DE1966573B2 - Verfahren zur Reinigung von Insulin - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von InsulinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von handelsüblichem oder rohem Insulin durch Säulenchromatographie an Anionenaustauschern und
Eluieren bei 0 bis 300C.
Als Insulin-Ausgangsmaterial für das Reinigungsverfahren wird gewöhnlich handelsübliches Insulin verwendet, d. h. amorphes Insulin oder kristallines Insulin, das
mehrmals kristallisiert worden sein kann. Man kann aber auch Rohinsulin verwenden wie z. B. den
insulinhaltigen Salzkuchen, der während der Gewinnung von Insulin aus Pankreasdüsen gebildet wird und
gewöhnlich 10 bis 30 Gew.-% Insulin enthält, doch ist dieses Ausgangsmaterial wegen seines hohen Gehaltes
an Verunreinigungen für die erfindungsgemäße Reinigung weniger gut geeignet. Hin besseres Ausgangsmaterial kann erhalten werden, wenn man eine Lösung des
Salzkuchens durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 5,5 einer isoelektrischen Ausfällung
unterzieht und den Niederschlag abzentrifugiert.
Ursprünglich wurde allgemein angenommen, daß richtig umkristallisiertes Insulin in der Form scharfkantiger, durch ebene Kristallflächen begrenzter Rhomboeder das reine Protein Insulin darstellte, dessen
Konfiguration von Sanger und Mitarbeitern festgelegt worden war. siehe z. B. Biochemical Journal 60
(1955), 556. Später wurde jedoch gefunden, daß dies nicht zutrifft.
Wissenschaftliche analytische Untersuchungen zeigten, daß das vorgenannte kristalline Insulin Proteine aus
dem Pankreas mit einem höheren Molekulargewicht als demjenigen des reinen Insulins und außerdem insulinähnliche Substanzen mit ungefähr dem gleichen
Molekulargewicht wie demjenigen des reinen Insulins (etwa 6000) enthält.
So konnte nachgewiesen werden (vgl. z. B. Hoppe —
S e y I e r, Z. Physiol. Chem.. Bd. 349, S. 1160 (1968) Abb.
la), daß kristallines Insulin, in I M Essigsäure gelöst, an
einer Kolonne aus Sephadex GSCP [mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran mit einer Obergrenze der Durcbdringbarkeit von ungefähr 10 000 (Mindest-Molgewicht
der ausgeschlossenen Substanzen) in Form von Perlen mit 20—80 μ Durchmesser; Herstellerfirma PHARMACIA, Uppsala, Schweden] in Komponenten (a), (b) und
(c) aufgetrennt werden kann. Diese drei Komponenten lassen sich aus ihren Lösungen nach üblichen Methoden,
z. B. Aussalzen, Ausfällen mit einem Zinksalz bei
neutraler Reaktion, Gefriertrocknung usw. isolieren.
Jede der Komponenten (a) und (b) enthält Pankreas-Proteine mit einem Molekulargewicht über 6000,
während die Komponente (c) reines Insulin, verunreinigt mit insulinartigen Proteinen von etwa dem gleichen
is Molekulargewicht wie demjenigen des reinen Insulins
enthält
Die Menge der Komponente (a) kann 2—5 Gew.-% des kristallisierten Insulins betragen und weniger als 1
Gew.-% des rekristallisierten Insulins. Die Menge der
ausmachen, und die Menge der insulinartigen Proteine
in dsr Komponente (c) kann 5-13 Gew.% der
oben genannten Komponenten (a) und (b) und bis zu einem gewissen Ausmaß auch die insulinartigen
Proteine in der Komponente (c) im Prinzip für das antigene Verhalten der bisher bekannten Insulinpräparate verantwortlich sind (vgl. DE-OS 19 40 130).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Insulin zur Verfügung zu stellen, mit dem sich injizierbare
Insulinpräparate herstellen lassen, die entweder überhaupt keine oder im Vergleich zu den am Anmeldetag
bekannten injizierbaren Insulinpräparaten, nur noch
sehr geringe Insulinantikörperbildung nach der Injektion hervorrufen.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung bei dem eingangs als bekannt zugrunde gelegten Verfahren
zur Reinigung von Insulin durch säulenchromatographi
sehe Behandlung einer Insulinlösung auf einem Anio-
nenaustauscher vor, daß man mit einer 20 bis 70 Vol.-% Wasser und einen mit Wasser mischbaren niederen
aliphatischen Alkohol enthaltenden Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5,5 bis 10 eluiert, die dem mittleren
Hauptteil des Insulin-Peaks entsprechenden, bei der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel- Elektrophorese
im wesentlichen eine einzige Komponente aufweisenden Fraktionen sammelt und das darin enthaltene
Insulin in an sich bekannter Weise gewinnt.
