DE2406971A1 - Verfahren zur gewinnung eines polyvalenten proteinasen-inhibitors - Google Patents

Verfahren zur gewinnung eines polyvalenten proteinasen-inhibitors

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DE2406971A1 DE19742406971 DE2406971A DE2406971A1 DE 2406971 A1 DE2406971 A1 DE 2406971A1 DE 19742406971 DE19742406971 DE 19742406971 DE 2406971 A DE2406971 A DE 2406971A DE 2406971 A1 DE2406971 A1 DE 2406971A1
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    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg(Lahn) Aktenzeichen: Hoe 74/b 002 - Ma 159 .
Datum 13. Februar 1974
Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors
Die Erfindung betrifft die Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors .aus tierischen Organen.
Der aus tierischen Organen gewonnene basische, polyvalente Proteinasen-Inhibitor hat eine hervorragende Bedeutung in der Therapie aufgrund seiner Eigenschaft, Trypsin, Chymotrypsin, die Kallikreine aus Plasma, Organen und Urin, . ferner Plasmin zu hemmen.
Seit der Entdeckung dieses Inhibitors sind eine grosse Anzahl von Verfahren zu seiner"Isolierung bekannt geworden. Nach der Extraktion der Organe wird der Inhibitor aus dem Extrakt durch Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln wie Alkohol oder Aceton; mit Hilfe verschiedener Eiweißfällungsmittel wie Sulfosalizylsäure, Thiosalizylsäure, Trichloressigsaure, Metaphosphor_ säure- oder verschiedener Salze; durch spezifische Adsorption oder durch chromatographische Methoden gewonnen. Die meisten dieser Verfahren sind jedoch für technische Maßstäbe wenig geeignet, wenn gleichzeitig die Forderung nach guter Ausbeute und der Einfachheit der Durchführung erhoben wird.
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Ma 159
Ein Verfahren, das diese beiden Bedingungen im wesentlichen erfüllt, beinhaltet die Adsorption des Proteinasen-Inhibitors aus dem Organextrakt an Carboxymethylcellulose. Der Verfahrensschritt der Adsorption an die Carboxymethylcellulose erfordert aber eine niedrige Ionenstärke der lösung, die nur- durch starkes Verdünnen des Organextraktes erreicht werden kann. Neben diesem Nachteil des Arbeitens mit grossen Volumina und der grossen Menge des einzusetzenden Ionenaustauschers stellt die Filtrierbarkeit der stark quellenden Carboxymethylcellulose eine technisch schwieriges Problem dar, das sich insbesondere bei der Regeneration, die im alkalischen pH-Bereich durchzuführen ist, schwerwiegend auswirkt. Aufgrund der bekannten basischen Eigenschaft des polyvalenten Proteinasai-Inhibitors sollte es naheliegend sein, statt Carboxymethylcellulose andere saure Ionenaustauscher, die in Harzform vorliegen und die die skizzierten Nachteile der Carboxymethylcellulose nicht zeigen, für die Gewinnung dieser Substanz einzusetzen. Die in der Litera.tur hierfür aufgezeichneten Wege erwiesen sich jedoch als sehr unbefriedigend. Für die Adsorption des Inhibitors wird eine grosse Menge an Austauschharz benötigt, bei relativ schlechten Ausbeuten und nicht immer befriedigender Reinheit des Produkts, oder es wird mit einem erheblichen Fraktionierungsaufwand, der sich im technischen Maßstab nicht vertreten liesse, ohne Rücksicht auf die Ausbeute ein sehr reines Produkt hergestellt.
Es wurde nun gefunden, dass diejenigen Kationenaustauscher, die als funktioneile Gruppen Sulfonsäure- oder Phosphonsäurereste tragen, sich für die Isolierung des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors besonders eignen.
Vorteilhaft lässt sich als Adsorbens ein Äthensulfonat/ Acrylamid-Copolymergel verwenden. Das Gel ist ein nach grundsätzlich bekannten Verfahren gemäss Beispiel 1 der vor-
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liegenden Anmeldung herzustellendes Copolymerisat aus Äthensulfonsäure und Acrylamid (im Gewichtsverhältnis von etwa 20:1 bis 2:1, vorzugsweise 8:1 bis 3:1), das mit 1—15% Formaldehyd vernetzt wird. Eine geeignete Korngrösse für die Adsorption des Proteinasen-Inhibitors beträgt 0,06 bis 3 mm.
