DE2531804A1

DE2531804A1 - Verfahren zur herstellung von insulin

Info

Publication number: DE2531804A1
Application number: DE19752531804
Authority: DE
Inventors: Jose Adrian Dr Aguas; Gregorio Ramon Dr Cebrian; Willy Henry Jensen
Original assignee: Laboratorios Leo SA
Current assignee: Laboratorios Leo SA
Priority date: 1974-07-19
Filing date: 1975-07-16
Publication date: 1976-02-05
Also published as: ES439569A1; CA1041902A; FR2278678B1; DK142313B; FR2278678A1; NL7508461A; DK309175A; DK142313C; SE7508191L; GB1503919A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-I N G. H. Fl N CKE DIPL.-ING. H. BOHR DIPI—ING. S. STAEGER

Patentanwalt· Dr. Find· . Bohr ■ Stoeger - 8 MOndun 5 · MOIIerstroBe 3)

BMDWCHENB, l6 . Juli 1975 Müllerstraße 31 Fernruf: (089)'2i6060 Telegramme: Claim» München 523903 claim d

Mopp.No-A 224 - Dr.K/hö Bitte in der Antwort angeben

LABORATORIOS LEO S.A. Madrid - SPANIEN

"Verfahren zur Herstellung von Insulin"

PRIORITÄT: 19. Juli 197²I - Großbritannien

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus einem Insulin und Fett enthaltenden Pancreas-Extrakt.

Das übliche Verfahren zur Herstellung von Insulin besteht darin, daß man zerkleinerte gefrorene Pancreasdrüsen

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mlt Hilfe von wäßrigem angesäuertem Äthanol oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert, andere unlösliche Proteine als Insulin durch Einstellung des pH des Extrakts auf annähernd 8 ausfällt und abfiltriert und den pH des Piltrats auf annähernd 3 einstellt. Hierbei wird ein klarer Extrakt erhalten, der aus 60 bis 65 iigem wäßrigem Äthanol besteht, das eine kleine Menge Säure, Insulin und andere Proteine, Enzyme und Verunreinigungen wie auch 5 bis 10 % Fette enthält. Dieses Fett, welches im Äthanol aufgelöst wird, ist eine sehr unangenehme Komponente, welches bei den klassischen Produktionsverfahren große Schwierigkeiten macht. Die übliche weitere Behandlung des Extrakts besteht darin, daß der Extrakt unter Vakuum bei einer Temperatur von 25 bis 30⁰C zur Entfernung und Rückgewinnung von Alkohol eingedampft wird, wobei sich das Fett allmählich abscheidet, während das Lösungsmittel vom Rohextrakt abgdampft wird. Das Fett wird nach der Vakuumdestillation entfernt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugierung oder Dekantation und anschließende Filtration. Das verbleibende wäßrige Medium wird weiter verarbeitet, um gereinigtes Insulin zu gewinnen .

Bei diesem Verfahren wird das Fett nicht nur unvollständig entfernt, sondern es übt auch zusammen mit anderen Stoffen während der Vakuumdestillation auf das Insulin einen zersetzenden Effekt aus, und zwar insbesondere gegen Ende dieser Maßnahme, wo die Alkoholkonzentratlon niedrig 1st. Die heftige Bewegung in der Flüssigkeit während der Vakuumdestillation beschleunigt außerdem die Reaktion zwischen dem Fett und dem Insulin, wodurch die Ausbeute verringert wird.

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Neben den oben erwähnten Nachteilen des klassischen Verfahrens fallen auch andere wirtschaftliche Nachteile ins Gewicht, da Vakuumdestillationsanlagen kostspielig im Kauf und im Betrieb und in der Wartung sind.

Der Erfindung lag nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein anderes Verfahren zur Entfernung von Fett aus einem Pancreasextrakt zu schaffen, beispielsweise aus einem Extrakt, der in der oben angegebenen Weise hergestellt worden ist,oder irgendeinem anderen Extrakt, der Insulin und Fett enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß der Insulin und Fett enthaltende Rohextrakt, bei welchem es sich beispielsweise um einen wäßrigen alkoholischen Extrakt handeln kann, auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der das gesamte Fett ausgefriert und sich abscheidet, worauf der Extrakt vom Fett, beispielsweise durch Filtration, unter fortlaufender Kühlung abgetrennt wird. Der Rohextrakt kann nach der Ausfällung bei pH 8, beispielsweise bei pH 2-3 abgekühlt werden, aber es gibt keinen Grund das Abkühlen nicht bei pH 8 durchzuführen. In diesem Fall wird die Abkühlung vorzugsweise direkt nach der Abtrennung der pH 8-Ausfällung durchgeführt. Die Ausbeute ist jedoch" beim letzteren Verfahren etwas kleiner. Dagegen wird die Einstellung auf pH 3 eingespart.