Für analytische Zwecke wurde schon früher die
diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) eingesetzt, auch im Zusammenhang mit
kristallinem Insulin. Diese spezielle Gel-Elektrophorese wurde von B. J. Davis und L. O r η s t e i η entwickelt
und ist in Ann. N. Y. Acad. Sei. 12), S. 321-349 und
404—427 (1964) beschrieben. In Verbindung mit dem
Verfahren nach der Erfindung enthält das untere Gel 7,5% Polyacrylamid und 8 M Harnstoff und hat einen
pH-Wert von etwa 8,7, während das obere Gel und die
Ni eingesetzte etwa 0,1 mg Insulin enthaltende Insulinlösung auch 8 M Harnstoff enthalten.
Es ist nicht nur überraschend, daß sich nach der Erfindung die hochmolekularen Pankreasproteine entfernen lassen, sondern auch, daß man als Kriterium für
■ · die Abwesenheit dieser Proteine die diskontinuierliche
Polyacrylamidgel-Elektrophorese einsetzen kann. Es ist nämlich bekannt, daß man bei der Verwendung dieser
Analysenmethode in Verbindung mit handelsüblichem
Insulin ein Insulinband erhält, welches ein hochmolekulares
Protein und zwar das Dimere enthält (vgl. S t e i η e r und Mitarbeiter, Diabetes, 17, (1968) S. 728,
rechte Spalte).
Es konnte auch nicht vorausgesehen werden, daß das erfindungsgemäß verwendete Eluierungsmittel eine
solche Monomerisierung der anwesenden Proteine bewirken könnte, daß eine Abtrennung der insulinähnlichen Stoffe möglich wird.
Es ist zwar bekannt, zur Gewinnung von Insulin saure
oder neutralisierte alkoholische Pankreas-Extrakte der Säulenchromatographie un einem Kationenaustauscher,
z. B. Alginsäure (US-PS 28 78 159), Carboxymethylcellulose (FR-PS 14 99 126), sulfonierten Harzen, die aus dem
Telomer von Styrol und Divinylbenzol synthetisiert sind (GB-PS 10 54 523) zu unterwerfen. Das nach diesem
Verfahren erhaltene Insulin enthält jedoch die antigenen Verunreinigungen, ebenso wie das kristalline
Insulin, das nach den gebräuchlichen Gewinnungsmethoden einschließlich mehrmaliger Ausfällung durch
Aussalzen aus dtn Rohinsulinlösungen mittels Natriumchlorid erhalten wird. Dies gilt auch für diejenigen
bekannten Verfahren, bei denen die Insulinlösung auf einem Anionenaustauscher wie Diäthylaminoäthylcelluiose (US-PS 30 69 323) oder Dowex 1-X2® (I s m a i I ο ν
und Mitarbeiter, Azerb. Med. Zh. 45 (1). 8-13 (1968)) säulenchromatographisch behandelt wird.
Hiervon unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch, daß die Adsorption des Insulins an
einem Anionenaustauscher in Verbindung mit weiteren, d. h. den das erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnenden Maßnahme/, durchgeführt wird, die erst in ihrer
Gesamtheit zur Lösung der Erfindungsaufgabe führen.
Aus der GB-FS 8 81 85U ist es bekannt, einen
Ionenaustauscher mit einem salzhaltigen wäßrigen Alkohol zu dem Zwecke zu eluiert./, verschiedene
organische Stoffe, die aus verdünnten wäßrigen Lösungen solcher Stoffe auf den Ionenaustauscher
adsorbiert sind, zu gewinnen. Als eine Ausführungsform dieses Verfahrens wird nicht näher spezifiziertes Insulin
an einem Kationenaustauscher vom Typ sulfoniertes Styrol-Divinylbenzolcopolymer in Perlenform adsorbiert und mit salzhaltigem wäßrigen Äthanol eluiert.
Aber selbst wenn rekristallisiertes Insulin als Ausgangsmaterial verwendet wird, zeigt das gewonnene Insulin in
der Hauptsache dieselben Verunreinigungen wie das Ausgangsmaterial, indem sämtliche insulinhaliigen
Fraktionen und nicht nur solche Fraktionen, welche im wesentlichen eine einzige Komponente bei der DISC
PAGEAnalyse zeigen, vereinigt werden.