Für das erfindungsgemässe Verfahren haben sich weiterhin als gut geeignet herausgestellt die handelsüblichen Polyphenol-up-Sulfonsäure-Ionenaustauscher, ferner Polystyrol-Sulfonsäure-Harze, insbesondere solche, deren Kapazität durch makroporöse Struktur erhöht ist, oder Polystyrol-Phosphonsäure-Harze. Als besonders günstig hat sich eine Korngrösse dieser Ionenaustauscher von etwa 0,03 bisQCBmm erwiesen.
Gegenüber Carboxymethyl-Cellulose zeichnen sich die erfindungsgemässen Austauschertypen durch eine wesentlich höhere adsorptive Kapazität aus.
Ferner lässt sich die Filtrationsgeschwindigkeit gegenüber Carboxymethyl-Cellulose sowohl zur Abtrennung von nicht ad-■ sorbiertem Material als auch bei der Elution des Inhibitors von den erfindungsgemäss zu verwendenden Harzen wesentlich erhöhen. Die angeführten Ionenaustauscher lassen sich nach der Elution des Inhibitors leicht regenerieren, da die Durchlaufgeschwindigkeit von Lösungen auch im alkalischen Bereich nicht verschlechtert wird. Die Austauscher lassen sich mehrfach zur Gewinnung des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors einsetzen. Dies kann sowohl im Batch- als auch im Säulenverfahren erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors aus dessen wässrigen Lösungen, vorzugsweise aus wässrigem Extrakt von tierischen Organen, vorzugsweise Rinderlunge, durch
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Adsorption des Inhibitors an ein Ionenaustauscherharz mit funktioneilen Sulfonsäuregruppen oder Phosphonsäuregruppen bei pH-Werten von 0,5 bis 10,5, vorzugsweise pH-Werten von 7,5 bis 9,5, Abtrennung des Adsorbens und anschliessender Elution mit wässrigen Salzlösungen bei pH-Werten von 1 bis 13, vorzugsweise pH-Werten von 10 bis 12,5, wobei in der Nähe von pH 12,5 ein Salzzusatz unterbleiben kann, während mit fallendem pH-Wert zur Erhöhung des Elutionsverm'dgens steigende Mengen Salz
zugesetzt werden. Bei Verwendung des Äthensulfonat/Jicrylamid-Copolymergels wird beispielsweise bei einem pH-Wert von 3 dem Elutionsmedium etwa 10% Kochsalz zugesetzt. Bei Verwendung der Polyphenol-dJ-Sixlfonsäure-Ionenaustauscher, der Polystyrol-Sulfonsäure-Harze und der Polystyrol-Phosphonsäure-Harze wird beispielsweise bei pH 7,0 die Elution unter Zusatz
* )
von etwa 20% Kochsalz durchgeführt. Bei diesen Austauschertypen ist zu berücksichtigen, daß infolge der zur Elution erforderlichen höheren Salzkonzentrationen bei Elutionen unterhalb vora pH-Wert 5 Ausfällungen des Inhibitors auftreten Können, die durch ein erhöhtes Elutionsvolumen kompensiert werden müssen, um Ausbeuteverluste möglichst niedrig zu halten.
Das Verfahren ist zur Isolierung des Proteinasen-Inhibitors einzusetzen, wobei es sich als zweckmäßig erwiesen hat, als Äusgangsiiiaterial für die Adsorption des Proteinasen-Inhibitors vorteilhaft einen vorgereinigten, tierischen Organextrakt zu verwenden.
Zur Bestimmung des erfindungsgemäss erhaltenen Proteinasen-Inhibitors kann die Hemmung des Plasmins mit Casein als Substrat eingesetzt werden. Hierbei wird festgestellt, inwieweit die Enzymaktivität eines Plasmins, bestimmt nach der Methode von L.F. Remmert und P.P. Cohen, J.' Biol. Cheni. 181, 431 (1949), durch eine zugesetzte Inhibitormenge herabgesetzt wird. Die Hemmung einer Piasmineinheit wird als eine Antiplasmineinheit definiert. Für die spezifische Aktivität des
*) oder solchen Mengen eines anderen Salzes, die ein vergleichbares Elutionsver-mögen besitzen.
