DE2701092A1 - Verfahren zur herstellung von reinem insulin - Google Patents

Description

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2701

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Verfahren zur Herstellung von reinem Insulin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Insulin ohne oder mit nur geringfügiger Antigenizität sowie von Präparaten, die derartiges Insulin enthalten.

Fs wird jetzt allgemein angenommen, dass die Antigenizität von Insulinpräparaten in überwiegendem Ausmass auf Verunreinigungen in den Präparaten zurückzuführen ist, während früher die Auffassung vertreten wurde, dass die Insulinantikörper vom Insulin selbst erzeugt wurden.

Diese Verunreinigungen können insulinfremde Begleitproteine aus dem Pancreas, Proinsulin, welches das Vorstadium des Insulins ist, Jntermediarinsulin, nas Diner, Arginininsulin, Äthylesterinsulin, Desamidoinsulin, das in verschiedenen Graden deamidiert ist, und andere Insulinmodifikationen sein.

Fs wird deshalb angestrebt, Insulinpräparate herzustellen, die aus reinem Insulin, sogenanntem Monokomponent -Insulin, bestehen, das von allen Verunreinigungen und Begleitstoffen jeglicher Art befreit ist.

Zu diesem Zweck ist vorgeschlagen worden, auf herkömmliche Weise hergestelltes amorphes oder kristallines Insulin einer weitgehenden zusätzlichen Reinigung, z.E. durch Gelfiltration und/oder Ionenaustauscherbehandlung, zu unterwerfen.

Bei den resultierenden hochgereinigten Insulinen ist zwar ein starker Rückgang der Antigenizität, aber noch keine vollständige Beseitigung derselben zu verzeichnen. Der Grund dafür ist zweifellos, dass trotz der Reinigungsstufen ständig vom Insulin abweichende Stoffe in den gereinigten Präparaten enthalten sind.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass ein Teil der im Insulin enthaltenen Verunreinigungen während der eigentlichen Gewinnung des Insulins gebildet werden, weil die gewöhnlicherweise benutzten Verfahren u.a. sowohl eine Zersetzung des Insulins als auch Aggregationen bewirken.

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Das Insulin, wie es in den Pancreasdrüsen angehäuft ist, aus denen das Insulin gewonnen wird, ist das reine Monomer (mit einem Molekülgewicht um 6.000), und es wird durch die konventionelle Extraktion mit angesäuertem wässrigem 60-ßO^-igem Alkohol auch als solches extrahiert. Bei der weiteren herkömmlichen Aufbereitung, die u.a. eine Abscheidung des Fettes durch Vakuumdestillation des Extrakts bei 2 5-3O⁰C umfasst, wobei der Alkohol abdampft und sich ein wässriger Extrakt mit stark herabgesetztem Alkoholgehalt ergibt, wird das Monomer jedoch Bedingungen ausgesetzt, die eine Zersetzung - u.a. als Folge der schädlichen Einwirkung derjenigen Enzyme, die ihre Wirkung in wässriger Lösung (Lösungen mit einem Alkoholgehalt von weniger als 50$) entfalten können, in alkoholischer Lösung (Lösungen mit über 50^ Alkoholgehalt) jedoch unwirksam sin^ - Aggregationen usw. herbeiführen.

Der Erfindung gemäss wird deshalb vorgeschlagen, die Insulinherstellung in einer solchen Weise vorzunehmen, ^ass das Insulin im Anschluss an die Extraktion aus den Pancreasdrüsen zwecks Erzielung des endgültigen Endproduktes nur Bedingungen ausgesetzt wird, die von einer solchen Art sind, dass sie nicht die Bildung von Zersetzungsprodukten, Aggregaten usw. herbeiführen.

Insulin ist in einem angesäuerten alkoholischen Extrakt mit einem Alkoholgehalt von ca. 55 bis ß0 Vol.-% Alkohol sehr leicht löslich, und in einem derartigen Extrakt bildet bei sachgemässer Behandlung das Insulin weder mit sich selbst noch mit Verunreinigungen im alkoholischen Extrakt Aggregate.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Insulin mit einem derartigen wässrigen angesäuerten Alkohol aus den Pancreasdrüsen extrahiert, und wird während der gesamten weiteren Aufbereitung bis zur Isolation des Endproduktes, z.B. durch Fällung und gegebenenfalls Kristallisation, in reinem und gelöstem Zustand,ohne Phasenänderung, qehalten.

