NO149875B - Fremgangsmaate for fremstilling av insulin - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av insulin Download PDFInfo
- Publication number
- NO149875B NO149875B NO770119A NO770119A NO149875B NO 149875 B NO149875 B NO 149875B NO 770119 A NO770119 A NO 770119A NO 770119 A NO770119 A NO 770119A NO 149875 B NO149875 B NO 149875B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- insulin
- extract
- solvent
- impurities
- fat
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 252
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 129
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 129
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 38
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 22
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 8
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 38
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 108700022849 desamido- insulin Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012675 alcoholic extract Substances 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 2
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- -1 "Sephadex" G-50 Chemical compound 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010049082 Pancreatic mass Diseases 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000135 prohibitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
- C07K14/625—Extraction from natural sources
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling
av insulin med ingen eller meget liten antigenisitet.
Det er nu almindelig antatt at antigenisiteten hos insulinpreparater i overveiende grad skyldes urenheter i pre-paratene, mens man tidligere har vært av den oppfatning at insulinantistoffene ble fremkalt av insulinet som sådant. Disse urenheter kan være insulinfremmede ledsageproteiner fra pankreas, proinsulin, som er insulinets forstadium, intermediær insulin, dimeren, arginininsulin, etylesterinsulin, desamidoinsulin, deamidert i forskjellig grad, og andre insulinmodifikasjoner.
Man bestreber seg derfor på å fremstille insulinpreparater som består av rent insulin, såkalt monokomponent-insulin, fritt for urenheter og ledsagestoffer av enhver art.
Man har for dette formål foreslått å underkaste amorft eller krystallinsk insulin fremstilt på konvensjonell måte, en vidtgående ytterligere rensning, f.eks. ved gelfiltrering og/eller ionebytterbehandling, se f.eks. de britiske patenter 1.285.023 og 1.285.024 og det tilsvarende norske patent 132.638.
De resulterende høyrensede insuliner viser en sterk nedgang i antigenisitet, men ikke en fullstendig fjernelse av denne. Årsaken til dette er utvilsomt at det til tross for rensnings-trinnene stadig finnes stoffer som er forskjellig fra insulin i de rensede preparater.
Oppfinnelsen er basert på den erkjennelse at en del
av de urenheter som finnes i insulin, dannes under selve ut-vinningen av insulinet, idet de vanlig anvendte prosesser bl.a. medfører nedbrytning av insulinet og aggregatdannelser. Insulinet slik det befinner seg akkumulert i de pankreas-kjertler hvor insulin utvinnes fra, er den rene monomer (med molekylvekt omkring 6.000), og det ekstraheres som sådan ved den konvensjonelle ekstraksjon med sur vandig 60-80%ig alkohol. Ved den videre konvensjonelle opparbeidelse, som bl.a. omfatter fettseparering ved vakuumdestillasjon av ekstrakten ved 25-30°C hvorved alkohol avdamper og det fås en vandig ekstrakt med sterkt nedsatt alkoholinnhold, utsettes monomeren imidlertid for betingelser som med-fører nedbrytning, bl.a. som følge av skadelig innvirkning av de enzymer som kan utfolde sin virkning i vandig oppløsning (oppløsninger med et alkoholinnhold under 50%) mens de ikke er virksomme i alkoholisk oppløsning (oppløsninger med over 50%
alkohol), aggregatdannelser osv.
Ifølge oppfinnelsen tilstrebes det derfor å utføre insulin-fremstillingen på en slik måte at insulinet fra ekstraksjonen fra pankreas-kjertlene, for å oppnå det endelige sluttprodukt, kun utsettes for betingelser som er av en slik art at de ikke vil medføre dannelse av nedbrytningsprodukter, aggregater osv, og spesielt på en slik måte at man unngår betingelser som de som hersker ved den vanlig anvendte vakuum-inndampning som med-fører at insulinet til slutt befinner seg i sterkt vandig opp-løsning ved ca. 35°C.
Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles insulin som er renset i en slik grad at det kun viser en enkelt komponent når det analyseres ved polyakrylamidgel-elektroforese under anvendelse av en gel inneholdende 15% polyakrylamid. Ved fremgangsmåten fremstilles en ekstrakt av insulin fra pankreas-kjertler, hvilken ekstrakt i flere trinn opparbeides til det rene insulin, og fremgangsmåten karakteriseres ved at opparbeidelsen finner sted ved temperaturer som ikke vesentlig overstiger romtemperatur, og skjer på den måte at insulinet under hele opparbeidelsesprosessen inntil den endelige utvinning holdes i oppløst tilstand i et oppløsningsmiddel, bestående av en blanding av vann og et organisk oppløsningsmiddel, hvilken blanding inneholder minst 50% organisk oppløsningsmiddel, eller suksessivt holdes oppløst i flere forskjellige oppløsningsmidler av denne type, idet de ikke ønskede stoffer fra begynnelsen til slutten av prosessen, fjernes fra de forskjellige anvendte opp-løsningsmidler, inntil det rene insulin foreligger i et for urenheter befridd oppløsningsmiddel, hvorpå insulinet om ønsket utfelles fra oppløsningsmidlet, om ønsket som i og for seg kjent med metallioner, fortrinnsvis sinkioner.
I de tidligere nevnte britiske patenter 1.285.023 og 1.285.024 og norsk patent 132.638 beskrives fremstilling av insulin av høy renhet fra på konvensjonell måte fremstilt amorft eller krystallinsk insulin. I de to sistnevnte patenter nevnes også at man som utgangsmateriale kan anvende den insulinholdige saltkake, som dannes ved den konvensjonelle fremstilling av insulin, men at dette materiale er mindre egnet. Det angis i britisk patent 1.285.023 at det rensede insulin ved polyakrylamidgelelektroforese viser i det vesentlige en enkelt komponent. Dette insulin inneholder imidlertid stadig en mindre mengde desamidoinsulin, og det vil ved polyakrylamidgelelektroforese under anvendelse av en gel med 15% polyakrylamid vise to bånd, nemlig foruten monoinsulinbåndet et monodesamido-insulinbånd.
Et mindre innhold av desamidoinsulin vil derimot ikke kunne konstateres ved polyakrylamidgelelektroforese under anvendelse av 7,5% polyakrylamid. Ved dette innhold oppnår man ikke en fullstendig separering av de enkelte komponenter, men bl.a. en sammensmelting av insulin og monodesamidoinsulin i ett bånd der det vil vise seg to bånd med 15% polyakrylamid.
Desamidoinsuliner vil ved den konvensjonelle opparbeidelse av insulinekstrakter bl.a. dannes under vakuuminn-dampningen, ved hvis slutt insulinet befinner seg i vandig miljø ved forholdsvis høy temperatur. Når først monodesamidoinsulinet er dannet, er det svært vanskelig å skille fra insulinet, og det vil derfor også være til stede i det amorfe eller krystallinske insulin som anvendes som utgangsmateriale ved fremgangsmåten ifølge de britiske patenter 1.285.023 og 1.285.024 og norsk patent 132.6 38. Dette må ansees for grunnen til dets tilstedeværelse i det rensede insulin oppnådd ved nevnte fremgangsmåte.
Insulin er f.eks. meget lett oppløselig i en sur alkoholisk ekstrakt med fra 55 til 80 volum% alkohol, og i en slik ekstrakt vil insulinet, ved hensiktsmessig behandling, ikke danne aggregater med seg selv eller med urenheter i den alkoholiske ekstrakt.
Ved en foretrukket utførelsesform for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ekstraheres insulinet fra pankreas-kjertlene med en slik vandig sur alkohol, og insulinet bevares i ren og oppløst tilstand under den videre opparbeidelse, inntil isoler-ingen av sluttproduktet, f.eks. ved utfeining og eventuelt krystallisasjon..
Det kan naturligvis anvendes andre ekstraksjonsvæsker
enn sur vandig alkohol hvor insulin er lett oppløselig, og hvor det ikke vil danne aggregater med seg selv eller med urenheter i ekstrakten, f.eks. vandig aceton.
Ved foreliggende fremgangsmåte er det ikke tale om en rensning av selve insulinet, men det skjer en rensning av den utvundne insulinekstrakt for de oppløste urenheter og fett som stammer fra ekstraksjonen inntil det rene insulin befinner seg
alene tilbake i ekstrakten.
Fremgangsmåten kan f.eks. utføres på følgende måte:
Findelte, frosne pankreas-kjertler ekstraheres med
60-80 volum% etylalkohol surgjort med f.eks. saltsyre til ca.
pH 3. Efter fraskillelse av pankreasmassen innstilles ekstraktens pH-verdi på ca. 8, hvorved visse proteiner forskjellig fra insulin, utfelles og frasepareres. pH-verdien nedsettes igjen til ca. 3. I stedet for å anvende denne såkalte pH 8 feining kan man sende ekstrakten med pH 2-3 gjennom et ultra- og hyperfiltreringsanlegg, jfr. nedenfor, under anvendelse av en passende membran som holder tilbake de nevnte proteiner, bl.a. enzymer.