Ferner ist aus der GBPS 9I3 042 bekannt,
kristallines Insulin, das mit amorphen oder mikrokristallinen Fremdstoffen vermischt ist. dadurch zu reinigen,
daß man das unreine Kristallisat mit einer wäßrigen Flüssigkeit wäscht, deren pH-Wert mit Hilfe einer
schwachen Säure oder eines Puffergemisches auf 3,8—4,J eingestellt ist. Dieser Reinigungsvorgang
entfernt jedoch nicht Verunreinigungen wie Proinsulin, das Dimer oder das Intermedia!.
Schließlich wird in der GB-PS 8 71 541 vorgeschlagen. 6mal kristallisiertes Insulin und Insulin, das wie von
Lens (Biochem. et Biophys. Acta (1948), 2, 76)
beschrieben, gereinigt worden war, der Säulenchromatographie an einem Styrol-Divinylbenzolpolymer-Kationcnaustauscher zu unterziehen, der auf einem inerten
Streckmittel mit großer Oberfläche abgelagert ist; doch auch nach dieser Chromatographie wird das Insulin
immer noch Verunreinigungen enthalten, die nicht
verhindern, daß das Chromatogramm so aussieht, als
wäre das aus der Kolonne eluierte Material im wesentlichen homogen.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Anionenaustauscher sind bekannt. Beispiele von
schwach basischen Anionenaustauschern sind Bio-Gel DM8, hergestellt auf der Basis von Polyacrylamiden,
Diäthylaminoäthyl-Sephadex®, hergestellt aus vernetzten Dextranen, und Diäthylaminoäthylcellulose, hergestellt aus Cellulose. Beispiele für stark basische
Anionenaustauscher sind Dowex 1®, hergestellt aus Polystyrolen, und QAE-Sephadex®, hergestellt aus
vernetzten Dextranen. Die Sephadex®-Anionenaustauscher werden von der Firma PHARMACIA, Uppsala,
is Schweden, hergestellt
Die als Eluierungsmittel verwendeten wasserhaltigen
aliphatischen Alkohole wie Methanol, Äthanol und Propanole werden nach der Erfindung vorzugsweise mit
einem Wassergehalt von 30—50% (v/v) verwendet
Das Eluierungsmittel enthält immer einen Puffer zur Kontrolle seines pH-Wertes. Vorzugsweise wird bei
konstantem pH-Wert gearbeitet. Der pH-Wert des Eluierungsmittels wird am besten zwischen 6 und 9,
gemessen mittels einer in der üblichen Weise gegen einen Standardpuffer eingestellten Glaselektrode, gehalten.
Geeignete Puffersubstanzen sind in der Literatur beschrieben.
ίο Fraktionen in üblicher Weise gewonnen werden, z. B.
durch Eindampfen, Aussalzen oder Ausfällen in
amorpher oder kristalliner Form in Anwesenheit von
Zinkionen.
J5 Beispiel 1
Als stark basischer Anionenaustauscher wird ein Produkt auf der Grundlage einss Copolymers aus Styrol
mit 2% Divinylbenzol mit Benzyltrimethylammoniumgruppen als funktioneile Gruppen verwendet, das in
von der Firma The Dow Chemical Company of Midland,
wird.
■»*> folgender Zusammensetzung hergestellt:
0.1 m NH4CI
0.02 m NH1
60% (v/v) Äthanol
pH 8.3 bei 25° C.
15 g des vorerwähnten Anionenaustauschers werden
in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen
abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule
von 1,6 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet,
>'» welche mit dem Puffer equilibriert wird.
500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten Insulins werden in einer Mischung von 20 mg
Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsal/., 5 ml Puffer, 5 ml 60%igcm (v/v) Äthanol und 0,04 ml 13,3 m NHj
gelöst (End-pH 8,5). Unlösliches Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Säule
aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei einer Temperatur von 25°C mit 7.5 ml/h. Es werden
Fraktionen von je 5 ml aufgefangen.
Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem
mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt
und das Insulin wird daraus durch Zusatz von 100 ml
Wasser, 13ml InHCI und 2m! Im Zinkacetat je
JOO ml der vereinigten Fraktionen ausgefällt Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in an sich
bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert Die Ausbeute an gereinigtem Insulin
beträgt 200 mg.
In diesem wie auch bei den nachfolgenden übrigen ι ο Ausführungsbeispielen wird als stark basischer Anionenaustauscher
ein Produkt auf der Grundlage eines mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrans mit einer Obergrenze
der Durchdringbarkeit von ungefähr 5000 (M indest-Molgewicht
der ausgeschlossenen Substanzen) verwendet welches DiäthyI-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylgruppen
als funktionell Gruppen trägt und in Form von Perlen mit einem Durchmesser von 40—120 μ
vorliegt Ein solcher Anionenaustauscher wird von der Firma PHARMACIA, Uppsala, Schweden unter der
Bezeichnung QAE-Sephadex® A-25 auf den Markt gebracht.