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Es können selbstverständlich andere Extraktionsflüssigkeiten als angesäuerter wässriger Alkohol Anwendung finden, in denen das Insulin leicht löslich ist und we- ^er mit sich selbst noch mit Verunreinigungen im Extrakt Aggregate bildet, z.B. wässriges Aceton.

Bei dem beschriebenen Verfahren handelt es sich nicht um eine Reinigung des Insulins selber, sondern um eine Reinigung des gewonnenen Insulinextrakts von den von der Extraktion herrührenden gelösten Verunreinigungen und von Fett, bis der Extrakt nur noch das reine Insulin enthält.

Das Verfahren kann z.B. folgendermassen ausgeführt werden:

Ö5 Zerkleinerte gefrorene Pancreasdrüsen werden mit 6O-8O Vol.-^igem Äthylalkohol, der beispielsweise mit Salzsäure auf einen pH-Wert von ca. 3 angesäuert worden ist, extrahiert. fJach der Abscheidung der Pancreasmasse wird der pH-Wert des Extrakts auf ca. 8 eingestellt, wodurch gewisse vom Insulin verschiedene Proteine ausgefällt und abgeschieden werden. Danach wird der pH-Wert wieder auf ca. 3 gesenkt.Statt diese sogenannte pH 8-Fällung zu benutzen, kann man den Extrakt,mit einen pH-Wert von 2-3/lurch eine Ultra- und Hyperfiltrationsanlage, vgl. die nachstehenden Ausführungen, unter Anwendung einer geeigneten Membran schicken, die die genannten Proteine, u.a. Enzyme, zurückhält.

Der resultierende klare Extrakt wird in einer speziellen Fettausfrieranlage auf eine Temperatur von ca. -30⁰C bis -45°C, vorzugsweise ca. -35° C, abgekühlt, wobei das Fett in Form kompakter Fettkristalle mit kleiner Oberfläche auskristallisiert. Diese Fettkristalle werden bei derselben niedrigen Temperatur beispielsweise durch Zentrifugierung abgeschieden. Bei dieser niedrigen Temperatur von -30⁰C bis -45°C und bei dem konstanten hohen Alkoholgehalt von 60-00 Vol.-# ergeben sich keine schädlichen Einwirkungen auf das Insulin, so wie es bei der herkömmlichen Beseiti-

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gung des Fettes durch Vakuumdestillation bei 25-3O°C mit abnehmendem Alkoholgehalt des Extraktes der Fall ist. Bezüglich näherer Einzelheiten dieser Entfernung von Fett durch Ausfrieren wird auf die deutsche Patentanmeldung Nr. P 25.3I.ÖO/f.l verwiesen.

Nach dieser schonenden Abscheidung des Fettes liegt ein relativ grosses Volumen von Fett befreiten Extrakts vor, und dieses grosse Volumen muss reduziert werden, was ebenfalls auf eine das Insulin schonende Weise zu geschehen hat.

Man kann Gelfiltration und/oder Ionenaustauschbehandlung benutzen. Erfindungsgemäss wird jedoch folgende Weise bevorzugt:

Es findet eine Ultra- und HyperfiltrationsanlageAnwendung, die nach der Membranmethode arbeitet, ein sogenanntes umgekehrtes Osmosesystem (vgl. z.B. USA-Patent Nr. 3.623.6IO).

Bei Anwendung dieser Methode kann durch geeignete Wahl 5 der Membrantypen gleichzeitig mit einer Einengung des Flüssigkeitsvolumens eine Trennung des Insulins von den im Extrakt befindlichen Verunreinigungen und Begleitstoffen e^aicht werden, und zwar sowohl von Stoffen mit grösserem Molekül als auch von Stoffen mit kleinerem Molekül als das Insulin hat. Man erreicht nicht nur eine Abscheidung unerwünschter Stoffe pancreatischer Herkunft, die in gelöster Form im Extrakt enthalten sind, sondern auch aller eventueller anderer Moleküle nichtpancreatischer Herkunft, dex-en Grosse von der Grosse des Insulinmoleküls verschieden ist und die auf Grund von Fehlern oder Fahrlässigkeiten in den Schlachthöfen mit zwischen die gelieferten Pancreasdrüsen und damit auch mit in den Extrakt gekommen sind.

