BG65045B1 - Метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин - Google Patents

Abstract

По метода се получава монокомпонентен инсулин от животински произход. Процесите са с меки условия на работа, плавни температурни и рН-преходи, осигуряващи запазване на инсулиновата молекула и съответно на биологичната активност на получения инсулин.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин, по-специално монокомпонентен инсулин от животински произход, използван за лечение на захарен диабет.

Предшестващо състояние на техниката

От откриването му през 1921 г. инсулинът е основно средство в целия свят за лечение на захарен диабет. При екстракционните процеси, използвани за извличане на инсулин от панкреатичната тъкан се извличат и значителни количества неинсулинови протеини, поради което се разработват методи за пречистване на инсулина, за отделянето му от неинсулиновите протеини и други примеси.

От промишлено значимите методи един от най-ранните използва общото свойство на протеините да преципитират в изоелектричната си точка. Така, US 1,469,994 се отнася до метод за пречистване, който включва преципитиране на неинсулиновите протеини, съдържащи се във водния екстракт от панкреас, при техните изоелектрични точки. Изоелектрично преципитиране на инсулин от воден екстракт на панкреас при pH от 4 до 7, е описано в US 1,520,673. Съгласно друг метод, описан в US 1,547,515, преципитирането на инсулина се постига чрез изселване, по-специално с натриев хлорид. Метод за диференциално изсолване е описан в US 2,449,076. Трети промишлено значим метод за пречистване на инсулин използва преципитация или кристализация на инсулин от разтвор като цинк-инсулинов комплекс. В US 3,878,186се описва метод за пречистване на алкален или амониев инсулин, включващ гел-филтрация на воден разтвор на алкален или амониев инсулин с чистота над 80%, като концентрацията на инсулина в разтвора е от 1 до 8 % маса/обем, и pH на разтвора е от 2,0 до 3,5. Елюирането на инсулина от гелфилтрационната колона се извършва с воден елюент с pH в същите граници, както на разтвора на инсулин. За гел-филтрацията се използва набъбващ гел, който в сухо състояние съдържа най-малко 4 % вода и има диаметър на частиците под 100 микрона. С този метод се постига добив на цинк-инсулин 91,9 % по отношение на теглото и 98,9 %, определени спрямо биологичната активност. Биологичната активност на получения цинк-инсулин е 25,6 Units/mg. Съдържанието на проинсулин е 0,44 %.

От RU 2 057 542 е известен метод за пречистване на инсулин от животински произход с използване на препаративна колонна хроматография с ниско налягане, като воден разтвор на инсулин суров pH 3,0 - 3,5 през йонит, представляващ продукт на съполимеризация на метакрилова, акрилова киселина и диметакрилат на етиленгликол с коефициент на набъбване Кнаб = 4,5 - 4,8 и пълен обменен капацитет 9,2 - 9,8 mg.eq/g. Йонитьт предварително е уравновесен с 10 -16 %-ен воден разтвор на изопропанол pH 3,0 - 3,5. След това йонитьт се промива с 10 -16 %-ен воден разтвор на изопропанол pH 3,0 - 3,5 и се провежда елюиране на инсулина с 20 - 25 %-ен воден разтвор на изопропанола с pH 3,4 - 3,9, съдържащ 0,05 - 0,15 М амониев ацетат, от получия елюат желания продукт се отделя с утаяване. Постига се пречистване на инсулина до 98,7 %.

От RU 2 120 299 е известен метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин от животински произход, съгласно който натрий инсулин със съдържание на монофракция не по-малко от 85 % се разтваря в 0,018 0,022 М фосфатен буфер при pH = 6,7-6,8 и се подава в хроматографска колона, запълнена с уравновесен в същия буфер макропорест сулфокатионит КУ - 23 И е диаметър на частиците от 200 до 300 microm. Инсулинът се елюира при стайна температура с 0,018 -0,022 М фосфатен буфер с линеен градиент по стойността на pH: от pH = 6,7-6,8 до pH = 7,9-8,0. От получения елюат се отделя инсулинът чрез изоелектрично утаяване. Полученият след катионообменната хроматография инсулин се разтваря в 1М оцетна киселина и се подава в хроматографска колона (сефадекс G-50 St на Pharmacia), елюирането се извършва с 1М оцетна киселина. Част от елюата, съдържащ инсулин и която се елюира в интервала от 0,6-0,7 до 0,9-1,0 от обема на пълнежа на колоната, се връща на входа на колоната за рециркулация и елюирането продължава с

1М оцетна киселина. Полученият след циркулационна гелпроникваща хроматография монопиков инсулин се подава в колона с анионообменен силикагел РЕА-300 с размер на частиците от 35 до 70 microm. Елюирането се извършва със скорост 20 до 45 ml/cm². h¹, използвайки експоненциален градиент по концентрацията на натриевия хлорид. Полученият инсулин съдържа не по-малко от 98,5 % монофракция, не повече от 0,5 % дезамидоинсулин, не повече от 1,0 % неидентифицирани примеси и не повече от 10 ррш проинсулин и негови производни. При това добивът по маса съставлява от 55 до 65 % спрямо изходната субстанция натрий инсулин.

От RU 2 146 944 е известен метод за пречистване на инсулин, извлечен от животинска суровина или получен чрез биотехнологичен метод. Изходният инсулин се подлага на гелхроматография в 0,7 -1,2 М оцетна киселина в колона, запълнена с хидрофилен гел, получен чрез поликондензация на полиглюкин с епихлорхидрин и уравновесен с 0,7 - 1,2 М разтвор на оцетна киселина. При зареждане на колоната количеството на инсулина съставлява 4-7 g/Ι уравновесен гел, при това концентрацията на инсулина в разтвора съставлява 5-15 %. Елюирането на инсулина се осъществява при 8-15°С със скорост на потока 2,0 - 5,0 ml / (cm². h), желаният продукт се отделя с утаяване с цинк и се подлага на цитратна кристализация, получава се инсулин с добив 75 - 85 % и съдържание на монофракция инсулин 98,0 - 98,5 %, при това съдържанието на проинсулин съставлява по-малко от 2 ppm, съдържание на бактериални пептиди /в генно-инженерен човешки инсулин/ - под 1 ppm, а количеството на дезамидоинсулин и неидентифицирани примеси във всички случаи не превишава 1 % /методи РИА и ВЕТХ/.

Получените по тези методи продукти не могат да се квалифицират като монокомпонентен инсулин. Наличието на примеси, особено на 1% неидентифицирани примеси прави продукта недостатъчно качествен, предполагащ незадоволителна биологична активност и риск от алергични и други странични реакции.

В UK 1 581 824 е описан метод за получаване на монокомпонентен инсулин с много слабо или без алергенно действие. Методът се състои в следното: замразени панкреатични жле зи се екстрахират с етилов алкохол /60-80 % обемни/ подкислен със солна киселина до pH около 3. След отделяне на масата от панкреатични клетки, pH на екстракта се довежда до 8, при което някои протеини, различни от инсулин, преципитират и се отстраняват. pH отново се довежда до 3. Вместо т.н. “рН-8-преципитиране” за отделяне на нежеланите протеини, киселият екстракт с pH = 3, може да се подложи на ултрафилтрация/хиперфилтрация, използвайки подходящи мембрани за отделяне на казаните протеини, например ензими. Полученият бистър екстракт се охлажда в специално устройство до температура от -30 до -45°С, при което мазнините кристализират в компактна маса върху малка повърхност. Кристалите се отделят, например чрез центрофугиране, при същата ниска температура. Съгласно изобретението, несъдържащият вече мазнини екстракт на инсулин се подлага на обратна осмоза с подходящи мембрани, при което едновременно се постига намаляване на обема на течността и отделяне на инсулина от примесите в екстракта. Обратната осмоза се провежда при температури между +10°С и - 10°С и налягане 2-20 atm, типът на мембраната се избира така, че да се отделят нежелани молекули, по-големи от инсулиновата молекула. Могат да се използват мембрани GRX-6 или GRX-7 (полисулфонови мембрани). Пермеатът се подлага на обратна осмоза, като се използват мембрани, отделящи примесите с молекули, по-малки от тази на инсулина, например мембрани GRSР или 930 (целулозо-ацетатни). Инсулинът остава в концентрата. Екстрактът може да бъде концентриран до желана степен, например до от 1/5 до 1/40 от изходния обем. При това съотношението между концентрациите на алкохола и водата трябва да останат същите, както в изходния екстракт. Полученият концентрат, съдържащ практически всичкия инсулин от изходния екстракт, е прозрачен, но оцветен. Той се подлага на промиване с 62%-ен алкохол над мембрана, през която преминава промивния разтвор с оцветяващите вещества. По подобен начин се извършва отмиването на солите, намиращи се в екстракта. Малките количества разтворени примеси, останали все още в инсулин-съдържащия екстракт, могат да бъдат отстранени чрез йонообменна смола, катионообменна, а също и анионообменна. Отделянето може да се извърши и с молекул но сито, например Sephadex G-50 или чрез друг подходящ познат метод на отделяне, но йонообменният метод е за предпочитане. Йонообменният метод може да бъде колонна хроматография. Могат да се използват различни типове йонообменни смоли. Предпочита се SP-Sephadex С-25 /катионообменна смола/ и QAE-Sephadex А-25 /анионообменна/. Получава се монокомпонентен инсулин, доказан чрез полиакриламидгел-електрофореза с използване на 15%-ен полиакриламиден гел.

В US 3,907,676 е описан метод за пречистване на инсулин за намаляване на антигенната активност на инсулин, получен от животински панкреас. Този метод е най-ефективен, когато изходният материал е получен чрез подлагане на разтвора на солната утайка на преципитация при изоелектричната точка чрез довеждане на pH на разтвора до 5,5, и изолиране на преципитата чрез центрофугиране. Методът включва разтваряне на инсулина във водна среда, регулиране на pH в границите от 6 до 9, прехвърляне на разтвора в хроматографска колона с анионообменна смола, фракционно елюиране от колоната с елюент, състоящ се от вода и смесваем с вода монохидроксилен алифатен алкохол с концентрация на алкохола 40 до 80 % обемни, събиране на инсулинсъдържащите фракции, показващи съдържание само на един компонент, което се анализира с електрофореза върху полиакриламиден гел (DISC PAGE) и отделяне на събраните фракции.

Проблемите, които стоят пред производителите на инсулин е постигане на високо пречистен и в най-добрия случай монокомпонентен инсулин, който не е антигенен и алергенен, и същевременно постигане на максимално извличане на съдържащия се в изходния панкреасен материал инсулин. При това, методите и техническите средства, с които се осъществяват отделните процеси да са ефективни и да са технологично оптимални за промишлено производство в голям мащаб.

Техническа същностна изобретението

Тези проблеми се решават с метод, който се състои от следните етапи:

I. Получаване на солеви кейк:

- неколкократна екстракция на хормона от дълбоко замразен свински панкреас, с етилов алкохол, подкислен с фосфорна киселина, при температура под 18°С;

- провеждане на изоелектрично преципитиране в алкалната и киселата област при температура от 12 до 18°С;

- двустепенно концентриране под вакуум;

- изсолване чрез добавяне на чист натриев хлорид до изсол /солеви кейк/ при pH = 3.30 ± 0.02;

- престояване при стайна температура от 2 h до 4 дни;

И. Получаване на натрий - инсулин:

- изоелектрично преципитиране в киселата област от pH = 2.8 до крайно pH = 5.3±0.02, което се коригира с натриева основа, при температура 4°С;

- добавяне на 96%-ен алкохол и охлаждане до 4°С, корекция на pH = 5.30±0.02;

- престояване без бъркане 12 h;

- отдекантиране на горната част от течността;

- центрофугиране, при 4°С;

- разтваряне на изоутайката във вода;

- двустепенна корекция на pH със задържане;

- добавяне към инсулиновия разтвор на двунатриев етилендиамин тетраацетат дихидрат, като температурата се коригира до 18-25°С;

- добавяне на натриев хлорид до общо солево съдържание 0.15 kg/Ι първоначален обем разтвор и корекция на pH = 8.40±0.02;

- разбъркване 8-12 h при стайна температура;

- филтруване и промиване;

- съхранение на натрий-инсулин, по познат начин, в зависимост от хода на технологичния процес.

III. Пречистване на натрий - инсулин чрез гелфилтрация:

Гелфилтрацията се провежда по познат начин, с използване на хроматографски колони, запълнени, например, с декстранова смола, от типа Сефадекс G 50, елюирането се провежда с буферирана оцетна киселина, при което разделянето на компонентите според големината на молекулите им, се контролира с UV-абсорбция. Могат да се използват различни познати, подходящи режими.

Фракцията на монопиковия инсулин се събира и кристализира с натриев хлорид до натриев монопиков инсулин, който се съхранява за последваща обработка.

IV. Пречистване на монопиков инсулин чрез йонообменна хроматография, до монокомпонентен инсулин.

Методът се основава на принципа на абсорбция-десорбция за разделяне на инсулинови молекули, различаващи се по своя електричен заряд.

- разтваряне на монопиков инсулин във вода.

- йонообмен на инсулина на DEAE и QAE - колони.

Йонобменът се извършва на две успоредни системи, като всяка се състои от две пакетни колони KS-370/15. Използват се 6 вида урейни буфери.

Колоните се пълнят с DEAE целулоза, еквилибрирана с 0.025 М Трис/HCl буфер в 7 М урея буфер 1 и Фармация QAE Сефадекс А 25, еквилибриран в същия буфер. При температура 4 ± 1°С се извършва

- подаване на пробата към DEAE - колоните, при определена скорост на потока;

- провеждане на четири елюирания с определен вид буфер, като се контролират работните параметри - pH, температура, проводимост, UV-проводимост при 206 nm или 280 nm, скорост на потока;

- инсулинът се елюира от QAE - колоната с 0.025 М Н₃РО₄, съдържаща 1% н-бутанол /буфер 6/. Следят се параметрите - pH, проводимост, UV-сигнал при 280 nm, температура и скорост на потока;

- регенерация на колоните DEAE и QAE, като се съчетава работен режим на едната двойка колони и регенериращ на другата;

- фракцията монокомпонентен инсулин се филтрува на филтри 0.8 и 0.22 микрона. Така получения стерилен разтвор се подава за цинкова кристализация.

V. Кристализация с цинк: Съдържанието на цинка трябва да бъде 0.5% от теглото на инсулина, под формата на цинков ацетат или цинков хлорид /10 mg цинк на ml/, pH = 6.5, температура 15-20°С, Разбъркване една нощ. Корекция на pH = 5.7 с 1М СН₃СООН. След 1 h разбъркване се събират кристалите цинкинсулин, съхраняват се при температура 4°С и се извършва окачествяване на цинк-инсулина чрез RIA и HPLC.

От така получения монокомпонентен цинк-инсулин кристали се произвеждат готови лекарствени форми, като бързодействащи цинкинсулинови препарати, интермедиерни и с пролонгирано действие, с активност 40 IU/ml, 80 IU/ml и 100 IU/ml.

Всички процеси в метода, съгласно изобретението, се отличават с меки условия на работа, плавни температурни и pH-преходи, които осигуряват запазване на инсулиновата молекула и съответно на биологичната активност на получения инсулин. Предимствата на метода, съгласно изобретението са: постигане на максимално извличане на инсулин от изходната суровина, минимални загуби при етапите на пречистване, и същевременно получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин, доказан с HPLC/ FPLC, нискоантигенен и нискоимуногенен, доказан с радиоимунологичен анализ /RIA/, с висока биологична активност, с чистота, доказана с радиоимунологичен анализ за контаминанти. Методът е разработен като безотпадна технология, даваща възможност за получаване на страничните продукти и тяхното оползотворяване.

Примерно изпълнение на изобретението

I. Получаване на солеви кейк

500 kg дълбоко замразен при температура -25°С свински панкреас се наситнява до 0.2 mm /сняг от месо/ и при температура -5 до 0°С се екстрахира 4 пъти с подкислен с фосфорна киселина етанол, като първата екстракция се провежда с 90 %-ен етанол, втората се провежда с четвъртия екстракт от предходната зарядка, а третата и четвъртата екстракции - с нов /свеж/ етанол, температурата се поддържа под 18°С. Разделянето на месото и екстракта се извършва бързо на декантираща центрофуга, след което следва пречистване с избистрящ сепаратор /течност-твърда фаза/. Събират се три последователни екстракта, pH се довежда до 6, следва бавно коригиране до 8.1 /с разтвор на натриева основа/, като температурата е в граници 12-17°С. Екстрактът се пречиства през декантер и се избистря през камерна филтър-преса. Пречистеният екстракт се подкислява с 25% солна киселина до pH = 4.65. След това екстракта се концентрира под вакуум. Температурата не трябва да надвишава 30°С. За получаването на високо пречистен инсулин трябва да се направи втора концент рация до съдържание на етанол, по-ниско от 0.5%.

След второто концентриране преципитатьт се отделя чрез отдекантиране или филтруване, когато утайката, която се събира вследствие на преципитацията, е твърда. Мазнината се отстранява чрез втвърдяване е тетрахлорметан. Концентрираният екстракт се пречиства чрез филтрация през спомагателен филтруващ материал. Провежда се изсолване до солевия кейк, като концентратът се обработва при pH = 3.30, чрез добавяне на 18 % об./тегл. чист натриев хлорид и реакционната смес се оставя да престои 2 h при стайна температура. Солевият кейк се събира върху филтър или в еднокамерна центрофуга, след което се изсушава и съхранява в хладилен склад за по-нататъшно пречистване;

II. Получаване на натрий - инсулин

Солеви кейк, получен от 7.51 панкреас, се разтваря във вода и подкислява с 2М фосфорна киселина до pH = 2.8. Проводимостта на разтвора не трябва да надвишава 3 милисименса. Следва охлаждане до 4°С, корекция на pH - до pH = 3.2 с натриева основа при температура 4°С, към разтворения солеви кейк се добавя около 0.5 kg киселинно промит спомагателен филтруващ материал и разтвора се филтрува през камерна филтьрпреса. Следва изоедектрично утаяване като разтвора се разрежда, pH се регулира до pH = 5.30 ± 0.02 с IM NaOH, охлажда се до температура под 5°С, добавя се 96%-ен етанол в количество спрямо разтвора 1:4, отново се охлажда до 4 °C, корекция до pH = 5.30 ± 0.02 с 1М NaOH или IM НС1 и престоява без бъркане 12 h. След това горната част от течността се отдекантира до достигане повърхността на утайката, извършва се центрофугиране, при 4°С. Промивните филтрати се събират за следващо изоелектрично утаяване. Следва разтваряне на изоутайката във вода. Добавя се (NH₄)₂ НРО₄, корекция до pH = 7.2 ±0.1 с IM NaOH, разтвора се разрежда до протеиново съдържание 20 g/Ι, филтрува през шихти от тип Зайц ЕХ и след това през мембранен филтър от тип Милипор, 0.45 микрона. Към инсулиновия разтвор се добавя 4 g двунатриев етилендиамин тетраацетат дихидрат /трилон Б/, като температурата се коригира до 18-25°С, добавя се натриев хлорид 0.075 kg/Ι разтвор, при енергично бъркане, следва корекция до pH = 8.40 ± 0.02 с IM NaOH, и разбъркване 2 h, добавя се същото количество натриев хлорид до общо со лево съдържание 0.15 kg/Ι първоначален обем разтвор, извършва се корекция на pH, ако е необходимо до pH = 8.40 +/- 0.02 с IM NaOH, следва разбъркване 8-12 h при температура 1825°С. Филтрува се през накален хартиен филтър, и се промива с 15%-ен разтвор на натриев хлорид. Натрий-инсулин се съхранява по три начина:

- първи начин - съхранение на мокрите кристали в студен склад - съхранение при 4°С до няколко дни;

- втори начин - изсушаване на мокрите кристали под вакуум, съхранение до няколко месеца при 4°С;

- трети начин - суспендирне на кристалите в етанол 96%-ен, филтруване на суспензията и изсушаване с чист сгъстен въздух - съхранение до няколко месеца при 4°С;

III. Пречистване на натрий - инсулин, чрез гелфилтрация

Натрий-инсулин се разтваря в 1М оцетна киселина и филтруване. Извършва се проверка на инсулиново съдържание /трябва да бъде 33 g/1/;

За гелфилтрацията се използват колони Parmacia KS 370/15, гел Сефадекс G-50 Суперфайн специално качество, набъбнал в 1М СН₃СООН. Гелфилтрацията може да протича на автоматичен режим - всяка проба - 50 g инсулин, скорост на потока 6-81/h, елуент 1М СН₃СООН , температура 4°С, налягане 0.3 bar.

IV. Пречистване на монопиков инсулин чрез йонообменна хроматография, до монокомпонентен инсулин.

Методът се основава на принципа на абсорбция-десорбция за разделяне на инсулинови молекули, различаващи се по своя електричен заряд. Монопиков инсулин на кристали, получен в предходния етап се разтваря във вода, при корекция на pH до 8.10 ± 0.02. Работи се в студена стая. Разтворът се филтрува през филтри 0.8 и 0.22 микрона. Инсулиновото съдържание се определя спектрофотометрично. Разтворът се довежда до точно определена концентрация на инсулин в разтвора и до точно определена проводимост /30 g/Ι и 2.0 милисименса/;

Йонообменът се извършва на две успоредни системи, като всяка се състои от две пакетни колони KS-370/15n комплект прибори, контролиращи работните параметри на технологичния режим. Използват се урея-буфери.

Колоните се пълнят с DEAE целулоза, еквилибрирана с 0.025 М Трис/HCl буфер в 7 М урея буфер 1 и Фармация QAE Сефадекс А 25, еквилибриран в същия буфер. Работи се при температура 4 ± 1°С. Пробата се подава към DEAE - колоните, със скорост на потока 101/h. Провеждат се четири елюирания с определен вид буфер, като се контролират работните параметри - pH, температура, проводимост, UV-проводимост при 206 nm или 280 nm, скорост на потока.

Инсулинът се елюира от QAE - колоната е 0.025 М Н₃РО₄, съдържаща 1% н-бутансл /буфер 6/. Следят се параметрите - pH, проводимост, UVсигнал при 280 nm, температура и скорост на потока. Следва регенерация на колоните DEAE и QAE, като се съчетава работен режим на едната двойка колони и регенериращ на другата. Фракцията МС-инсулин се филтрува на филтри 0.8 и 0.22 микрона. Така полученият стерилен разтвор се кристализира, чрез провеждане на цинкова кристализация. Съдържанието на цинка трябва да бъде 0.5% от теглото на инсулина, под формата на цинков ацетат или цинков хлорид /10 mg цинк на ml/, температура 15-20°С, pH = 6.5. Разбърква се една нощ. Корекция на pH = 5.7 с 1М СН₃СООН. След 1 h разбъркване се събират кристалите цинк-инсулин. Съхраняват се при температура 4°С. Окачествяването на цинк-инсулина се извършва чрез RIA и HPLC. От така получения монокомпонентен цинк-инсулин кристали се произвеждат готови лекарствени форми, като бързодействащи цинк-инсулинови препарати, интермедиерни и с пролонгирано действие, с активност 40 IU/ml, 80 IU/ml и 100 IU/ml.

Claims (3)

1. Патентни претенции

   1. Метод за получаване на високопречистен монокомпонентен инсулин, включващ екстракция на хормона от свински панкреас с подкислен етанол, пречистване на екстракта чрез изоелектрично преципитиране, последващи етапи на пречистване чрез молекулярна филтрация, и високо пречистване чрез йонообменна хроматография, характеризиращ се с това, че се състои от следните етапи:

   I. Получаване на солеви кейк:

   - неколкократна екстракция на хормона от дълбоко замразен свински панкреас, с етилов алкохол, подкислен с фосфорна киселина, при температура под 18°С;

   - провеждане на изоелектрично преципитиране на примесите в алкалната и киселата област при температура от 12 до 18°С;

   - двустепенно концентриране под вакуум;

   - изсолване чрез добавяне на чист натриев хлорид до изсол /солеви кейк/ при pH = 3.30±0.02;

   - престояване при стайна температура от 2 h до 4 дни;

   И. Получаване на натрий - инсулин:

   - изоелектрично преципитиране в киселата област от pH = 2.8 до крайно pH = 5.3±0.02, което се коригира с натриева основа, при температура 4°С;

   - добавяне на 96%-ен алкохол и охлаждане до 4°С, корекция на pH = 5.30 ±0.02;

   - престояване без бъркане 12 h;

   - отдекантиране на горната част от течността;

   - центрофугиране при 4°С;

   - разтваряне на изоутайката във вода;

   - двустепенна корекция на pH със задържане,

   - добавяне към инсулиновия разтвор на двунатриев етилендиамин тетраацетат дихидрат, като температурата се коригира до 18-25°С;

   - добавяне на натриев хлорид до общо солево съдържание 0.15 kg/Ι първоначален обем разтвор и корекция на pH = 8.40±0.02;

   - разбъркване 8-12 h при стайна температура;

   - филтруване и промиване;

   III. Пречистване на натрий - инсулин чрез гелфилтрация:

   - провеждане на гелфилтрация, по-специално с използване на хроматографска колона, запълнена с декстранова смола, тип Сефадекс G 50, елюиране с буферирана оцетна киселина, като разделянето на компонентите според големината на молекулите им се контролира с UVабсорбция;

   - кристализация на фракцията на монопиковия инсулин с натриев хлорид до натриев монопиков инсулин;

   - доказване на монопиков инсулин с аналитична гел-филтрация, DISC-PAGE по Орнщейн-Дейвис, последваща денситометрия,

   FPLC/HPLC.

   IV. Пречистване на монопиков инсулин чрез йонообменна хроматография, до монокомпонентен инсулин:

   - разтваряне на монопиков инсулин във во- 5 да и корекция на pH = 8.1±0.02 с 0.1 М солна киселина или 0.1 М натриева основа;

   - йонообмен в две успоредни системи, всяка състояща се от две пакетни колони KS-370/15, като колоните се пълнят с DEAE-целулоза, ек- 10 вилибрирана с 0.025 М Трис/HCl буфер в 7 М урея-буфер и Фармация QAE Сефадекс А 25, еквилибриран в същия буфер, при температура

   4 ± 1°С, провеждане на четири елюирания с определен вид буфер, като се контролират работните параметри - pH, температура, проводимост, UV-проводимост при 206 nm или 280 nm, скорост на потока, при което инсулинът се елюира от QAE - колоната с 0.025 М Н₃РО₄, съдържаща 1% н-бутанол, като следят се работните параметри;

   - регенерация на колоните DEAE и QAE, като се съчетава работен режим на едната двойка колони и регенериращ на другата;

   - фракцията монокомпонентен инсулин се филтрува на филтри 0.8 и 0.22 микрона;

   V. Получаване на цинк-инсулин

   - кристализация на получения стерилен разтвор от предходния етап като цинк-инсулин с добавяне на цинков ацетат или цинков хлорид, корекция на pH = 6,5, при температура 15-20°С, бъркане на бавни обороти минимум 4 h, за предпочитане 1 нощ, корекция на pH = 5.7 с 1М СН₃СООН, след минимум 1 h разбъркване се събират кристалите цинк-инсулин;

   - окачествяване на цинк-инсулина чрез RIA и HPLC.
2. 2. Инсулин, получен по метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е монокомпонентен, доказан с RIA и HPLC.
3. 3. Приложение на инсулин, получен съгласно претенция 1, за производство на препарати за инсулинотерапията.