Durch dieses Verfahren kann dae Fett leicht und vollständig bereits in einer der ersten Phasen abgetrennt werden, wobei schädliche Einflüsse auf das Insulin durch das Fett in den nachfolgenden Prozessen vermieden werden.

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Das Abkühlen und das Abscheiden des Fetts können einfach dadurch ausgeführt werden, daß man den klaren Extrakt in der Kälte aufbewahrt, beispielsweise bei -30 bis -35°C. Dies hat zur Folge, daß das Fett ausgefriert und im Extrakt von festen kristallinen Teilchen suspendiert wird.

Nachdem der Extrakt ohne Rühren ungefähr 12 bis 2¹J st in cer Kälte aufbewahrt worden ist, wobei die Dauer von der Temperatur und der Menge des Extrakts abhängt, wird der Extrakt filtriert oder zentrifugiert. Wenn der Extrakt während der Abkühlung gerührt wird, dann kann die Zeit beträchtlich kürzer sein, beispielsweise nur 2 bis 3 st. Das Abfiltrieren oder Zentrifugieren wird in der Kälte ausgeführt, wobei die Filtriervorrichtung oder der Zentrifugalabscheider die gleiche Temperatur wie der Extrakt aufweist. Auf diese Weise wird das Fett vollständig vom Extrakt abgetrennt. Wenn die Abtrennung außerhalb eines kühlen Raums ausgeführt wird oder wenn die Filtriervorrichtung von außen in den kühlen Raum gebracht wird und noch normale Raumtemperatur aufweist, dann schmilzt ein Teil des Fetts und geht in den filtrierten Extrakt.

Wenn gemäß der obigen Vorschrift gearbeitet wird, dann werden häufig Kristalle mit ziemlich verschiedenen Größen gebildet, die darüberhinaus oftmals noch eihe ziemlich lose Struktur aufweisen und cLeshalb eine verhältnismäßig große Menge Mutterflüssigkeit einschließen.

Es ist erwünscht, daß die Auskristallisierung des Fetts in solcher Weise durchgeführt wird, daß gleichförmige kompakte Kristalle gebildet werden, die ein verhältnismäßig großes Verhältnis von Volumen zu Oberfläche aufweisen.

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Krlstalle mit der gleichen oder Im wesentlichen der gleichen Größe sind leichter von der Mutterflüssigkeit, beispielsweise durch Filtration, abzutrennen, als Kristalle mit unterschiedlicher Größe. In der kompakten Form Ist verhältnismäßig wenig Mutterflüssigkeit eingeschlossen.

Die Kristallform kann, wie es in der Technik bekannt ist, dadurch beeinflußt werden, daß man die Xühl- und Kri3tallisaticnsbedingungen entsprechend wählt.

CemäS einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsger-ä.ien Verfahrens werden deshalb die Kühl- und Kristallisationsbedingungen, beispielsweise die Kühlzeit, der pH-Wert des Extrakts und die Rührgeschwindigkeit, so eingestellt, daß gleichförmige, kompakte Fettkristalle mit einem verhältnismäßig großen Verhältnis von Volumen zu Überfläche erhalten werden.

Wenn ein wäßriger alkoholischer Extrakt behandelt wird, dann zeigt sich, daß ein pH von annähernd 3 während der Abkühlung die beste Kristallisation und die beste Ausbeute gibt.

Es hat sich im allgemeinen auch gezeigt, daß die Abkühlzeit, d.h. die Zeit bis zum Erreichen der Endtenperatur von -30 bis -35°C, mindestens 2 bis wobei die Flüssigkeit gerührt wird.

von -30 bis -35°C, mindestens 2 bis 3 st betragen soll,

Rühren oder anderes Bewegen der abgekühlten Flüssigkeit sind erwünscht. Die Rührgeschwindigkeit darf jedoch nicht zu hoch sein, beispielsweise sollte sie 50 U/min nicht überschreiten. Wenn eine zu heftige Rührung verwendet wird, dann können die gebildeten Kristalle zer-

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kleinert werden. Das Abkühlen des Extrakts und das Ausscheiden des Fetts und das Abtrennen des Extrakts vom Fett können vorzugsweise kontinuierlich ausgeführt werden.

Es kann Jede geeignete Kristallisationsvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens verwendet werden. Beispielsweise sollen hier vertikale oder horizontale Kühlzylinder mit Kühlmantel und Abkratzern oder mit einen Kühler in Form eines Rotationskörpers erwähnt werden, welche die Übersättigung erzeugen und die Bildung von Kristallkeimen verursachen, wobei diese Einrichtungen mit ein oder mehreren Kristallisationsräumen verbunden sind, worin die gebildeten Kristallkeime zur gewünschten Größe und Form wachsen. Vom Kristallisation· raum oder vom letzten Kristallisationsraum fließt die Kristalle enthaltende Flüssigkeit zur Filtriervorrichtung oder Zentrifuge.

Das Insulin kann aus dem fettfreien Extrakt in herkömmlicher Weise abgetrennt werden.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert, welches im Labormaßstab ausgeführt wurde.

BEISPIEL

100 g Pancreasextrakt wurden in einen 600 ml fassenden Becher, der mit einem Rührer ausgerüstet war, eingebracht. Der Extrakt war in der üblichen Weise dadurch erhalten worden, daß Schweinepancreasdrüsen mit Hilfe von wäßrigem Äthanol, das mit Salzsäure angesäuert war,

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extrahiert wurden, die anderen Proteine als Insulin durcn Einstellung des pH des Extrakts auf 8 ausgefällt und abfiltriert wurden und der pH auf 2,8 eingestellt wurde. Der Becher wurde in einen Gefrierschrank gestellt, wcrin der Inhalt in drei Stunden auf -55°C abgekühlt wurde, währenddessen mit einer Geschwindigkeit vcn 50 U/mln gerührt wurde. Hierdurch wurden kon.pakte Kristallaggregate mit einem großen Verhältnis von Volumen zu Oberfläche gebildet, die leicht von der Mutterflüssigkeit abfiltriert werden Die Filtration wurde in einem gekühlten Filtriertrichter (-37°C, 11 cm Filter - Munktell No. 00) ausgeführt, wobei Vakuum verwendet wurde, das durch eine Wasserstrahlpumpe erzeugt wurde.

Der enorme Vorteil, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird, springt unmittelbar ins Auge: Einmal wird das Fett zu einer sehr frühen Stufe entfernt und zum anderen wird es bei einer sehr niedrigen Temperatur von beispielsweise -30 bis -35°C entfernt. Bei dieser niedrigen Temperatur besitzen die schädlichen Komponenten des Fetts keinen oder nur einen geringen schädlichen Einfluß auf das Insulin, im Vergleich zu dem abbauenden Effekt, der während der Vakuumdestillation bei einer Temperatur von annähernd 25⁰C auftritt. Es besteht also ein Temperaturunterschied von 55 bis 60⁰C zwischen dem bekannten Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es ist zweifellos auch wichtig, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren die Entfernung des Fetts durch Gefrieren mit nur einer geringen oder gar keiner Bewegung des Extrakts erfolgt, wogegen bei der Vakuumdestillation durch das Sieden eine heftige Bewegung verursacht wird, was die Zersetzung des Insulins beschleunigt.

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E3 ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß es möglich ist, bereits zu einer sehr frühen Stufe des Verfahrens zur Herstellung von Insulin zwischen den verschiedenen und neueren Verfahren zur Reinigung von Insulin zu wählen, wie z.B. Gelfiltration und Ionenaustausch, ohne daß das Risiko besteht, daß die hierfür zu verwendenden teuren Produkte durch Fett verunreinigt werden. Solche Reinigungsverfahren können überhaupt nicht oder höchstens nur sehr schwierig zu einer frühen Stufe eines herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von Insulin verwendet werden.

PATENTANSPRÜCHE:

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Abtrennung von Insulin aus einem Insulin und Fett enthaltenden Pancreasextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei welcher das Fett ausgefriert und sich abscheidet, worauf der Extrakt vom Fett unter fortlaufender Kühlung abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, caß es auf einen wäßrigen alkoholischen Rchextrakt angewendet wird, der einer Ausfällung von Proteinen bei pH 8 unterworfen worden ist und dessen pH gegebenenfalls auf annähernd 3 eingestellt worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt auf -30 bis -35⁰C abgekühlt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühl- und Kristallisationsbedingungen, beispielsweise die Kühlzeit, der pH-Wert des Extrakts und die Rührgeschwindigkeit, so eingestellt werden, aaß gleichförmige, kompakte Fettkristalle mit einem verhältnismäßig großen Verhältnis von Volumen zu Oberfläche erhalten werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abkühlzeit bis zum Erreichen der Endtemperatur von beispielsweise -30 bis -35°C mindestens 2 bis 3 st beträgt.

PATENTMiWXLTC

OMH*. H. FINCKE. DIR..-INO.H. iOMW OtPL-ING. S. STAEGiR

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