat og 0,085 VD natriumdisulfit. Blandingen opvarmer sig til 98°C. Ti^ fuldstændiggørelse af polymerisationen tilsættes 0,0425 VD ammoniumperoxydisulfat og 0,0085 VD natriumdisulfat, der efteromrøres 1 2 timer ved 85°C og afkøles dernæst.

·: : rf B. Tværbinding med formaldehyd og termisk efterbehandling: • i 13,6 VD 28%'s formaldehydopløsning sættes til copolymeropløs-ningen og lades henstå i 15 timer ved 25°C. Den fremkomne gel tørres i vakuum ved 80°C, og det tørre produkt opvarmes til sidst til 150°C i 30 minutter. Det formales og klassificeres. Særlig egnet til udvinding af den polyvalente proteinaseinhibitor er fraktionen med en kornstørrelse på 0,06 - 0,3 mm. Før anvendelsen kvældes det tværbundne produkt ved vask med afsaltet vand og befries for vandopløselige biprodukter.

145468 6

Eksempel 2

Til 1650 liter lungevæv-råekstrakt med en pH-værdi på

C

8,5 og indeholdende 12 x 10 antiplasminenheder, sættes 33 kg fugtig ethensulfonat/acrylamid-copolymergel (fremstillet ifølge eksempel 1). Blandingen omrøres i 30 minutter og får dernæst lov at henstå i ro i 30 minutter til sedimentering af adsorben-ten. Derefter kan 1250 liter af den overstående væske fjernes ved hjælp af en hævert. Til fjernelse af den resterende overstående opløsning frafiltreres adsorbenten. Elueringen af prote-inåseinhibitoren sker med 120 liter afioniseret vand, idet suspensionens pH-værdi indstilles på 12,5 med koncentreret natriumhydroxidopløsning. Eluatet indeholder 95% af den i ekstrakten tilstedeværende inhibitormængde med en renhed på 60 APE/ml ved Δ.Ε280 =

Det på ovenstående måde udvundne eluat kan med fordel befries for højeremolekylære forureninger ved gelchromatografi, f.eks. over "Sephadex ^G-50" (Deutsche Pharmacia, Frankfurt/M.). Derved fås det aktive stof i en renhed på 140 - 200 APE/ml ved /^280 = 1/0 i et udbytte på over 50%, beregnet på råekstrakten.

Om ønsket eller nødvendigt kan den på denne måde fremkomne proteinaseinhibitor underkastes en pyrogenfjernelsesfremgangsmåde, indstilles på en terapeutisk gængs koncentration på 250 APE/ml, sterilfiltreres og fyldes i ampuller.

På denne form kan proteinaseinhibitoren indgives par-enteralt, især intravenøst.

Eksempel 3-14

Til 5 liter pr. gang af en lungevæg-råekstrakt, der indeholder en koncentration på ca. 6 APE/ml, sættes forskellige mængder af forskellige ionbyttere, og der oparbejdes i det væsentlige ifølge eksempel 2. Renheden af råekstrakterne er 1,7 APE/ml ved E280 = Nedenstående tabel viser som eksempel nogle af de gennemførte forsøg: 7 145668

Tabel

Reaktions- Proteinase-Ionbytter betingelser inhibitor ! Renhed

Ms. Ud- APE/ml '

Funktionel Mængde yed bytte ved

Eks. gruppe g/liter pH Eluering % E280 = ^ 3 Copolymergel Sulfonsyre 20 8,5 Vand 92 60 ifølge eks. 1 10% NaCl pH 3,0 4 Copolymergel Sulfonsyre 20 8,5 Vand 81 70 ifølge eks. 1 pH 12,5 5 Copolymergel Sulfonsyre 20 8,5 Vand 82 71 ifølge eks. 1 10% NaCl pH 4,5 6 Copolymergel Sulfonsyre 20 4,5 Vand 92 10

Ifølge eks. 1 pH 12,5 7 Copolymergel Sulfonsyre 20 4,5 Vand 85 13 ifølge eks. 1 10% NaCl pH 4,5 8 "Bio-ReJ^O" Sulfonsyre 2 8,5 Vand 90 53 pH 12,5 9 "Bio-Rej^lO" Sulfonsyre 2 8,5 Vand 65 52 20% NaCl pH 7,0 10 "Α^ίΡ-δΟ" Sulfonsyre 4 8,5 Vand 94 32 pH 12,5 11 "Bio-Re^^3" Phosphonsyre 6 8,5 Vand 75 53 pH 12,5 12 Copolymergel Vand ifølge eks. 1 Sulfonsyre 20 0,5 pH 12,5 100 8 13 Copolymergel Vand ifølge eks. 1 Sulfonsyre 20 3,0 pH 12,5 92 9 14 Copolymergel Vand ifølge eks. 1 Sulfonsyre 20 10,C pH 12,5 51 75 145468 8

Af de i eksempel 8-11 anvendte ionbyttere er "Bio-Rex®40" en stærkt sur, sulfoneret phenolisk harpiks, der som ionbyttende grupper indeholder υθ-sulfonsyregrupper på et phenolisk gitter, "Bio-Rex® 63" er en mellemsur harpiks indeholdende difunktionelle phosphonsyregrupper på et styren-divinylbenzen-gitter, og "AG ^MP-50" er en stærkt sur kationbytterharpiks, der som ionbyttende grupper indeholder nukleære sulfonsyregrupper knyttet til et styren-divinylbenzen-polymergitter.