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Ma - 5 -
erfindungsgemäßen Proteinasen-Inhibitors werden die Anti-
plasmineinheiten (APE)/ml auf einen bei einer Wellenlänge von 280 ran gemessenen Extinktionswert der Lösung des Inhibitors von 1,0 bezogen. Hiernach, und bezogen auf APE/mg Stickstoff wird gemäß dem vorliegenden Verfahren ein Reinigungsfaktor von 20 bis 35 erreicht.
Das erfindungsgemäß erhaltene Eluat kann beispielsweise durch Gelchromatographie weiter gereinigt werden, wodurch der Inhibitor in hoher Reinheit mit guter Ausbeute erhalten werden kann. Danach kann ein Inhibitor von etwa 170 APE/ml bei ^2Q0 = 1,0 gewonnen werden. Diese Reinheit des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors erlaubt dessen therapeutische Anwendung bei Menschen.
Die Erfindung soll an nachstehenden Beispielen erläutert werden.
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- 6 - ' . ■ . Ma 159 Beispiel 1 . "
A. Herstellung eines Copolymerisates aus Äthensulfonat . und Acrylamid:
GT (Gewichtsteile) einer 25%igen wäßrigen Losung des Na-Salzes von Äthensulfonsäure werden mit 4O%iger H2SO4 auf pH 6,9 gestellt. Man löst darin
5,3 GT Acrylamid und erwärmt auf 45°C. Die Polymerisation wird durch Zugabe von
0,425 GT Anunoniumperoxidisulfat und
0,085 GT Natriumdisulfit gestartet. Der Ansatz erwärmt
sich auf 98°C. Zu
merisation werden
O,Q425 GT Ammoniumperoxidisulfat und
sich auf 98°C. Zur Vervollständigung der PoIy-
0,0085 GT Natriumdisulfit zugegeben, 2 Std. bei 85°C nachgerührt und dann abgekühlt.
B. Vernetzung itD-t Formaldehyd und thermische Kachbehandlung:
13,6 GT 28%ige Formaldehyd-Lösung wird zu der Copolymer-Lösung gegeben und bei 25°C 15 Std. stehen gelassen. Das erhaltene Gel trocknet man bei 80°C im Vakuum und erhitzt zuletzt das trockene Produkt 30 Minuten auf 1500C. Ss wird gemahlen und klassiert. Besonders geeignet für die Gewinnung des polyvalenten Proteinasen-Inhibitors ist die Fraktion mit der Korngröße 0,06-0,3 -ran. Vor der Verwendung wird das vernetzte Produkt durch Waschen mit entsalztem Wasser gequollen . und von wasserlöslichen Nebenprodukten befreit.
Beispiel 2
Zu 1650 1 eines Lungengewebe-Rohextraktes, der 12 χ 10 Antiplasmineinheiten enthält, v/erden 33 kg des feuchten Äthensulfonat/Acrylamid-Copolymergels (hergestellt gem. Beispiel 1)
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-■ ■ ■ · ' Ma" 159·
— ι —
zugefügt. Man läßt die Mischung 30. Min. rühren und anschließend 30 Min. zur 'Sedimentation des Adsorbens ruhig stehen. Danach können 1250 1 des Überstandes abgehebert werden. Zur Entfernung der restlichen überstehenden Lösung wird das Adsorbens abfiltriert. Die Elution des Proteinasen-Inhibitors erfolgt mit 120 1 entionisiertem Wasser/ wobei der pH-Wert der Suspension mit- leonzentrierter Natronlauge auf pH 12,5 eingestellt wird. Das Eluat enthält 95% der im Extrakt vorhandenen Inhibitormenge mit einer Reinheit von 60 ΑΡΕ/ml bei ^
Das auf die vorher beschriebene Weise gewonnene Eluat kann vorteilhaft durch Gelchromatographie, beispielsweise über
(R)
Sephadexv G-50 (Deutsche Pharmacia, Frankfurt/M.), νοηχ höhermolekularen Verunreinigungen befreit werden. Dabei erhält man die Wirksubstanz in einer Reinheit von 140-200 APE/ml bei Δ E28o = ^->® ^-n einer Ausbeute von über 50% bezogen auf äen Rohextrakt. . ■ "
Falls gewünscht oder erforderlich läßt sich der so erhaltene Proteinasen-Inhibitor einem Verfahren der Pyrogen-Entfernung unterwerfen, auf eine therapeutisch übliche Konzentration von 250 ΑΡΕ/ml einstellen, steril filtrieren und in Ampullen abfüllen. ■
Der Proteinasen-Inhibitor ist in dieser Form parenteral, insbesondere intravenös applizierbar. . -
Beispiele 3 bis 11
Zu jeweils 5 1 eines Lungengewebe-Rohextraktes, der etwa 6 APE/iäl enthält, werden unterschiedliche Mengen verschiedener Ionenaustauscher zugesetzt und im wesentlichen gemäß Beisx^iel 2
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/8
Ma 159
aufgearbeitet. Die folgende Zusammenstellung zeigt beispielhaft einige der durchgeführten Versuche:
Bei
spiel		 Ionenaustauscher funktioneile
Gruppe		 Menge
g/i '		 Reaktions-
bedinqunqen		 Blut. Proteinasen-
Inhibitor		 Reinh.
APE/ml
bei
Ε28ο=1
3 Bezeichnung SuIfonsäure 20 Ads,
bei
PH		 Wasser
1OJiNaCl
pH 3,0		 Aus
beute
/o		 60
4 I
Copolymergel
n.Beisp. 1		 SuIfonsäure 20 8,5 Wasser
pH 12,5		 92 70
5 Copolymergel
n.Beisp. 1		 SuIfönsäure 20 8,5 Wasser
1095KaCl
pH 4,5		 81 71
6 Copolymergel
n.Beisp. 1		 Sulfonsäure 20 8,5 Wasser
pH 12,5		 82 IO
7 Copolymergel
n.Beisp. 1		 Sulfonsäure 20 4,5 Wasser
lO%NaCl
pH 4,5		 92 13
8 Copolymergel
'n.Beisp. 1		 Sulfonsäure . 2 4,5 Wasser
pH 12,5		 85 53
9 (Rl x)
3io-Rex 40		 Sulfonsäure 2 8,5 Wasser
DH 7,0		 90 52
10 . (R) X>
3 io-Rex 40		 Sulfonsäure 4 8,5 Wasser
pH 12,5		 65 32
11 (R) x>
AG MP-50		 Phosphonsäure 6 8,5 ρ c- !Wasser
' jpH 12,5		 94 53
I
(R) χ)
3 io-Rex 63		 75
Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA
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/9

Claims (10)

  1. g _ Ma 159
    Patentansprüche
    Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors aus tierischen Organen, dadurch gekennzeichnet, dass man den Inhibitor aus dessen wässrigen Lösungen durch Adsorption an einen Ionenaustauscher mit funktioneilen SuIfonat- oder Phosphonatgruppen bei pH 0,5 bis 10,5 adsorbiert und mit Wasser oder einer Salzlösung bei pH 1 bis 13 eluiert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorbens ein Äthensulfonat/Acrylamid-Copolymergel verwendet wird.
  3. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Adsorption ein Gel, hergestellt durch Copolymerisation aus Äthensulfonsäure und Acrylamid im Gewichtsverhältnis von 20:1 bis 2:1 und anschliessende Vernetzung mit 1-15% Formaldehyd verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorbens ein Polyphenol-ü>-Sulfonsäure-Ionenaustauscher verwendet wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorbens ein Polystyrol-Sulfonsäure-Ionenaustauscher, vorteilhaft mit makroporös.er Struktur, verwendet wird.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorbens ein Polystyrol-Phosphonsäure-Ionenaustauscher verwendet wird.
  7. 7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution bei etwa pH 12,5 mit Wasser ohne Zusatz von Salzen durchgeführt wird.
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    . - 10 -
  8. 8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elutionslösung bei fallendem pH-Wert steigende Mengen Salze enthält.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung des Äthensulfonat/Acrylamid-Copolymergels nach Anspruch 3 die Elution des Proteinasen-Inhibitors mit einer 10bigen Kochsalzlösung bei pH 3.0 vorgenommen wird.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung von Polyphenol-^-Sulfonsäure-Ionenaustauschern, von Polystyrol-Sulfonsäure-Harzen oder Polystyrol-Phosphonsäure-Harzen die Elution des Proteinasen-Inhibitors mit einer 2O?oigen Kochsalzlösung bei pH 7,0 vorgenommen wird.·
    .11. Polyvalenter Proteinasen-Inhibitor, hergestellt nach Ansprüchen 1 bis 10.
    509834/0943
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