Die zu diesem Zeitpunkt erfolgende Abscheidung des weit überwiegenden Teiles dieser Moleküle, die teils grosser und teils kleiner als die Insulinmoleküle sind, durch Ultra- und Hyperfiltration ist von entscheidender Wichtigkeit für die Erzielung des Monokomponent-Insulins, da diese Verunreinigungen hier zu einem Zeitpunkt abgeschieden werden,

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zu welchem sie sich in Lösung befinden und noch keine Möglichkeit gehabt haben, auf das gelöste Insulin schädlich einzuwirken, u.a. auf Grund der niedrigen Temperatur bei den vorausgehenden Prozessstufen.

Der vom Fett befreite klare Extrakt wird durch die Ultrafiltrationsvorrichtung gepumpt, bei der die Möglichkeit gegeben ist, den Extrakt unter ausreichender Kühlung zu behandeln, z.B. bei einer Temperatur zwischen ca. +10⁰C und -10°C, vorzugsweise zwischen 0⁰C und -10⁰C, und bei einem Druck von 2-20 Atmosphären, vorzugsweise 6 Atmosphären, indem ein solcher Membrantyp gewählt wird, dass die unerwünschten grossen Moleküle so weit hinab bis zur Grosse des Insulinmoleküls wie möglich abgeschieden werden. Als Membrane können z.B. GRX-6 oder GRX-7 (Polysulphonmembrane hergestellt vom De Danske Sukkerfabriker A/S) verwendet werden. Die grossen Moleküle bleiben im Konzentrat zurück, während sich das Insulin und die Verunreinigungen, deren Moleküle kleiner sind als das des Insulins, im Permeat befinden. Dieses Permeat wird daraufhin durch die Hyperfiltrationsvorrichtung geschickt, in die ein solcher Membrantyp eingesetzt ist, der den grössten Teil der unerwünschten Moleküle durchlässt, die kleiner sind als das Molekül des Insulins, und so weit hinauf bis zur Grosse des Insulinmoleküls wie möglich. Als Membrane können z.B. GR8-P oder 930 (Celluloseazetat), beide vom De Danske Sukkerfabriker A/S hergestellt, verwendet werden.

Das Insulin bleibt im Konzentrat zurück. Man kann den Ausgangsextrakt beliebig weit einengen, z.B. auf 1/5 bis 1/40 des ursprünglichen Volumens. Das Konzentrationsverhältnis zwischen Alkohol und Wasser bleibt dasselbe wie im Ausgangsextrakt.

Die in der Ultra- und Hyperfiltrationsanlage benutzten Membranen müssen konzentrierte alkoholische Lösungen mit z.B. 62% Alkohol aushalten können. Es können z.B. - ausser Membranen aus Polysulphonen und Celluloseazetat hergestellt wie oben erwähnt - Membranen aus anderen Polymeren, wie

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gewisse Polyamide, verwendet werden.

Bezüglich der Konstruktion der Ultra- und Hyperfiltrationsanlage kann z.B. auf folgende Patentschriften verwiesen werden: das USA-Patent Nr. 3.872.015, das briti-

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J.

sehe Patent Nr. 1.390.671 und das schweizerische Patent

ΙβΟ Nr. 542.639, in denen Ausführungsformen der Anlage und/ oder Teile derselben beschrieben sind. Die Erfindung ist selbstverständlich keineswegs an die Anwendung von Anlagen irgendeiner bestimmten Konstruktion gebunden.

Das erzielte Konzentrat, welches praktisch das gesamte

1Ö5 Insulin aus dem Rohextrakt enthält, ist transparent, aber es ist auf Grund der Einengung stärker gefärbt als der Rohextrakt. Die Farbstoffe werden mit z.B. 62% Alkohol über Membranen ausgewaschen, die das Insulin zurückhalten, aber die Farbstoffe durchlassen. Das gesamte Waschflüssigkeitsvolumen gelangt zusammen mit den Farbstoffen in das Permeat, während das Volumen des Konzentrats unverändert bleibt.

Gleichzeitig mit den Farbstoffen werden die im Extrakt befindlichen Salze ausgewaschen, die von der Extraktion der Pancreasdrüsen herrühren.