Es wird ein Puffe folgender Zusammensetzung
hergestellt:
25 gTris-(hydroxymethyl)aminomethan 2j
29,0 ml 6 η HCI
1,2 I Methanol
Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 2 1
pH73bei25°C
40 g QAE-Sephadex A-25® werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden
abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 23 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet.
Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert. Jj
500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristalliserten Insulins werden in einer Mischung von 20 mg
Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 94 mg Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 10 ml 6O°/oigem
(v/v) Methanol und 0,073 ml 6 η HCI gelöst (End-pH 73). ·»"
Das ur'.ösliche Material wird abzentrifugiert und die
klare Lösung auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 25°C mit 30 ml/h. Fraktionen
von je 5 ml werden aufgefangen.
Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und -4 gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem
mittleren Hauptteil der Inr, ilinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt
und das Insulin durch Zusatz von 100 ml Wasser und 2ml Im Zinkacetat je 100ml der vereinigten ">»
Fraktionen ausgefJ'lt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert
und in bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an gereinigtem
Insulin beträgt 250 mg.
Be ispiel 3
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,06 m Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
0,02 η HCI
0,075 NaCI
60%iges (v/v) Äthanol
pH 8,3 bei 25°C.
80 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustau- ■
schers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantierl. Das Material
wird zum Packer, "iner Säule von 2,5 cm Durchmesser und 50 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem
Puffer equilibriert
2,5 g eines einmal aus einem Citratpuffer kristallisierten
Insulins werden bei 0°C in einer Mischung von 450 mg Tris-(hydroxymethy])aminomethan, 100 mg
Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 25 ml des Puffers, 25 ml 60%iges (v/v) Äthanol und 0,08 ml 4 η
HCl gelöst (End-pH bei 25°C: 8,4). Das unlösliche Material wird bei 2—4°C abzentrifugiert und der klare
Überstand wird auf die Säule aufgebracht Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 4° C mit 26 ml/h.
Fraktionen von je 20 ml werden aufgefangen.
Die Extinktionen bei 276 nrn werden „gemessen und
gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten
Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz eines gleichen
Volumens von 0,02 m Zinkacetat + 0,03 η HCI ausgefällt Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in
bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert Die Ausbeute beträgt 1,3 g gereinigtes
Insulin.
Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
14,9 g Histidinium-monochlorid
38,7 ml 1 η NaOH
16,1 gNaCl
3,12 196%iges (v/v) Äthanol
Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 5 !
pH 6^ bei 25°C.
35 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die
feinsten Teilchen werden abzentrifugiert. Das Material wird zum Packer, einer Säule von 2,5 cm Durchmesser
und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem Puffer equilibrier».
500 mg eines einmal aus einem Citratpbifer kristallisierten
Insulins werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 6,5 ml des
Puffers und 6 ml 60%igem (v/v) Äthanol gelöst und das pH wird mit 1 η NaOH auf 6,8 eingestellt. Das unlösliche
Material wird abzentrifugiert und die fchre Lösung wird
auf die Säule aufgebracht. Die Elption erfolgt mit dem Puffer bei 25°C mit 30 ml/h. Es werden Fraktionen von
je 5 ml gesammelt.
Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem
mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt
und das Insulin durch Zusatz eines gleichen Volumens 0,02 m Zinkaceta! ausgefällt. Der Niederschlag wird
abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute
an gereinigtem Insulin beträgt 210 mg.
Es wirJ ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
1,25 kgTris-(hydroxymethyl)aminomethan
725 ml 123 η HCI
62,4 196%iges (v/v) Äthanol
Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 I
pH 7,Jb^ 25°C.
1,3 kg des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustau-
schers werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material
wird zum Packen einer Säule von 15 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule wird mit dem
Puffer equilibriert.
18 g rekristallisiertes Schweine- oder Rinder-Insulin,
welches ungefähr 0,4% Zn enthält, werden in einer Mischung von 0,72 g Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz,
10,2 g Tris-(hydroxymethyl)aminomethan und 720 rnl 60%igem (v/v) Äthanol gelöst. Das
unlösliche Material wird abzentrifugiert. Die klare Lösung wird nach Zusatz von 10,7 ml 6 η HCl auf die
Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 25°C und mit 1.2 l/h. Es werden Fraktionen von je
03 !gesammelt.