Den resulterende klare ekstrakt nedkjøles i et spesielt fettutfrysningsanlegg til en temperatur på -30 til -45°C, fortrinnsvis ca. -35°C, hvorved fettet utkrystalliserer i kompakte fettkrystaller med liten overflate. Disse frasepareres, f.eks. ved sentrifugering, ved samme lave temperatur. Ved denne lave temperatur på -30 til -45°C og ved det konstante høye alkoholinnhold på 60-80 volum% skjer det ingen skadelig innvirkning på insulinet slik tilfellet er ved den konvensjonelle fettfjerhelse ved vakuumdestillasjon ved 25-30°C med synkende alkoholinnhold i ekstrakten.
Angående nærmere enkeltheter ved denne fettfraskillelse ved utfrysing henvises til dansk patentsøknad nr. 3091/75
(patent nr. 142.313).
I stedet for ved utfrysning, kan generende fett fjernes fra den insulinholdige ekstrakt ved ionebytting ved lav temperatur (ved eller under romtemperatur) med en kationebytter, f.eks. SP-"Sephadex", til hvilken insulinet bindes. Insulinet og andre proteiner med en ladning motsatt kationebytterens bindes til denne ved hjelp av elektrostatiske krefter, men vil stadig befinne seg i oppløsning. Efter vask av ionebytteren for fjernelse av fastklebende fett elueres insulinet med et passende elueringsmiddel. Såvel vaskevæske som elueringsmiddel skal inneholde minst 50% organisk oppløsningsmiddel.
Efter den skånsomme fraseparering av fettet foreligger et relativt stort volum ekstrakt befridd for fett; dette store volum skal reduseres, hvilket likeledes skal skje på en måte som er skånsom for insulinet.
Man kan benytte gelfiltrering og/eller ionebytterbehandling, men ifølge oppfinnelsen foretrekkes følgende måte: Det anvendes et ultra- og hyperfiltreringsanlegg som arbeider efter membranmetoden, såkalt omvendt osmosesystem (jfr. f.eks. US-patent 3.623.610).
Ved anvendelse av denne metode kan det ved passende
valg av membrantyper samtidig med konsentrering av væskevolumet, oppnås en separering av insulin fra urenheter i ekstrakten og ledsagestoffer, såvel stoffer med større molekyler enn insulinets, som stoffer med mindre molekyler. Man får ikke bare fjernet uønskede stoffer av pankreas-opprinnelse som finnes oppløst i ekstrakten, men også alle eventuelle andre molekyler av ikke-pankreas-opprinnelse med størrelse forskjellig fra insulinets, som ved feiltagelse eller uaktsomhet måtte være kommet med i pankreas-leveransene fra slakteriene, og derved også med i ekstrakten.
Frasepareringen på dette tidspunkt av langt største-delen av disse molekyler, dels større og dels mindre enn insulinet, ved ultra- og hyperfiltreringen, er av avgjørende betydning for å oppnå monokomponent-insulinet, idet disse urenheter her frasepareres på et tidspunkt hvor de befinner seg i oppløsning, og hvor de ikke har hatt mulighet for å innvirke skadelig på det oppløste insulin.
Den fettfrie klare ekstrakt pumpes gjennom ultra-filtreringsapparatet som er forsynt med tilstrekkelig avkjølings-mulighet for ekstrakten, f.eks. ved en temperatur på mellom ca. +10 og -10°C, fortrinnsvis mellom 0 og -10°C og ved et trykk på 2-20 atmosfærer, fortrinnsvis 6 atmosfærer, idet det velges en slik membrantype, f.eks. GRX-6 eller GRX-7 (polysulfon-membraner), at de store uønskede molekyler frasepareres så langt ned til insulinmolekylet som mulig. De store molekyler blir tilbake i konsentratet mens insulin og urenhetene med mindre molekylstørrelse enn insulinet går i permeatet (dvs. det som ikke holdes tilbake). Dette ledes derefter gjennom hyper-filtreringsapparatet hvor det er valgt en membrantype, f.eks. GR8-9 eller 930 (celluloseacetat), som fraseparerer største-parten av de uønskede molekyler mindre enn insulinet, og så
nær opptil insulinmolekylet som mulig. Insulinet blir tilbake i konsentratet. Man kan konsentrere utgangsekstrakten så sterkt
det ønskes, f.eks. til 1/5 til 1/40 av det opprinnelige volum. Konsentrasjonsforholdet alkohol:vann forblir det samme som i utgangsekstrakten.
De i ultra- og hyperfiltreringsanlegget anvendte membraner skal kunne motstå konsentrerte alkoholiske oppløsninger med f.eks. 62% alkohol. Det kan f.eks. - foruten membraner av polysulfoner og celluloseacetat som nevnt ovenfor - anvendes membraner fremstilt fra andre polymerer, f.eks. visse polyamider.
Angående konstruksjonen av ultra- og hyperfiltreringsanlegg kan f.eks. henvises til følgende patentskrifter:
US-patent 3.872.015, engelsk patent 1.390.671 og sveitsisk
patent 542.639 hvor det er beskrevet utførelsesformer for anlegget og/eller deler derav.
Det oppnådde konsentrat, som inneholder praktisk talt alt insulinet fra råekstrakten, er gjennomsiktig, men sterkere farvet enn råekstrakten på grunn av konsentreringen. Farge-stoffene utvaskes med f.eks. 62% alkohol over membraner som holder insulinet tilbake, men tillater farvestoffene å passere membranene. Hele det anvendte vaskevolum går sammen med farve-stoff ene i permeatet, mens konsentratets volum forblir uendret.
Samtidig med utvasking av farvestoffene utvaskes saltene i ekstrakten som stammer fra ekstraksjonen av pankreas.
De forholdsvis få oppløste urenheter som stadig er tilbake i den insulinholdige ekstrakt, kan hensiktsmessig frasepareres ved hjelp av ionebyttere, såvel kationebyttere som anionebyttere. Frasepareringen kan også skje ved hjelp av molekylsikt, f.eks. "Sephadex" G-50, fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige og andre egnede kjente separerings-metoder, men anvendelsen av ionebyttere foretrekkes.
Ionebytningsprosesser for rensing av insulin såvel efter kolonnemetoden som efter den satsvise metoden er kjente, i ganske særlig grad kolonnemetoden.
Det er imidlertid ikke kjent å anvende disse metoder
på en konsentrert alkoholisk råinsulinekstrakt fri for fett.
De konvensjonelle alkoholiske råinsulinekstrakter med at fettet oppløst vil, særlig ved kolonnemetoden, tilsmusse ionebytterne i en slik grad med urenhetene, farvestoffene og fettet, at ionebytterne efter én eller to gangers adsorpsjon og eluering vil bli så urene at de meget vanskelig vil kunne renses og regenereres
så de igjen kan anvendes til separering av insulinet.
Ved ionebyttings- eller molekylsiktprosesser er det
en betingelse at den behandlede ekstrakt er renset for fett,
og delvis også for farvestoffer, uvedkommende proteiner samt andre urenheter, i så stor utstrekning at ionebytterne og molekyl-siktstoffene kan regenereres og renses så de blir fullt brukbare gjennom lengere tid, idet deres anvendelse ellers vil bli økonomisk prohibitiv.
En slik tilstrekkelig og nødvendig rensing oppnås nettopp ved den ovenfor beskrevne metode til for-rensing av den alkoholiske råinsulinekstrakt, som omfatter utkrystallisering av fettet ved så lav temperatur som omkring -40°C og fjernelse ved ultra-filtrering gjennom et omvendt osmoseanlegg av en del av farvestoffene samt en vesentlig del av molekyler større enn og mindre enn insulinmolekylet, nær inntil insulinmolekylets størrelse.
Man kan anvende de fleste tilgjengelige typer ionebyttere, derunder ionebyttere på harpiksbasis og cellulosebasis samt de kjente "Sephadex" ionebyttere SP og QAE som er henholdsvis kationebyttere og anionebyttere og er modifiserte tverrbundne' dekstrankjeder med et tredimensjonalt nettverk av polysakkarid. Ionebytterne SP-"Sephadex" C-25 (kationebytter) og QAE-"Sephadex" A-25 (anionebytter) foretrekkes.
Man kan velge mellom kolonnekromatografi og satsvis separering på ionebytterne, eller eventuelt anvende begge metoder.
Den satsviæmetoden har vist seg å ha enorme fordeler
i større industriell drift som en mellomfin til fin rensing som skytes inn mellom den omvendte osmoseseparering og -konsentrering og en kromatografisk rensing med ionebytter efter kolonnemetoden. Satsvis separering er en meget hurtig teknikk, og metoden for-årsaker ingen tekniske vanskeligheter som følge av svelning eller krymping av ionebytteren. Separering på ionebytter kan gjennom-føres ved binding av urenhetene, og tillater at kun insulinet forblir i oppløsning. Når ionebytteren er bragt i likevekt i den valgte egnede buffer ved insulinets isoelektriske punkt,
pH 5,2, bringes den konsentrerte for-rensede råinsulin-ekstrakt ved pH 5,2 i kontakt med ionebytteren og det hele omrøres, f.eks.
i 2 timer, hvorefter blandingen filtreres. Alle urenhetene er bundet til ionebytteren, mens det rene insulin befinner seg i oppløst tilstand i det alkoholiske filtrat, da insulinet ved
sitt isoelektriske punkt ikke bindes til ionebytteren.
Fordelen ved denne prosess er at insulinet ikke behøver å elueres fra ionebytteren, og at insulinekstrakten umiddelbart efter filtreringen kan gå videre til neste prosesstrinn.
Ionebytterne regenereres på kjent måte.
Omvendt kan man også binde insulinet og de øvrige proteiner på ionebytteren og derefter eluere i fraksjoner ved å resuspendere blandingen i en buffer av høyere ionestyrke eller endret pH. Ved denne siste metode kan det oppnås mindre tap av insulin enn ved den førstnevnte metode, hvorfor den siste foretrekkes.
Metoden kan i hovedtrekkene f.eks. utføres på følgende må te: 300 g tørr SP-"Sephadex" C-25 ble svellet i 2 døgn i 1000 ml buffer, 0,1 molar eddiksyre (HAc) i 62% etanol, pH 3,0. Bufferen ble utskiftet flere ganger. Den svellede SP-"Sephadex" veiet 720 g.
1000 ml ekstrakt, konsentrert 10 ganger fra osmosen med et innhold av 18000 i.e. insulin, ble justert til pH 3,0,
og ble omrørt i en roterende beholder (12 omdr./min.) i 1 1/2 time med halvdelen av den svellede ionebytter for adsorpsjon. Efter filtrering under vakuum ble adsorpsjonen av filtratet fortsatt på den siste halvdel av ionebytteren (360 g svellet), likeledes i 1 1/2 time. Væsken på toppen viste et insulininnhold på 288 i.e. svarende til 1,6% tap ved adsorpsjonen.
En slik dobbeltadsorpsjon har vist seg å nedsette tapet til en tredjedel av tapet ved en enkeltadsorpsjon.
Nu ble det skiftet til buffer: 1000 ml 0,1 molar HAc
i 62% etanol, pH 3,0 med 0,075 mol NaCl. Urenheter ble eluert ved omrøring i 2 timer, mens insulinet ikke ble eluert.
Efter filtrering ble buffer skiftet: 1000 ml 0,1 molar tris(hydroksymetyl)aminometan (tris) i 6 2% etanol, pH 8,0, hvorefter ionebytteren SP ble eluert for insulinet. Insulininnhold 17000 i.e. med et tap ved elueringsprosessen på 4%. Samlet tap 5,6%.
Ionebytteren ble vasket to ganger for å fjerne insulin-rester heftet til ionebytteren.
Ved polyakrylamidgelelektroforese (med 15% polyakrylamid) viste det seg fire, tildels svakere, bånd over insulinbåndet, mens det ikke fantes noen bånd under insulinbåndet. Dette vil si at det delvis rensede insulin ikke er blitt deamidert under fremstillingsprosessen. Det er fritt for monodesamidoinsulin, hvilket er noe helt nytt ved fremstillingen av insulin.
Ionebytteren ble efter elueringen og vaskingen behandlet under langsom omrøring med 6 2% etanol tilsatt 0,2-0,3 mol NaCl i 2-3 timer. Derefter ble ionebytteren regenerert med likevekts-buffer pH 3, og den var nu fullstendig ren, kritthvit og klar til neste sats.
Den satsvise prosessen kan med fordel utføres i et apparat av særskilt konstruksjon, Y-formet med regulerbart omdreinings-tall. Denne form gir en meget effektiv og skånsom behandling av ionebytteren ved adsorpsjonen og elueringen, samtidig med at tapet såvel ved adsorpsjonen som ved elueringen nedsettes til et minimum. Hele prosessen kan finne sted uten at ionebytteren fjernes fra apparatet som er forsynt med filtrerings-anordning og vakuumbeholder for hurtig filtrering av væsken fra ionebytteren.
Prosessen består av følgende delprosesser:
1) Adsorpsjon på ionebytteren, pH 3, av insulinet og eventuelt andre proteiner fra den konsentrerte råinsulin-ekstrakt i 2 trinn med mellomliggende vakuumfiltrering. 2) Vakuumfiltrering og fjernelse av den proteinfrie ekstrakt.
3) Vasking av ionebytteren 2 ganger med 62% etanolbuffer,
pH 3, og frafiltrering av vaskevæskene.
4) Eluering av urenheter med buffer pH 3, ionestyrke 0,075 mol NaCl, 2 timer, 12 omdr./min.
5) Filtrering av elueringsvæsken med inneholdte urenheter.
6) 2 gangers vasking av ionebytteren med 62% etanolbuffer, pH 3. Filtrering. 7) Eluering av insulinet med buffer 0,1 molar tris i 62% etanol, pH .8. Hele blandingen, elueringsvæske og ionebytter, skal justeres til pH 8 med tris. Ione-bytterens pH var 3.
8) Filtrering av elueringsvæsken inneholdende insulinet.
9) 2 ganger vasking av ionebytteren for fjernelse av insulin-rester heftet til ionebytteren.
10) Rensing og regenerering av ionebytteren.
Den samlede produksjonssyklus fra 1-9 tar 12 timer + rensning og regenerering av ionebytteren 4 timer - ialt 16 timer.
Elueringsekstrakten fra fase 7 kan efter justering av
pH og ionestyrke tilføres direkte på katione- eller anionebytter efter de kjente metoder på kolonner. Denne prosess foregår best på programstyrte kolonner med automatisk fraksjonering hvor man tar ut den sentrale del av insulinkurven som nu inneholder det rene insulin som kun oppviser 1 bånd ved polyakrylamidelektroforese med 15% polyakrylamid.
Fra det konsentrerte insulinholdige eluat fra den siste kolonne kan insulinet utvinnes på vanlig måte, dvs. ved fortynning av oppløsningen og påfølgende utfelning, f.eks. ved tilsetning av sinkioner.
Det har imidlertid ifølge oppfinnelsen vist seg at det ikke er nødvendig å foreta en fortynning av den høykonsentrerte vandige alkoholiske ekstrakt før utfelning. Ekstrakten kan felles direkte med f.eks. sinkioner når tilsetningen herav skjer kaldt, f.eks. ved -30 til -45°C.
Man kan således sette en sinkacetatoppløsning til filtratet, og derefter sette oppløsningen i 24 timer i fryserom ved -35°C. Herved utfelles insulinet kvantitativt fra den f.eks. 62%ige alkoholiske oppløsning. Det utfelte insulin sentrifugeres fra, vaskes f.eks. med aceton og tørres. Om ønsket kan det senere krystalliseres.
Det ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte insulin
er som nevnt rent monokomponent-insulin som kun viser en enkelt komponent når det analyseres ved polyakrylamidgelelektroforese (DISC PAGE) under anvendelse av en 15% konsentrasjon av polyakryl-amidet (angående det generelle prinsipp ved denne metode henvises til Ann. N.Y. Acad. Sei., 121, side 321-349 og 404-427 (1964)).
Det ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte insulin
har vist seg å være overordentlig stabilt i motsetning til de kjente høyrensede insuliner, hvor det f.eks. ofte under opp-bevaringen dannes ytterligere små mengder desamidoinsulin. Man vet ikke hva dette skyldes, men grunnen kan muligens være at
de fremstilte insuliner til tross for den vidtgående rensing stadig inneholder spor av stoffer som virker nedbrytende på insulinet.
Det ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte insulin viser ikke en slik nedbrytning, noe som kan skyldes den mer fullstendige fjernelse av alle stoffer med annen molekylstørrelse enn insulinet.
Av det beskrevne rene insulin kan det fremstilles insulinpreparater på vilkårlig kjent måte, f.eks. ved oppløsning og/eller suspendering av insulinet i amorf og/eller krystallinsk form, i et vandig medium egnet til injeksjon, infusjon eller implanteringsteknikk.
Claims (4)
1. Fremgangsmåte til fremstilling av insulin som er renset i en slik grad at det kun viser en enkelt komponent når det analyseres ved polyakrylamidgel-elektroforese under anvendelse av en gel inneholdende 15% polyakrylamid, ved hvilken fremgangsmåte det fremstilles en ekstrakt av insulin fra pankreaskjertler, hvilken ekstrakt i flere trinn opparbeides til det rene insulin, karakterisert ved at opparbeidelsen finner sted ved temperaturer som ikke vesentlig overstiger romtemperatur, og skjer på den måte at insulinet under hele opparbeidelsesprosessen inntil den endelige utvinning holdes i oppløst tilstand i et oppløsningsmiddel bestående av en blanding av vann og et organisk oppløsningsmiddel, hvilken blanding inneholder minst 50 volum% organisk oppløsningsmiddel, eller suksessivt holdes oppløst i flere forskjellige oppløsningsmidler av denne type,
idet de ikke ønskede stoffer, fra begynnelsen til slutten av prosessen, fjernes fra de forskjellige anvendte oppløsningsmidler, inntil det rene insulin foreligger i et oppløsningsmiddel som er befridd for urenheter, hvorpå insulinet om ønsket utfelles fra oppløsningsmidlet, om ønsket som i og for seg kjent med metallioner, fortrinnsvis sinkioner.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som oppløsningsmiddel eller oppløsningsmidler anvendes vandig etylalkohol eller vandig acton med minst 50% av det organiske oppløsningsmiddel;
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den insulinholdige ekstrakt efter å ha vært underkastet en behandling for fjernelse av fett, fortrinnsvis bestående i avkjøling av ekstrakten til en temperatur under -25°C og påfølgende fraskillelse av de utskilte fettkrystaller, konsentreres ved omvendt osmose under anvendelse av to forskjellige membraner, hvorav den ene fraseparerer urenheter med større molekyler enn monoinsulinet som går i permeatet, og den annen fraseparerer urenheter med mindre molekyler enn monoinsulinet som blir tilbake i konsentratet, hvorpå det insulinholdige konsentrat underkastes ytterligere rensning ved ionebytting og/eller gelfiltrering, eventuelt efter forutgående vask i et osmoseapparat for fjernelse av farvestoffer og salter fra konsentratet.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3 for utfelling av insulinet, karakterisert ved at metall-ionene tilsettes den konsentrerte rensede oppløsning under sterk avkjøling, f.eks. til -30 til -45°C.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1740/76A GB1581824A (en) | 1976-01-16 | 1976-01-16 | Preparation of insulin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO770119L NO770119L (no) | 1977-07-19 |
NO149875B true NO149875B (no) | 1984-04-02 |
NO149875C NO149875C (no) | 1984-07-11 |
Family
ID=9727172
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO770119A NO149875C (no) | 1976-01-16 | 1977-01-14 | Fremgangsmaate for fremstilling av insulin |
NO822985A NO822985L (no) | 1976-01-16 | 1982-09-03 | Fremgangsmaate for fremstilling av et insulinpreparat. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO822985A NO822985L (no) | 1976-01-16 | 1982-09-03 | Fremgangsmaate for fremstilling av et insulinpreparat. |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
AT (2) | AT364717B (no) |
AU (1) | AU514888B2 (no) |
BE (1) | BE850387A (no) |
CA (1) | CA1112639A (no) |
DE (1) | DE2701092A1 (no) |
DK (1) | DK14177A (no) |
EG (1) | EG13113A (no) |
ES (1) | ES455065A1 (no) |
FI (1) | FI64508C (no) |
FR (1) | FR2338250A1 (no) |
GB (1) | GB1581824A (no) |
IE (1) | IE45013B1 (no) |
NL (1) | NL7700455A (no) |
NO (2) | NO149875C (no) |
SE (1) | SE445972B (no) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK311477A (da) * | 1977-07-08 | 1979-01-09 | Leo Lab | Fremgangsmaade ved fremstilling af rent insulin |
US4459226A (en) * | 1982-02-26 | 1984-07-10 | Eli Lilly And Company | Process for recovering insulin |
BG65045B1 (bg) * | 2001-12-03 | 2007-01-31 | "Софарма" Ад | Метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин |
RU2603752C2 (ru) | 2011-02-01 | 2016-11-27 | Ново Нордиск А/С | Очистка инсулина |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1966573C3 (de) * | 1969-08-07 | 1979-08-30 | Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, Kopenhagen | Verfahren zur Reinigung von Insulin |
GB1503919A (en) * | 1974-07-19 | 1978-03-15 | Leo Sa Lab | Recovery of insulin |
-
1976
- 1976-01-16 GB GB1740/76A patent/GB1581824A/en not_active Expired
-
1977
- 1977-01-10 AT AT0007977A patent/AT364717B/de not_active IP Right Cessation
- 1977-01-11 IE IE44/77A patent/IE45013B1/en unknown
- 1977-01-12 DE DE19772701092 patent/DE2701092A1/de not_active Withdrawn
- 1977-01-13 SE SE7700322A patent/SE445972B/xx unknown
- 1977-01-13 AU AU21317/77A patent/AU514888B2/en not_active Expired
- 1977-01-14 ES ES455065A patent/ES455065A1/es not_active Expired
- 1977-01-14 NO NO770119A patent/NO149875C/no unknown
- 1977-01-14 DK DK14177A patent/DK14177A/da not_active Application Discontinuation
- 1977-01-14 FI FI770112A patent/FI64508C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-01-14 BE BE174084A patent/BE850387A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-01-14 CA CA269,730A patent/CA1112639A/en not_active Expired
- 1977-01-14 FR FR7701077A patent/FR2338250A1/fr active Granted
- 1977-01-15 EG EG30/77A patent/EG13113A/xx active
- 1977-01-17 NL NL7700455A patent/NL7700455A/xx not_active Application Discontinuation
-
1980
- 1980-11-06 AT AT0546880A patent/AT366578B/de not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-09-03 NO NO822985A patent/NO822985L/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL7700455A (nl) | 1977-07-19 |
NO149875C (no) | 1984-07-11 |
AU2131777A (en) | 1978-07-20 |
DK14177A (da) | 1977-07-17 |
DE2701092A1 (de) | 1977-07-28 |
AT366578B (de) | 1982-04-26 |
IE45013B1 (en) | 1982-06-02 |
ATA546880A (de) | 1981-09-15 |
FR2338250A1 (fr) | 1977-08-12 |
ATA7977A (de) | 1981-04-15 |
FI770112A (no) | 1977-07-17 |
FR2338250B1 (no) | 1980-04-04 |
AU514888B2 (en) | 1981-03-05 |
NO770119L (no) | 1977-07-19 |
EG13113A (en) | 1983-03-31 |
CA1112639A (en) | 1981-11-17 |
IE45013L (en) | 1977-07-16 |
BE850387A (fr) | 1977-05-02 |
AT364717B (de) | 1981-11-10 |
SE445972B (sv) | 1986-08-04 |
FI64508B (fi) | 1983-08-31 |
SE7700322L (sv) | 1977-07-17 |
FI64508C (fi) | 1983-12-12 |
ES455065A1 (es) | 1978-05-01 |
NO822985L (no) | 1977-07-19 |
GB1581824A (en) | 1980-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5972120A (en) | Extraction of sweet compounds from Stevia rebaudiana Bertoni | |
AU613688B2 (en) | Process for extracting pure fractions of lactoperoxidase and lactoferrin from milk serum | |
JP4605368B2 (ja) | ベタインの回収方法 | |
CA1292014C (en) | Process for the separation and production of chlorogenic acid | |
RU2490274C2 (ru) | Производство 2s-белка канолы с применением ионного обмена | |
CA2651583C (en) | Method and system for production of zein and/or xanthophylls using chromatography | |
JPS5850633B2 (ja) | アントシアニン抽出物の処理方法 | |
JP5778772B2 (ja) | センテラアジアチカの抽出物を調製するための方法 | |
JPH0783675B2 (ja) | ミルクからのラクト−スの特異的分離方法 | |
US6479636B1 (en) | Sugarcane fractioning system | |
NO149875B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av insulin | |
EP0856008B1 (de) | Verfahren zur abtrennung von albumin aus serum durch ionenaustauschchromatographie mit membranadsorbern | |
JP2005179215A (ja) | タウリンの抽出方法 | |
SE500110C2 (sv) | Sätt att rena ett protein från därtill bundna flervärda metalljoner | |
CN110156689A (zh) | 一种青藤碱的提取方法 | |
Pusztai et al. | Protein body membranes of Phaseolus vulgaris L. cotyledons: isolation and preliminary characterization of constituent proteins | |
CN111825730A (zh) | 一种从葡萄皮渣或鲜果果皮中提取分离14种花色苷单体的方法 | |
DK146255B (da) | Fremgangsmaade til adskillelse af mannitol og sorbitol fra oploesninger indeholdende begge polyoler sammen med uhydrogenerede sukkere | |
US4617376A (en) | Process for recovering glucagon from pancreas glands | |
EP0781264B1 (en) | Process for recovering citric acid | |
US5965028A (en) | Process for treating a liquid | |
US2425094A (en) | Process for obtaining rutin from buckwheat | |
CN105037451B (zh) | 一种超滤处理黄霉素发酵液的方法 | |
FI58260B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av rent insulin | |
EP0207727A2 (en) | A process for recovering glucagon from pancreas glands |