Die ganz wenigen gelösten Verunreinigungen, die dann immer noch im insulinhaltigen Extrakt enthalten sind, können zweckmässigerweise mit Hilfe von Ionenaustauschern, und zwar sowohl Kationenaustauschern als auch Anionenaustauschern, abgeschieden werden. Die Abscheidung kann zwar auch mit Hilfe von Molekülsieben, z.B. dem Sephadex G-50, das von der Pharmacia Fine Chemicals AB in Uppsala, Schweden, hergestellt wird, oder anderer geeigneter Abscheidungsmethoden erfolgen, aber die Anwendung von Ionenaus- tauschern wird bevorzugt.

Ionenaustauschprozesse zum Reinigen von Insulin sowohl nach der Säulenmethode als auch nach der Batch-Methode sand bekannt, und die Anwendung der Säulenmethode ist am weitesten verbreitet.

Es ist jedoch nicht bekannt, diese Methoden auf einen konzentrierten alkoholischen und von Fett befreiten Rohinsulinextrakt anzuwenden. Die herkömmlichen alkoholischen Rohinsulinextrakte, die noch das gesamte Fett in gelöster

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Form enthalten, werden, insbesondere bei Anwendung Her Säulenmethode,die Ionenaustauscher mit den Verunreinigungen, den Farbstoffen und dem Fett so stark verunreinigen, dass die Ionenaustauscher bereits nach ein- oder zweimaligem Adsorbieren und Eluieren so sehr verschmutzt werden, dass sie sich nur schwierig wieder reinigen und regenerieren lassen, um wieder zum Abtrennen des Insulins geeignet zu sein.

Bei Ionenaustausch- oder Molekülsiebprozessen ist es eine Bedingung, dass der zu verarbeitende Extrakt vom Fett und teilweise auch von Farbstoffen, Begleitproteinen und anderen Verunreinigungen so weit befreit ist, dass die Ionenaustauscher und die Molekülsiebpräparate regeneriert und gereinigt werden können, so dass sie für längere Zeit voll brauchbar bleiben, da ihre Anwendung sonst 23O wirtschaftlich prohibitiv sein wird.

Eine solche ausreichende und notwendige Reinigung wird gerade durch die oben beschriebene Methode zum Vorreinigen des alkoholischen Rohinsulinextrakts erreicht, die eine Auskristallisation des Fettes bei so niedriger Temperatur wie um -40⁰C und eine Beseitigung eines Teiles der Farbstoffe sowie eines wesentlichen Teiles der Moleküle, die grosser und kleiner sind als das Insulinmolekül, und zwar bis in die unmittelbare Nähe der Grosse des Insulinmoleküls, durch Ultrafiltration in einer nach dem Prinzip der umgekehrten Osmose arbeitenden Anlage umfasst.

Man kann die meisten erhältlichen Typen von Ionenaustauschern anwenden, hierunter Ionenaustauscher auf Harzbasis und Cellulosebasis sowie die bekannten Sephadex-Ionenaustauscher SP und (JaE, welche Kationenaustauscher 2^5 bzw. Anionenaustauscher sind und aus modifleierten, vernetzten . Dextranketten mit einem dreidimensionalen Netzwerk aus Polysaccharid bestehen (Herstellerin: Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden). Die Ionenaustauscher SP-Sephadex C-25 (Kationenaustauscher) und QAE-Sephadex A-25 (Andonenaustauscher) werden bevorzugt.

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Man kann zwischen Säulentrennung und Batch-Trennung mit Ionenaustauschern wählen oder gegebenenfalls auch beide Methoden anwenden.

Es hat sich erwiesen, dass bei der Ausübung des erfindungsgemässen Verfahrens in grösserem industriellen Massstab die Batch-Methode enorme Vorteile als Methode zum mittelfeinen bis feinen Reinigen bietet, das zwischen der Abtrennung und Einengung nach dem Prinzip der umgekehrten Osmose und einer chromatographischen Reinigung mit Hilfe von

26O Ionenaustauschern nach der Säulenmethode eingeschaltet wird. Die Batch-Trennung ist eine sehr schnelle Technik, und die Methode führt keine technischen Schwierigkeiten durch Quellen oder Schrumpfen des Ionenaustauschers mit sich. Die Trennung mit Hilfe des Ionenaustauschers kann durch eine Bindung der Verunreinigungen durchgeführt werden, die nur dem Insulin erlaubt, in Lösung zu verbleiben. Nachdem der Ionenaustauscher im gewählten geeigneten Puffer beim isoelektrischen Punkt des Insulins (pH=5,2) ins Gleichgewicht gebracht worden ist, wird der konzentrierte, vorgereinigte

27o Rohinsulinextrakt bei pHs5,2 mit dem Ionenaustauscher in Kontakt gebracht, das Ganze z.B. 2 Stunden lang umgerührt und das Gemisch anschliessend filtriert. Alle Verunreinigungen sind dann an den Ionenaustauscher gebunden, während sich das reine Insulin in gelöstem Zustand im alkoholischen Filtrat befindet,weil sich das Insulin bei seinem isoelektrischen Punkt nicht an den Ionenaustauscher bindet.

Der Vorteil dieses Prozesses besteht darin, dass das Insulin nicht aus dem Ionenaustauscher eluiert zu werden braucht und dass der Insulinextrakt unmittelbar nach dem

2βΟ Filtrieren in die nächste Prozessstufe überführt werden kann.

Die Ionenaustauscher werden auf bekannte Weise regeneriert.

Umgekehrt kann man auch das Insulin und die übrigen Proteine an den Ionenaustauscher binden und anschliessend dadurch in Fraktionen eluieren, dass man das Gemisch in ei-

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nem Puffer mit höherer Ionenkonzentration oder geändertem pH-Wert resuspendiert. Bei Anwendung dieser letztgenannten Methode kann der Verlust an Insulin kleiner gehalten werden als bei Anwendung der erstgenannten Methode, weshalb die letztgenannte Methode bevorzugt wird.

Die Methode lässt sich in ihren Hauptzügen z.B. folgendermassen ausführen:

3OC g trockenes SP-Sephadex C-2 5 wurden U& Stunden lang in 1000 ml Puffer, der aus 0,1 molarer Essigsäure (HAc) in 62^ Äthanol bestand und einen pH-Wert von 3,0 hatte, gequollen. Der Puffer wurde mehrere Male ausgewechselt. Das geouollene SP-Sephadex wog 720 g.

1000 ml Extrakt,der durch Osmose 1Ofach konzentriert 3OO worden war und einen Insulingehalt von lßOOO I.E. hatte, wurde auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und in einem rotierenden Behälter (12 U/min) mit der Hälfte des gequollenen Ionenaustauschers zwecks Adsorption 1 1/2 Stunden lang umgerührt. Nach Filtrieren unter Vakuum wurde die Adsorption des Filtrats mit der zweiten Hälfte des Ionenaustauschers (36O g des gequollenen Ionenaustauschers) fortgesetzt, und zwar ebenfalls 1 1/2 Stunden lang. Das Filtrat hatte einen Insulingehalt von 2ÖÖ I.E., was einem Verlust von 1,6^ hei der Adsorption entsprach. Es hat sich erwiesen, dass sich durch die Anwendung einer derartigen Doppeladsorption der Insulinverlust auf ein Drittel des Verlustes bei einer Einzeladsorption reduzieren liess.

Dann wurde der Puffer gegen einen Puffer ausgewechselt, der bestand aus: 1000 ml 0,1 molarer HAc in 62% Äthanol, pH«3,0, mit 0,075 mol NaCl. Die Verunreinigungen wurden durch 2 Stunden langes Rühren eluiert, das Insulin wurde dagegen nicht eluiert.

Nach dem Filtrieren wurde der Puffer gegen folgenden Puffer ausgewechselt: 1000 ml 0,1 molares Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) in 62$ Äthanol, pH=8,0. Dann wurde das Insulin aus dem Ionenaustauscher SP eluiert. Der Insulingehalt war 17000 I.E. bei einem Verlust beim Eluie-

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ren von 4%. Der Gesamtverlust betrug 5,6f.

Zwecks Beseitigung der an den Ionenaustauscher anhaftenden Insulinreste wurde der Ionenaustauscher zweimal gewaschen.

Bei der Polyacrylamddgel-Elektrophorese (mit 15$ Polyacrylamid) zeigten sich 4, zum Teil schwächere, Bänder über dem Insulinband, während sich unter dem Insulinband keine

33O Bänder befanden. Dies besagt, dass das teilweise gereinigte Insulin während des Herstellungsprozesses nicht deamidiert worden war. Es war monodesamidoinsulinfrei, was bei der Herstellung von Insulin etwas ganz Neues ist.

Der Ionenaustauscher wurde nach dem Eluieren und Waschen unter langsamem Rühren 2-3 Stunden lang mit 62$~igem Äthanol behandelt, dem 0,2-0,3 mol NaCl zugesetzt waren. Anschliessend wurde der Ionenaustauscher mit Gleichgewichtspuffer pH»3 regeneriert und war dann vollständig rein, krei- deweiss und für die Behandlung der nächsten Batch bereit.

Der Batch-Prozess kann mit Vorteil in einer Vorrichtung spezieller Konstruktion, d.h. Y-förmiger Ausgestaltung n:it regelbarer Drehzahl, ausgeführt werden. Diese Form gewährleistet eine -sehr effektive und schonende Behandlung des Ionenaustauschers bei der Adsorption und beim Eluieren, und gleichzeitig wird der Verlust sowohl bei der Adsorption als auch beim Eluieren auf ein Minimum herabgesetzt. Der gesamte Prozess kann ablaufen, ohne dass der Ionenaustauscher aus der Vorrichtung, die mit einer Filtriereinrichtung und einem Vakuumbehälter zum schnellen Abfiltrieren der Flüssigkeit vom Ionenaustauscher versehen ist, entnommen wird.

Der Prozess besteht aus folgenden Teilprozessen:

1) Adsorption des Insulins und eventuell anderer Proteine aus dem konzentrierten Rohinsulinextrakt an den Ionenaustauscher bei pH-3, und zwar in zwei Stufen mit einer zwischenliegenden Vakuumfiltration.

2) Vakuumfiltration und Entfernung des proteinfrei-

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3) Zweieiiges >'.sei . η des Ionenaustauschers mit 62%-j gem Äthanolpuffer, pH=3, und Abfiltrieren der Waschflüssigkeiten.

4) Eluieren der Verunreinigungen (2 Stunden, 12

U/min) mit einem Puffer von pH=3 und einer Ionenkonzentration von 0,075 mcl NaCl.

5) Filtration der Eluationsflüssigkeit mit den darin enthaltenen Verunreinigungen.

6) Zweimaliges Waschen des Ionenaustauschers mit 62^-igem Äthanolp-uffer, pH=3, und Filtration.

7) Eluieren des Insuline vvit einem Puffer aus 0,1 molarem Tris in 62^-igem Äthanol, pH=Ö. Das gesamte Gemisch, die Eluationsflüssigkeit und der Ionenaustauscher, muss mit Tris auf pH^eß eingestellt werden. Der pH-Wert des Ionenaustauschers betrug 3.

Ö) Filtration der das Insulin enthaltenden Eluationsf lüssigkeit.

9) Zweimaliges Waschen des Ionenaustauschers zwecks

^D Entfernung am Ionenaustauscher anhaftender Insulinreste.
10) Reinigung und Regeneration des Ionenaustauschers.

Der gesamte Produktionszyklus von 1-9 dauert 12 Stunden und die Reinigung und Regeneration des Ionenaustauschers Stunden - d.h. der Prozess nimmt insgesamt 16 Stunden in Anspruch.

Der Eluationsextrakt aus Phase 7 kann nach Einstellung des pH-Wertes und der Ionenkonzentration direkt nach den bekannten Methoden auf in Säulen eingefüllte Kationen- oder Anionenaustauscher aufgegeben werden. Dieser Prozess wird am besten mit programmgesteuerten Säulen mit automatischer Fraktionierung ausgeführt, wobei man den zentralen Teil der Insulinkurve entnimmt, der dann das reine Insulin enthält,

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welches bei Her Polyacrylamid-Elektrophorese mit 15$ Polyacrylamid nur 1 Band aufweist.

Aus dem konzentrierten insulinhaltigen Eluat von der letzten Säule kann das Insulin auf übliche Weise gewonnen werden, d.h. durch Verdünnung der Lösung und anschliessende Fällung, z.B. durch Hinzusetzen von Zinkionen.

Erfindungsgemäss hat sich jedoch erwiesen, dass es nicht notwendig ist, vor der Fällung eine Verdünnung des hochkonzentrierten wässrigen alkoholischen Extrakts vorzunehmen. Die Fällung kann direkt mit z.B. Zinkionen erfolgen, wenn diese dem Extrakt in der Kälte, z.B. bei -30° bis -45°C zugesetzt werden.

Man kann dem Filtrat eine Zinkacetatlösung zusetzen und dann die Lösung 24 Stunden lang in einem Gefrierraum bei -35⁰C stehenlassen. Hierdurch wird das Insulin aus der z.B. 62^-igen alkoholischen Lösung quantitativ ausgefällt. Das ausgefällte Insulin wird durch Zentrifugieren abgetrennt, z.B. mit Aceton gewaschen und getrocknet. Falls erwünscht, kann es später kristallisiert werden.

Das nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Insulin ist, wie bereits erwähnt, reines Monokomponent-insulin, welches nur den Gehalt einer einzelnen Komponente zeigt, wenn es durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (DISC PAGE) unter Anwendung einer 15^-igen Konzentration des Polyacrylamide analysiert wird. (Bezüglich des generellen Prinzips dieser Methode kann auf das Ann. N. Y. Acad. Sei.,121, Seite 321-349 und 404-427 (1964) verwiesen werden.)

Insulin der hier beschriebenen Reinheit ist bisher noch nicht hergestellt worden.

In den britischen Patentschriften Nr. 1.2Ö5.O23 und I.285.O24 ist die -Herstellung von Insulin hoher Reinheit beschrieben. In den Patentschriften ist angegeben, dass das gereinigte Insulin bei Polyacrylamidgel-Elektrophorese

im wesentlichen nur eine einzelne Komponente - aufweist. Dieses Insulin enthält jedoch immer noch ^eine kleine Menge Desamidoinsulin, und es zeigt bei Polyacryl-

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amidgel-Elektrophorese unter Anwendung eines Gels mit Polyacrylamid zwei Bänder, und zwar ausser dem Monoinsulinband noch ein Desamidoinsulinband.

Durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter Anwendung von 7 1/2$ Polyacrylamid, · - ':..: ■■■ ... ' . lässt sich dagegen ein kleiner Gehalt an Desamidoinsulin nicht feststellen. -Bei dieser Konzentration erzielt man keine vollständige Trennung der einzelnen Komponenten, sondern u.a. ein Zusammenschmelzen von Insulin und Monodesamidoinsulin in einem einzigen Band, wo sich bei der Anwendung von 15% Polyacrylamid zwei Bänder zeigen würden.

Es hat sich erwiesen, dass das nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Insulin im Gegensatz zu den bekannten hochgereinigten Insulinen, in welchen sich z.B. während des Aufbewahrens zusätzliche kleine Mengen Desamidoinsulin bilden, ausserordentlich stabil ist. Man weiss nicht, worauf dies zurückzuführen ist, aber der Grund hierfür kann möglicherweise sein, dass die hergestellten Insuline trotz der weitgehenden Reinigung immer noch Spuren von Stoffen ' enthalten, die eine zersetzende Wirkung auf das Insulin haben.

Das nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Insulin zeigt keine derartige Zersetzung, was somit auf die vollständigere Entfernung aller derjenigen Stoffe zurückzuführen sein kann, die eine andere Molekülgrösse als das Insulin haben.

Aus dem beschriebenen reinen Insulin können auf beliebige bekannte Weise Insulinpräparate hergestellt werden, z.B. durch Lösen und/oder Suspendieren des Insulins, in amorpher und/oder kristalliner Form, in einem wässrigen Medium, das 46O sich zur Injektion, Infusion oder IiHplantationstechnik eignet.

Die in den obigen Ausführungen beschriebenen neuen Verfahrensstufen, d.h. die Abtrennung von Verunreinigungen aus — - -einem fettfreien insulinhsltigen Extrakt⁴ffliT Hilfe von umgekehrter Osmose und Fällung des Insulins aus einer stark

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konzentrierten alkoholischen Lösung in der Kälte, können selbstverständlich nicht nur in der beschriebenen Kombination von Verfahrensstufen verwendet werden. Das Prinzip, die Abtrennung von Verunreinigungen aus einem fettfreien insulinhaltigen Extrakt durch umgekehrte Osmose, kann in beliebigem Zusammenhang Anwendung finden, und das Lösungsmittel braucht selbstverständlich nicht ein stark konzentrierter wässriger Alkohol zu sein, sondern kann ein beliebiges geeignetes Lösungsmittel für Insulin sein. Die Fällung in der Kälte kann auf jede hochkonzentrierte Lösung von Insulin in einem organischen Lösungsmittel Anwendung finden, ganz gleich wie diese hergestellt worden ist.

Die Erfindung besteht deshalb nicht nur aus der hier beschriebenen Kombination von Verfahrensstufen, sondern auch 4Ö0 aus den beiden genannten neuen Stufen allein.

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Claims (12)

1. Patentansjjr ü_c_h_e

   .1. Monoinsulin, welches so weitgehend gereinigt ist, dass es nur eine einzelne Komponente aufweist, wenn

   es durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter Anwendung eines Gels analysiert wird, das 15$ Polyacrylamid enthält.
2. 2. Verfahren zur Herstellung eines Insulins nach Anspruch 1, nach welchem ein Extrakt von Insulin aus Pancreasdrüsen hergestellt und dieser Extrakt zu reinem Insulin aufbereitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung in der Weise erfolgt, dass das Insulin während des gesamten Aufbereitungsprozesses bis zur endgültigen Gewinnung in gelöstem Zustand, ohne Phasenänderung, gehalten wird, während die unerwünschten Stoffe vom Beginn bis zum Ende des Prozesses aus den verschiedenen benutzten Lösungsmitteln entfernt werden.
3. 3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet _t dass der insulinhaltige Extrakt einer Behandlung zwecks Beseitigung des Fettes unterworfen wird, die aus einer Abkühlung des Extrakts auf eine Temperatur unter -25⁰C besteht, wonach das ausgeschiedeneFett entfernt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet _t dass der Extrakt nach der Beseitigung des Fettes unter Anwendung umgekehrter Osmose konzentriert wird, wobei gleichzeitig e.'.ne Beseitigung von Verunreinigungen, deren Moleküle grosser als das insulinmolekül sind, und von Verunreinigungen, deren Moleküle kleiner als das Insulinmolekül sind, erfolgt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet _t dass das insulinhaltige Konzentrat von der umgekehrten Osmose zwecks Entfernung von Farbstoffen und Salzen aus dem Konzentrat in einer Osmosevorrichtung gewaschen wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das gereinigte Konzentrat einer zusätzlichen Reinigung durch Ionenaustausch unter Bedingungen unterworfen wird, unter

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   welchen das Insulin in Flüssigkeitsphase verbleibt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Ionenaustausch in Form eines Batch-Prozesses vorgenommen wird.
8. Ö. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die.insulinhaltige Flüssigkeitsphase von dem Batch-Ionenaus~ tausch einer oder mehreren Reinigungen durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie unter derartigen Bedingungen unterworfen wird, dass das Insulin in Flüssigkeitsphase verbleibt.
9. 9. Verfahren nach jedem der Ansprüche 2-8, dadurch gekennzeichnet, dass das Insulin durch Fällung mit Metallionen, vorzugsweise Zinkionen, unter starker Abkühlung auf z.B. -30⁰C bis -45⁰C aus der konzentrierten gereinigten Lösung gewonnen wird.
10. 10.Verfahren bei der Herstellung gereinigten Insulins aus einem fettfreien insulinhaltigen Extrakt, gekennzeichnet durch die Stufe, die aus der Abscheidung von sowohl Stoffen, deren Molekül grosser als das Insulinmolekül ist, als auch Stoffen, deren Molekül kleiner als das Insulinmolekül ist, durch umgekehrte Osmose aus dem Extrakt besteht.
11. 11. Verfahren bei der Gewinnung von Insulin aus einer hochkonzentrierten Lösung desselben in einem organischen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass man die konzentrierte Lösung auf eine Temperatur von ca. -30⁰C bis -45°C abkühlt und das Insulin dadurch aus dem abgekühlten Extrakt ausfällt, dass man diesem Metallionen, vorzugsweise Zinkionen zusetzt.
12. 12. Insulinpräparat, dadurch gekennzeichnet, dass es Monoinsulin nach Anspruch 1 in amorpher und/oder kristalliner Form, gelöst und/oder suspendiert in einem wässrigen isotonischen Medium enthält, das zur Injektion, Infusion oder Implantationstechnik geeignet ist.

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    PATENTANWÄLTE

    DR.-INQ. H. FINCKE, D I P L. - I N β. Η. BOHR DIPU-INO. S. STAEGLR, CR. ι·ι. n«t R. KNiISSl