Die Extinktionen bei 276 nm [E2Ib) werden gemessen
und gegen die Volumteile des Eluats aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größten
Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird durch Zusatz des gleichen
Volumens von 0,02 m Zinkacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter
Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffer kristallisiert
Die Ausbeute beträgt 8,2 g gereinigtes Insulin.
Das Insulin wird aus einem Puffer folgender Zusammensetzung umkristallisiert:
2,0% Insulin
0,8% Zn^+ (als Chlorid), berechnet auf das
Gewicht des Insulins),
0,1 m Natriumacetat
7,0% Natriumchlorid
HCI bis zu einem pH von 5,45 — 5,55.
Das Insulin wird in HCI und ZnCI2 enthaltendem
Wasser gelöst, wonach eine erforderliche Menge an einer Lösung von Natriumacetat und Natriumchlorid
zugesetzt wird. Die Kristallisation erfolgt bei Raumtemperatur unter mechanischem Rühren. Sie ist innerhalb
von 1 bis 2 Tagen vollendet. Das Insulin wird abfiltriert.
mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 8.0 g.
Das gereinigte Insulin kann zur Herstellung aller Arten von pharmazeutischen Insulinpräparaten für den
klinischen Gebrauch verwendet werden.
Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0.ImNhLiCl
0,0036 η NH3
60%iges (v/v) Äthanol
pH7,7bei25"C.
0,0036 η NH3
60%iges (v/v) Äthanol
pH7,7bei25"C.
40 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen gelassen und die
feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser
und 25 cm Hohe verwendet. Die Säure wird niii uem
Puffer equilibriert.
1 g rekristallisiertes Rinder-Insulin mit einem Gehalt
von ungefähr 0,4% Zn wird in 10 ml 60%igem (v/v) Äthanol, 10 ml des Puffers, 0,5 ml einer 0,2 m Lösung
von Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz und 0,04 ml 14 η Ammoniak (End-pH 7,7) gelöst. Das
unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution
erfolge mit dem Puffer bei einer Temperatur von 25°C mit 25 ml/h. Es werden Fraktionen von je 10 ml
aufgefangen.
Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem
mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der größter Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigi
und das Insulin wird daraus durch Zusatz eines gleicher Volumens von 0,02 m Zinkacetat + 0,003 η HCI ausge
fällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und ir bekannter Weise aus einem acetonhaltigen Citratpuffei
kristallisiert. Die Ausbeute an reinem Insulin betrag
0,6 g.
Claims (4)
1. Verfahren zur Reinigung von handelsüblichem oder rohem Insulin durch Säulenchromatographie
an Anionenaustauschern und Eluieren bei 0 bis 30° C,
dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer 20 bis 70 VoL-% Wasser und einen mit Wasser
mischbaren niederen aliphatischen Alkohol enthaltenden Pufferlösung bei einem ρ H-Wert von 5,5 bis
10 eluiert, die dem mittleren Hauptteil des Insulin-Peaks entsprechenden, bei der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel-EIektrophorese im wesentlichen eine einzige Komponente aufweisenden
Fraktionen sammelt und das darin enthaltene Insulin in an sich bekannter Weise gewinnt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluieren mit einer 30 bis 50
VoL-% Wasser enthaltenden Pufferlösung durchführt
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluieren mit einer
Pufferlösung vom pH 6 bis 9 durchführt
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säulenchromatographie an einem stark basischen Anionenaustauscher
durchführt
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19691966573 DE1966573C3 (de) | 1969-08-07 | 1969-08-07 | Verfahren zur Reinigung von Insulin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19691966573 DE1966573C3 (de) | 1969-08-07 | 1969-08-07 | Verfahren zur Reinigung von Insulin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1966573A1 DE1966573A1 (de) | 1973-04-26 |
DE1966573B2 true DE1966573B2 (de) | 1979-01-04 |
DE1966573C3 DE1966573C3 (de) | 1979-08-30 |
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ID=5755753
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19691966573 Expired DE1966573C3 (de) | 1969-08-07 | 1969-08-07 | Verfahren zur Reinigung von Insulin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1966573C3 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2701092A1 (de) * | 1976-01-16 | 1977-07-28 | Leo Sa Lab | Verfahren zur herstellung von reinem insulin |
-
1969
- 1969-08-07 DE DE19691966573 patent/DE1966573C3/de not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2701092A1 (de) * | 1976-01-16 | 1977-07-28 | Leo Sa Lab | Verfahren zur herstellung von reinem insulin |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE1966573A1 (de) | 1973-04-26 |
DE1966573C3 (de) | 1979-08-30 |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |