NO149875B

NO149875B - PROCEDURE FOR PREPARING INSULIN

Info

Publication number: NO149875B
Application number: NO770119A
Authority: NO
Inventors: Willy Henry Jensen; Gregorio Ramon Cebrian; Jose Adrian Aguas
Original assignee: Leo Sa Lab
Priority date: 1976-01-16
Filing date: 1977-01-14
Publication date: 1984-04-02
Also published as: AU514888B2; SE445972B; NO149875C; IE45013B1; FI64508C; AT364717B; DE2701092A1; CA1112639A; BE850387A; AT366578B; GB1581824A; AU2131777A; FR2338250A1; IE45013L; ATA546880A; NO822985L; FI64508B; FI770112A; NL7700455A; ATA7977A

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling The invention relates to a method for production

av insulin med ingen eller meget liten antigenisitet. of insulin with no or very little antigenicity.

Det er nu almindelig antatt at antigenisiteten hos insulinpreparater i overveiende grad skyldes urenheter i pre-paratene, mens man tidligere har vært av den oppfatning at insulinantistoffene ble fremkalt av insulinet som sådant. Disse urenheter kan være insulinfremmede ledsageproteiner fra pankreas, proinsulin, som er insulinets forstadium, intermediær insulin, dimeren, arginininsulin, etylesterinsulin, desamidoinsulin, deamidert i forskjellig grad, og andre insulinmodifikasjoner. It is now generally assumed that the antigenicity of insulin preparations is predominantly due to impurities in the preparations, whereas in the past it was believed that the insulin antibodies were induced by the insulin as such. These impurities can be insulin-promoted companion proteins from the pancreas, proinsulin, which is the precursor of insulin, intermediate insulin, the dimer, arginine insulin, ethyl ester insulin, desamidoinsulin, deamidated to varying degrees, and other insulin modifications.

Man bestreber seg derfor på å fremstille insulinpreparater som består av rent insulin, såkalt monokomponent-insulin, fritt for urenheter og ledsagestoffer av enhver art. Efforts are therefore made to produce insulin preparations that consist of pure insulin, so-called monocomponent insulin, free of impurities and accompanying substances of any kind.

Man har for dette formål foreslått å underkaste amorft eller krystallinsk insulin fremstilt på konvensjonell måte, en vidtgående ytterligere rensning, f.eks. ved gelfiltrering og/eller ionebytterbehandling, se f.eks. de britiske patenter 1.285.023 og 1.285.024 og det tilsvarende norske patent 132.638. For this purpose, it has been proposed to subject amorphous or crystalline insulin produced in a conventional manner to extensive further purification, e.g. by gel filtration and/or ion exchange treatment, see e.g. the British patents 1,285,023 and 1,285,024 and the corresponding Norwegian patent 132,638.

De resulterende høyrensede insuliner viser en sterk nedgang i antigenisitet, men ikke en fullstendig fjernelse av denne. Årsaken til dette er utvilsomt at det til tross for rensnings-trinnene stadig finnes stoffer som er forskjellig fra insulin i de rensede preparater. The resulting highly purified insulins show a strong decrease in antigenicity, but not a complete removal thereof. The reason for this is undoubtedly that, despite the purification steps, there are still substances that are different from insulin in the purified preparations.

Oppfinnelsen er basert på den erkjennelse at en del The invention is based on the realization that a part

av de urenheter som finnes i insulin, dannes under selve ut-vinningen av insulinet, idet de vanlig anvendte prosesser bl.a. medfører nedbrytning av insulinet og aggregatdannelser. Insulinet slik det befinner seg akkumulert i de pankreas-kjertler hvor insulin utvinnes fra, er den rene monomer (med molekylvekt omkring 6.000), og det ekstraheres som sådan ved den konvensjonelle ekstraksjon med sur vandig 60-80%ig alkohol. Ved den videre konvensjonelle opparbeidelse, som bl.a. omfatter fettseparering ved vakuumdestillasjon av ekstrakten ved 25-30°C hvorved alkohol avdamper og det fås en vandig ekstrakt med sterkt nedsatt alkoholinnhold, utsettes monomeren imidlertid for betingelser som med-fører nedbrytning, bl.a. som følge av skadelig innvirkning av de enzymer som kan utfolde sin virkning i vandig oppløsning (oppløsninger med et alkoholinnhold under 50%) mens de ikke er virksomme i alkoholisk oppløsning (oppløsninger med over 50% of the impurities found in insulin are formed during the extraction of the insulin itself, as the commonly used processes include leads to breakdown of the insulin and aggregate formations. The insulin as it is accumulated in the pancreatic glands from which insulin is extracted is a pure monomer (with a molecular weight of around 6,000), and it is extracted as such by the conventional extraction with acidic aqueous 60-80% alcohol. In the further conventional processing, which i.a. comprises fat separation by vacuum distillation of the extract at 25-30°C whereby the alcohol evaporates and an aqueous extract with a greatly reduced alcohol content is obtained, the monomer is, however, exposed to conditions which lead to degradation, i.a. as a result of the harmful effect of the enzymes that can unfold their effect in aqueous solution (solutions with an alcohol content below 50%) while they are not effective in alcoholic solution (solutions with more than 50%

alkohol), aggregatdannelser osv. alcohol), aggregate formations, etc.

Ifølge oppfinnelsen tilstrebes det derfor å utføre insulin-fremstillingen på en slik måte at insulinet fra ekstraksjonen fra pankreas-kjertlene, for å oppnå det endelige sluttprodukt, kun utsettes for betingelser som er av en slik art at de ikke vil medføre dannelse av nedbrytningsprodukter, aggregater osv, og spesielt på en slik måte at man unngår betingelser som de som hersker ved den vanlig anvendte vakuum-inndampning som med-fører at insulinet til slutt befinner seg i sterkt vandig opp-løsning ved ca. 35°C. According to the invention, it is therefore sought to carry out the insulin production in such a way that the insulin from the extraction from the pancreatic glands, in order to obtain the final end product, is only exposed to conditions which are of such a nature that they will not lead to the formation of breakdown products, aggregates etc., and especially in such a way that one avoids conditions such as those prevailing in the commonly used vacuum evaporation which means that the insulin is finally in a strong aqueous solution at approx. 35°C.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles insulin som er renset i en slik grad at det kun viser en enkelt komponent når det analyseres ved polyakrylamidgel-elektroforese under anvendelse av en gel inneholdende 15% polyakrylamid. Ved fremgangsmåten fremstilles en ekstrakt av insulin fra pankreas-kjertler, hvilken ekstrakt i flere trinn opparbeides til det rene insulin, og fremgangsmåten karakteriseres ved at opparbeidelsen finner sted ved temperaturer som ikke vesentlig overstiger romtemperatur, og skjer på den måte at insulinet under hele opparbeidelsesprosessen inntil den endelige utvinning holdes i oppløst tilstand i et oppløsningsmiddel, bestående av en blanding av vann og et organisk oppløsningsmiddel, hvilken blanding inneholder minst 50% organisk oppløsningsmiddel, eller suksessivt holdes oppløst i flere forskjellige oppløsningsmidler av denne type, idet de ikke ønskede stoffer fra begynnelsen til slutten av prosessen, fjernes fra de forskjellige anvendte opp-løsningsmidler, inntil det rene insulin foreligger i et for urenheter befridd oppløsningsmiddel, hvorpå insulinet om ønsket utfelles fra oppløsningsmidlet, om ønsket som i og for seg kjent med metallioner, fortrinnsvis sinkioner. The method according to the invention produces insulin that is purified to such an extent that it only shows a single component when analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis using a gel containing 15% polyacrylamide. The method produces an extract of insulin from pancreatic glands, which extract is processed in several steps into pure insulin, and the method is characterized by the fact that the processing takes place at temperatures that do not significantly exceed room temperature, and takes place in such a way that the insulin during the entire processing process up to the final extraction is kept dissolved in a solvent, consisting of a mixture of water and an organic solvent, which mixture contains at least 50% organic solvent, or is successively kept dissolved in several different solvents of this type, the unwanted substances from the beginning until the end of the process, is removed from the various solvents used, until pure insulin is present in a solvent freed from impurities, whereupon the insulin is precipitated from the solvent, if desired as in and of itself known with metal ions, preferably zinc ions.

I de tidligere nevnte britiske patenter 1.285.023 og 1.285.024 og norsk patent 132.638 beskrives fremstilling av insulin av høy renhet fra på konvensjonell måte fremstilt amorft eller krystallinsk insulin. I de to sistnevnte patenter nevnes også at man som utgangsmateriale kan anvende den insulinholdige saltkake, som dannes ved den konvensjonelle fremstilling av insulin, men at dette materiale er mindre egnet. Det angis i britisk patent 1.285.023 at det rensede insulin ved polyakrylamidgelelektroforese viser i det vesentlige en enkelt komponent. Dette insulin inneholder imidlertid stadig en mindre mengde desamidoinsulin, og det vil ved polyakrylamidgelelektroforese under anvendelse av en gel med 15% polyakrylamid vise to bånd, nemlig foruten monoinsulinbåndet et monodesamido-insulinbånd. The previously mentioned British patents 1,285,023 and 1,285,024 and Norwegian patent 132,638 describe the production of high purity insulin from conventionally produced amorphous or crystalline insulin. In the two latter patents, it is also mentioned that the insulin-containing salt cake, which is formed in the conventional production of insulin, can be used as a starting material, but that this material is less suitable. It is stated in British patent 1,285,023 that the purified insulin by polyacrylamide gel electrophoresis shows essentially a single component. However, this insulin still contains a smaller amount of desamidoinsulin, and it will show two bands on polyacrylamide gel electrophoresis using a gel with 15% polyacrylamide, namely, in addition to the monoinsulin band, a monodesamidoinsulin band.

Et mindre innhold av desamidoinsulin vil derimot ikke kunne konstateres ved polyakrylamidgelelektroforese under anvendelse av 7,5% polyakrylamid. Ved dette innhold oppnår man ikke en fullstendig separering av de enkelte komponenter, men bl.a. en sammensmelting av insulin og monodesamidoinsulin i ett bånd der det vil vise seg to bånd med 15% polyakrylamid. A lower content of desamidoinsulin, on the other hand, will not be detectable by polyacrylamide gel electrophoresis using 7.5% polyacrylamide. This content does not achieve a complete separation of the individual components, but i.a. a fusion of insulin and monodesamidoinsulin in one band where two bands with 15% polyacrylamide will appear.

Desamidoinsuliner vil ved den konvensjonelle opparbeidelse av insulinekstrakter bl.a. dannes under vakuuminn-dampningen, ved hvis slutt insulinet befinner seg i vandig miljø ved forholdsvis høy temperatur. Når først monodesamidoinsulinet er dannet, er det svært vanskelig å skille fra insulinet, og det vil derfor også være til stede i det amorfe eller krystallinske insulin som anvendes som utgangsmateriale ved fremgangsmåten ifølge de britiske patenter 1.285.023 og 1.285.024 og norsk patent 132.6 38. Dette må ansees for grunnen til dets tilstedeværelse i det rensede insulin oppnådd ved nevnte fremgangsmåte. Desamidoinsulins will, in the conventional processing of insulin extracts, e.g. is formed during the vacuum evaporation, at the end of which the insulin is in an aqueous environment at a relatively high temperature. Once the monodesamidoinsulin is formed, it is very difficult to separate from the insulin, and it will therefore also be present in the amorphous or crystalline insulin used as starting material in the method according to British patents 1,285,023 and 1,285,024 and Norwegian patent 132.6 38. This must be considered the reason for its presence in the purified insulin obtained by the aforementioned method.

Insulin er f.eks. meget lett oppløselig i en sur alkoholisk ekstrakt med fra 55 til 80 volum% alkohol, og i en slik ekstrakt vil insulinet, ved hensiktsmessig behandling, ikke danne aggregater med seg selv eller med urenheter i den alkoholiske ekstrakt. Insulin is e.g. very easily soluble in an acidic alcoholic extract with from 55 to 80% alcohol by volume, and in such an extract the insulin will not, with appropriate treatment, form aggregates with itself or with impurities in the alcoholic extract.

Ved en foretrukket utførelsesform for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ekstraheres insulinet fra pankreas-kjertlene med en slik vandig sur alkohol, og insulinet bevares i ren og oppløst tilstand under den videre opparbeidelse, inntil isoler-ingen av sluttproduktet, f.eks. ved utfeining og eventuelt krystallisasjon.. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the insulin is extracted from the pancreatic glands with such an aqueous acid alcohol, and the insulin is preserved in a pure and dissolved state during the further processing, until the isolation of the final product, e.g. by refinement and possibly crystallization..

Det kan naturligvis anvendes andre ekstraksjonsvæsker Naturally, other extraction liquids can be used

enn sur vandig alkohol hvor insulin er lett oppløselig, og hvor det ikke vil danne aggregater med seg selv eller med urenheter i ekstrakten, f.eks. vandig aceton. than acidic aqueous alcohol where insulin is easily soluble, and where it will not form aggregates with itself or with impurities in the extract, e.g. aqueous acetone.

Ved foreliggende fremgangsmåte er det ikke tale om en rensning av selve insulinet, men det skjer en rensning av den utvundne insulinekstrakt for de oppløste urenheter og fett som stammer fra ekstraksjonen inntil det rene insulin befinner seg In the present method, there is no question of a purification of the insulin itself, but a purification of the extracted insulin extract for the dissolved impurities and fat that originates from the extraction until the pure insulin is found

alene tilbake i ekstrakten. alone back in the extract.

Fremgangsmåten kan f.eks. utføres på følgende måte: The procedure can e.g. is carried out in the following way:

Findelte, frosne pankreas-kjertler ekstraheres med Finely divided, frozen pancreatic glands are extracted with

60-80 volum% etylalkohol surgjort med f.eks. saltsyre til ca. 60-80% by volume ethyl alcohol acidified with e.g. hydrochloric acid to approx.

pH 3. Efter fraskillelse av pankreasmassen innstilles ekstraktens pH-verdi på ca. 8, hvorved visse proteiner forskjellig fra insulin, utfelles og frasepareres. pH-verdien nedsettes igjen til ca. 3. I stedet for å anvende denne såkalte pH 8 feining kan man sende ekstrakten med pH 2-3 gjennom et ultra- og hyperfiltreringsanlegg, jfr. nedenfor, under anvendelse av en passende membran som holder tilbake de nevnte proteiner, bl.a. enzymer. pH 3. After separation of the pancreatic mass, the extract's pH value is set to approx. 8, whereby certain proteins other than insulin are precipitated and separated. The pH value is reduced again to approx. 3. Instead of using this so-called pH 8 fining, the extract with pH 2-3 can be sent through an ultra- and hyperfiltration system, cf. below, using a suitable membrane which retains the mentioned proteins, i.a. enzymes.

Den resulterende klare ekstrakt nedkjøles i et spesielt fettutfrysningsanlegg til en temperatur på -30 til -45°C, fortrinnsvis ca. -35°C, hvorved fettet utkrystalliserer i kompakte fettkrystaller med liten overflate. Disse frasepareres, f.eks. ved sentrifugering, ved samme lave temperatur. Ved denne lave temperatur på -30 til -45°C og ved det konstante høye alkoholinnhold på 60-80 volum% skjer det ingen skadelig innvirkning på insulinet slik tilfellet er ved den konvensjonelle fettfjerhelse ved vakuumdestillasjon ved 25-30°C med synkende alkoholinnhold i ekstrakten. The resulting clear extract is cooled in a special fat freezing plant to a temperature of -30 to -45°C, preferably approx. -35°C, whereby the fat crystallizes into compact fat crystals with a small surface area. These are separated, e.g. by centrifugation, at the same low temperature. At this low temperature of -30 to -45°C and at the constant high alcohol content of 60-80% by volume, there is no harmful effect on insulin as is the case with the conventional fat feather health by vacuum distillation at 25-30°C with decreasing alcohol content in the extract.

Angående nærmere enkeltheter ved denne fettfraskillelse ved utfrysing henvises til dansk patentsøknad nr. 3091/75 Regarding further details of this fat separation by freezing, reference is made to Danish patent application no. 3091/75

(patent nr. 142.313). (patent no. 142,313).

I stedet for ved utfrysning, kan generende fett fjernes fra den insulinholdige ekstrakt ved ionebytting ved lav temperatur (ved eller under romtemperatur) med en kationebytter, f.eks. SP-"Sephadex", til hvilken insulinet bindes. Insulinet og andre proteiner med en ladning motsatt kationebytterens bindes til denne ved hjelp av elektrostatiske krefter, men vil stadig befinne seg i oppløsning. Efter vask av ionebytteren for fjernelse av fastklebende fett elueres insulinet med et passende elueringsmiddel. Såvel vaskevæske som elueringsmiddel skal inneholde minst 50% organisk oppløsningsmiddel. Instead of freezing, troublesome fat can be removed from the insulin-containing extract by ion exchange at low temperature (at or below room temperature) with a cation exchanger, e.g. SP-"Sephadex", to which the insulin binds. The insulin and other proteins with a charge opposite to that of the cation exchanger are bound to this by means of electrostatic forces, but will constantly be in solution. After washing the ion exchanger to remove adhering fat, the insulin is eluted with a suitable eluent. Both washing liquid and eluent must contain at least 50% organic solvent.

Efter den skånsomme fraseparering av fettet foreligger et relativt stort volum ekstrakt befridd for fett; dette store volum skal reduseres, hvilket likeledes skal skje på en måte som er skånsom for insulinet. After the gentle separation of the fat, there is a relatively large volume of extract freed from fat; this large volume must be reduced, which must also be done in a way that is gentle on the insulin.

Man kan benytte gelfiltrering og/eller ionebytterbehandling, men ifølge oppfinnelsen foretrekkes følgende måte: Det anvendes et ultra- og hyperfiltreringsanlegg som arbeider efter membranmetoden, såkalt omvendt osmosesystem (jfr. f.eks. US-patent 3.623.610). Gel filtration and/or ion exchange treatment can be used, but according to the invention the following method is preferred: An ultra- and hyperfiltration system is used that works according to the membrane method, a so-called reverse osmosis system (cf. e.g. US patent 3,623,610).

Ved anvendelse av denne metode kan det ved passende When applying this method, it may be appropriate

valg av membrantyper samtidig med konsentrering av væskevolumet, oppnås en separering av insulin fra urenheter i ekstrakten og ledsagestoffer, såvel stoffer med større molekyler enn insulinets, som stoffer med mindre molekyler. Man får ikke bare fjernet uønskede stoffer av pankreas-opprinnelse som finnes oppløst i ekstrakten, men også alle eventuelle andre molekyler av ikke-pankreas-opprinnelse med størrelse forskjellig fra insulinets, som ved feiltagelse eller uaktsomhet måtte være kommet med i pankreas-leveransene fra slakteriene, og derved også med i ekstrakten. selection of membrane types at the same time as concentration of the liquid volume, a separation of insulin from impurities in the extract and accompanying substances is achieved, both substances with larger molecules than those of insulin, as well as substances with smaller molecules. Not only are unwanted substances of pancreatic origin dissolved in the extract removed, but also any other molecules of non-pancreatic origin with a size different from that of insulin, which by mistake or negligence might have been included in the pancreas deliveries from the slaughterhouses , and thereby also included in the extract.

Frasepareringen på dette tidspunkt av langt største-delen av disse molekyler, dels større og dels mindre enn insulinet, ved ultra- og hyperfiltreringen, er av avgjørende betydning for å oppnå monokomponent-insulinet, idet disse urenheter her frasepareres på et tidspunkt hvor de befinner seg i oppløsning, og hvor de ikke har hatt mulighet for å innvirke skadelig på det oppløste insulin. The separation at this time of the far greater part of these molecules, partly larger and partly smaller than the insulin, by the ultra- and hyperfiltration, is of decisive importance to obtain the monocomponent insulin, as these impurities are separated here at a point where they are located in solution, and where they have not had the opportunity to adversely affect the dissolved insulin.

Den fettfrie klare ekstrakt pumpes gjennom ultra-filtreringsapparatet som er forsynt med tilstrekkelig avkjølings-mulighet for ekstrakten, f.eks. ved en temperatur på mellom ca. +10 og -10°C, fortrinnsvis mellom 0 og -10°C og ved et trykk på 2-20 atmosfærer, fortrinnsvis 6 atmosfærer, idet det velges en slik membrantype, f.eks. GRX-6 eller GRX-7 (polysulfon-membraner), at de store uønskede molekyler frasepareres så langt ned til insulinmolekylet som mulig. De store molekyler blir tilbake i konsentratet mens insulin og urenhetene med mindre molekylstørrelse enn insulinet går i permeatet (dvs. det som ikke holdes tilbake). Dette ledes derefter gjennom hyper-filtreringsapparatet hvor det er valgt en membrantype, f.eks. GR8-9 eller 930 (celluloseacetat), som fraseparerer største-parten av de uønskede molekyler mindre enn insulinet, og så The fat-free clear extract is pumped through the ultra-filtration apparatus which is provided with sufficient cooling for the extract, e.g. at a temperature of between approx. +10 and -10°C, preferably between 0 and -10°C and at a pressure of 2-20 atmospheres, preferably 6 atmospheres, choosing such a membrane type, e.g. GRX-6 or GRX-7 (polysulfone membranes), that the large unwanted molecules are separated as far down to the insulin molecule as possible. The large molecules remain in the concentrate, while insulin and the impurities with a smaller molecular size than the insulin go in the permeate (i.e. what is not retained). This is then passed through the hyper-filtration device where a membrane type has been selected, e.g. GR8-9 or 930 (cellulose acetate), which separates most of the unwanted molecules less than the insulin, and then

nær opptil insulinmolekylet som mulig. Insulinet blir tilbake i konsentratet. Man kan konsentrere utgangsekstrakten så sterkt as close to the insulin molecule as possible. The insulin remains in the concentrate. One can concentrate the starting extract so strongly

det ønskes, f.eks. til 1/5 til 1/40 av det opprinnelige volum. Konsentrasjonsforholdet alkohol:vann forblir det samme som i utgangsekstrakten. it is desired, e.g. to 1/5 to 1/40 of the original volume. The alcohol:water concentration ratio remains the same as in the starting extract.

De i ultra- og hyperfiltreringsanlegget anvendte membraner skal kunne motstå konsentrerte alkoholiske oppløsninger med f.eks. 62% alkohol. Det kan f.eks. - foruten membraner av polysulfoner og celluloseacetat som nevnt ovenfor - anvendes membraner fremstilt fra andre polymerer, f.eks. visse polyamider. The membranes used in the ultra- and hyperfiltration system must be able to withstand concentrated alcoholic solutions with e.g. 62% alcohol. It can e.g. - in addition to membranes of polysulfones and cellulose acetate as mentioned above - membranes made from other polymers are used, e.g. certain polyamides.

Angående konstruksjonen av ultra- og hyperfiltreringsanlegg kan f.eks. henvises til følgende patentskrifter: Regarding the construction of ultra- and hyperfiltration facilities, e.g. refer to the following patent documents:

US-patent 3.872.015, engelsk patent 1.390.671 og sveitsisk US Patent 3,872,015, English Patent 1,390,671 and Swiss

patent 542.639 hvor det er beskrevet utførelsesformer for anlegget og/eller deler derav. patent 542,639 where embodiments of the plant and/or parts thereof are described.

Det oppnådde konsentrat, som inneholder praktisk talt alt insulinet fra råekstrakten, er gjennomsiktig, men sterkere farvet enn råekstrakten på grunn av konsentreringen. Farge-stoffene utvaskes med f.eks. 62% alkohol over membraner som holder insulinet tilbake, men tillater farvestoffene å passere membranene. Hele det anvendte vaskevolum går sammen med farve-stoff ene i permeatet, mens konsentratets volum forblir uendret. The resulting concentrate, which contains practically all the insulin from the crude extract, is transparent but more strongly colored than the crude extract due to the concentration. The dyes are washed out with e.g. 62% alcohol over membranes that hold the insulin back but allow the dyes to pass the membranes. The entire washing volume used goes together with dye in the permeate, while the volume of the concentrate remains unchanged.

Samtidig med utvasking av farvestoffene utvaskes saltene i ekstrakten som stammer fra ekstraksjonen av pankreas. At the same time as the dyes are washed out, the salts in the extract that originate from the extraction of the pancreas are washed out.

De forholdsvis få oppløste urenheter som stadig er tilbake i den insulinholdige ekstrakt, kan hensiktsmessig frasepareres ved hjelp av ionebyttere, såvel kationebyttere som anionebyttere. Frasepareringen kan også skje ved hjelp av molekylsikt, f.eks. "Sephadex" G-50, fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige og andre egnede kjente separerings-metoder, men anvendelsen av ionebyttere foretrekkes. The relatively few dissolved impurities that still remain in the insulin-containing extract can be suitably separated by means of ion exchangers, both cation exchangers and anion exchangers. The separation can also take place using molecular sieves, e.g. "Sephadex" G-50, manufactured by Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden and other suitable known separation methods, but the use of ion exchangers is preferred.

Ionebytningsprosesser for rensing av insulin såvel efter kolonnemetoden som efter den satsvise metoden er kjente, i ganske særlig grad kolonnemetoden. Ion exchange processes for the purification of insulin both by the column method and by the batch method are known, in particular the column method.

Det er imidlertid ikke kjent å anvende disse metoder However, it is not known to use these methods

på en konsentrert alkoholisk råinsulinekstrakt fri for fett. on a concentrated alcoholic crude insulin extract free from fat.

De konvensjonelle alkoholiske råinsulinekstrakter med at fettet oppløst vil, særlig ved kolonnemetoden, tilsmusse ionebytterne i en slik grad med urenhetene, farvestoffene og fettet, at ionebytterne efter én eller to gangers adsorpsjon og eluering vil bli så urene at de meget vanskelig vil kunne renses og regenereres The conventional alcoholic crude insulin extracts with the fat dissolved will, especially in the column method, contaminate the ion exchangers to such an extent with impurities, dyes and fat that after one or two adsorption and elution the ion exchangers will become so impure that they will be very difficult to clean and regenerate

så de igjen kan anvendes til separering av insulinet. so they can again be used for separating the insulin.

Ved ionebyttings- eller molekylsiktprosesser er det In ion exchange or molecular sieve processes, it is

en betingelse at den behandlede ekstrakt er renset for fett, a condition that the treated extract is cleaned of fat,

og delvis også for farvestoffer, uvedkommende proteiner samt andre urenheter, i så stor utstrekning at ionebytterne og molekyl-siktstoffene kan regenereres og renses så de blir fullt brukbare gjennom lengere tid, idet deres anvendelse ellers vil bli økonomisk prohibitiv. and partly also for dyes, extraneous proteins and other impurities, to such a large extent that the ion exchangers and molecular sieves can be regenerated and purified so that they become fully usable over a longer period of time, as their use would otherwise be economically prohibitive.

En slik tilstrekkelig og nødvendig rensing oppnås nettopp ved den ovenfor beskrevne metode til for-rensing av den alkoholiske råinsulinekstrakt, som omfatter utkrystallisering av fettet ved så lav temperatur som omkring -40°C og fjernelse ved ultra-filtrering gjennom et omvendt osmoseanlegg av en del av farvestoffene samt en vesentlig del av molekyler større enn og mindre enn insulinmolekylet, nær inntil insulinmolekylets størrelse. Such sufficient and necessary purification is achieved precisely by the above-described method for pre-purification of the alcoholic crude insulin extract, which comprises crystallization of the fat at a temperature as low as around -40°C and removal by ultra-filtration through a reverse osmosis system of a part of the dyes as well as a substantial part of molecules larger than and smaller than the insulin molecule, close to the size of the insulin molecule.

Man kan anvende de fleste tilgjengelige typer ionebyttere, derunder ionebyttere på harpiksbasis og cellulosebasis samt de kjente "Sephadex" ionebyttere SP og QAE som er henholdsvis kationebyttere og anionebyttere og er modifiserte tverrbundne' dekstrankjeder med et tredimensjonalt nettverk av polysakkarid. Ionebytterne SP-"Sephadex" C-25 (kationebytter) og QAE-"Sephadex" A-25 (anionebytter) foretrekkes. You can use most available types of ion exchangers, including resin-based and cellulose-based ion exchangers as well as the well-known "Sephadex" ion exchangers SP and QAE, which are respectively cation exchangers and anion exchangers and are modified cross-linked dextran chains with a three-dimensional network of polysaccharide. The ion exchangers SP-"Sephadex" C-25 (cation exchange) and QAE-"Sephadex" A-25 (anion exchange) are preferred.

Man kan velge mellom kolonnekromatografi og satsvis separering på ionebytterne, eller eventuelt anvende begge metoder. You can choose between column chromatography and batch separation on the ion exchangers, or possibly use both methods.

Den satsviæmetoden har vist seg å ha enorme fordeler The satsviæ method has proven to have enormous advantages

i større industriell drift som en mellomfin til fin rensing som skytes inn mellom den omvendte osmoseseparering og -konsentrering og en kromatografisk rensing med ionebytter efter kolonnemetoden. Satsvis separering er en meget hurtig teknikk, og metoden for-årsaker ingen tekniske vanskeligheter som følge av svelning eller krymping av ionebytteren. Separering på ionebytter kan gjennom-føres ved binding av urenhetene, og tillater at kun insulinet forblir i oppløsning. Når ionebytteren er bragt i likevekt i den valgte egnede buffer ved insulinets isoelektriske punkt, in larger industrial operations as a medium to fine purification that is inserted between the reverse osmosis separation and concentration and a chromatographic purification with ion exchange according to the column method. Batch separation is a very fast technique, and the method causes no technical difficulties due to swelling or shrinking of the ion exchanger. Separation on ion exchanges can be carried out by binding the impurities, and allows only the insulin to remain in solution. When the ion exchanger is brought to equilibrium in the selected suitable buffer at the isoelectric point of the insulin,

pH 5,2, bringes den konsentrerte for-rensede råinsulin-ekstrakt ved pH 5,2 i kontakt med ionebytteren og det hele omrøres, f.eks. pH 5.2, the concentrated pre-purified crude insulin extract at pH 5.2 is brought into contact with the ion exchanger and the whole is stirred, e.g.

i 2 timer, hvorefter blandingen filtreres. Alle urenhetene er bundet til ionebytteren, mens det rene insulin befinner seg i oppløst tilstand i det alkoholiske filtrat, da insulinet ved for 2 hours, after which the mixture is filtered. All the impurities are bound to the ion exchanger, while the pure insulin is in a dissolved state in the alcoholic filtrate, as the insulin at

sitt isoelektriske punkt ikke bindes til ionebytteren. its isoelectric point does not bind to the ion exchanger.

Fordelen ved denne prosess er at insulinet ikke behøver å elueres fra ionebytteren, og at insulinekstrakten umiddelbart efter filtreringen kan gå videre til neste prosesstrinn. The advantage of this process is that the insulin does not need to be eluted from the ion exchanger, and that the insulin extract can proceed to the next process step immediately after filtration.

Ionebytterne regenereres på kjent måte. The ion exchangers are regenerated in a known manner.

Omvendt kan man også binde insulinet og de øvrige proteiner på ionebytteren og derefter eluere i fraksjoner ved å resuspendere blandingen i en buffer av høyere ionestyrke eller endret pH. Ved denne siste metode kan det oppnås mindre tap av insulin enn ved den førstnevnte metode, hvorfor den siste foretrekkes. Conversely, you can also bind the insulin and the other proteins on the ion exchanger and then elute in fractions by resuspending the mixture in a buffer of higher ionic strength or changed pH. With this latter method, less loss of insulin can be achieved than with the former method, which is why the latter is preferred.

Metoden kan i hovedtrekkene f.eks. utføres på følgende må te: 300 g tørr SP-"Sephadex" C-25 ble svellet i 2 døgn i 1000 ml buffer, 0,1 molar eddiksyre (HAc) i 62% etanol, pH 3,0. Bufferen ble utskiftet flere ganger. Den svellede SP-"Sephadex" veiet 720 g. The main features of the method can e.g. is carried out as follows: 300 g of dry SP-"Sephadex" C-25 was swollen for 2 days in 1000 ml of buffer, 0.1 molar acetic acid (HAc) in 62% ethanol, pH 3.0. The buffer was replaced several times. The swollen SP-"Sephadex" weighed 720 g.

1000 ml ekstrakt, konsentrert 10 ganger fra osmosen med et innhold av 18000 i.e. insulin, ble justert til pH 3,0, 1000 ml extract, concentrated 10 times from the osmosis with a content of 18000 i.e. insulin, was adjusted to pH 3.0,

og ble omrørt i en roterende beholder (12 omdr./min.) i 1 1/2 time med halvdelen av den svellede ionebytter for adsorpsjon. Efter filtrering under vakuum ble adsorpsjonen av filtratet fortsatt på den siste halvdel av ionebytteren (360 g svellet), likeledes i 1 1/2 time. Væsken på toppen viste et insulininnhold på 288 i.e. svarende til 1,6% tap ved adsorpsjonen. and was stirred in a rotating vessel (12 rpm) for 1 1/2 hours with half of the swollen ion exchanger for adsorption. After filtration under vacuum, the adsorption of the filtrate was continued on the last half of the ion exchanger (360 g swollen), likewise for 1 1/2 hours. The liquid on top showed an insulin content of 288 i.e. corresponding to 1.6% loss during adsorption.

En slik dobbeltadsorpsjon har vist seg å nedsette tapet til en tredjedel av tapet ved en enkeltadsorpsjon. Such double adsorption has been shown to reduce the loss to one-third of the loss with single adsorption.

Nu ble det skiftet til buffer: 1000 ml 0,1 molar HAc Now it was changed to buffer: 1000 ml 0.1 molar HAc

i 62% etanol, pH 3,0 med 0,075 mol NaCl. Urenheter ble eluert ved omrøring i 2 timer, mens insulinet ikke ble eluert. in 62% ethanol, pH 3.0 with 0.075 mol NaCl. Impurities were eluted by stirring for 2 hours, while the insulin was not eluted.

Efter filtrering ble buffer skiftet: 1000 ml 0,1 molar tris(hydroksymetyl)aminometan (tris) i 6 2% etanol, pH 8,0, hvorefter ionebytteren SP ble eluert for insulinet. Insulininnhold 17000 i.e. med et tap ved elueringsprosessen på 4%. Samlet tap 5,6%. After filtration, the buffer was changed: 1000 ml of 0.1 molar tris(hydroxymethyl)aminomethane (tris) in 6 2% ethanol, pH 8.0, after which the ion exchanger SP was eluted for the insulin. Insulin content 17000 i.e. with a loss in the elution process of 4%. Total loss 5.6%.

Ionebytteren ble vasket to ganger for å fjerne insulin-rester heftet til ionebytteren. The ion exchanger was washed twice to remove insulin residues attached to the ion exchanger.

Ved polyakrylamidgelelektroforese (med 15% polyakrylamid) viste det seg fire, tildels svakere, bånd over insulinbåndet, mens det ikke fantes noen bånd under insulinbåndet. Dette vil si at det delvis rensede insulin ikke er blitt deamidert under fremstillingsprosessen. Det er fritt for monodesamidoinsulin, hvilket er noe helt nytt ved fremstillingen av insulin. Polyacrylamide gel electrophoresis (with 15% polyacrylamide) showed four, partly weaker, bands above the insulin band, while there were no bands below the insulin band. This means that the partially purified insulin has not been deamidated during the manufacturing process. It is free of monodesamidoinsulin, which is something completely new in the production of insulin.

Ionebytteren ble efter elueringen og vaskingen behandlet under langsom omrøring med 6 2% etanol tilsatt 0,2-0,3 mol NaCl i 2-3 timer. Derefter ble ionebytteren regenerert med likevekts-buffer pH 3, og den var nu fullstendig ren, kritthvit og klar til neste sats. After the elution and washing, the ion exchanger was treated under slow stirring with 6 2% ethanol to which 0.2-0.3 mol NaCl was added for 2-3 hours. The ion exchanger was then regenerated with equilibrium buffer pH 3, and it was now completely clean, chalk white and ready for the next batch.

Den satsvise prosessen kan med fordel utføres i et apparat av særskilt konstruksjon, Y-formet med regulerbart omdreinings-tall. Denne form gir en meget effektiv og skånsom behandling av ionebytteren ved adsorpsjonen og elueringen, samtidig med at tapet såvel ved adsorpsjonen som ved elueringen nedsettes til et minimum. Hele prosessen kan finne sted uten at ionebytteren fjernes fra apparatet som er forsynt med filtrerings-anordning og vakuumbeholder for hurtig filtrering av væsken fra ionebytteren. The batch process can advantageously be carried out in an apparatus of special construction, Y-shaped with an adjustable number of revolutions. This form provides a very efficient and gentle treatment of the ion exchanger during adsorption and elution, while at the same time the loss during both adsorption and elution is reduced to a minimum. The entire process can take place without the ion exchanger being removed from the apparatus, which is equipped with a filtering device and vacuum container for rapid filtration of the liquid from the ion exchanger.

Prosessen består av følgende delprosesser: The process consists of the following sub-processes:

1) Adsorpsjon på ionebytteren, pH 3, av insulinet og eventuelt andre proteiner fra den konsentrerte råinsulin-ekstrakt i 2 trinn med mellomliggende vakuumfiltrering. 2) Vakuumfiltrering og fjernelse av den proteinfrie ekstrakt. 1) Adsorption on the ion exchanger, pH 3, of the insulin and possibly other proteins from the concentrated crude insulin extract in 2 steps with intermediate vacuum filtration. 2) Vacuum filtration and removal of the protein-free extract.

3) Vasking av ionebytteren 2 ganger med 62% etanolbuffer, 3) Washing the ion exchanger 2 times with 62% ethanol buffer,

pH 3, og frafiltrering av vaskevæskene. pH 3, and filtering off the washing liquids.

4) Eluering av urenheter med buffer pH 3, ionestyrke 0,075 mol NaCl, 2 timer, 12 omdr./min. 4) Elution of impurities with buffer pH 3, ionic strength 0.075 mol NaCl, 2 hours, 12 rpm.

5) Filtrering av elueringsvæsken med inneholdte urenheter. 5) Filtration of the elution liquid with contained impurities.

6) 2 gangers vasking av ionebytteren med 62% etanolbuffer, pH 3. Filtrering. 7) Eluering av insulinet med buffer 0,1 molar tris i 62% etanol, pH .8. Hele blandingen, elueringsvæske og ionebytter, skal justeres til pH 8 med tris. Ione-bytterens pH var 3. 6) Washing the ion exchanger twice with 62% ethanol buffer, pH 3. Filtration. 7) Elution of the insulin with buffer 0.1 molar tris in 62% ethanol, pH .8. The entire mixture, elution liquid and ion exchanger, must be adjusted to pH 8 with tris. The pH of the ion exchanger was 3.

8) Filtrering av elueringsvæsken inneholdende insulinet. 8) Filtration of the elution liquid containing the insulin.

9) 2 ganger vasking av ionebytteren for fjernelse av insulin-rester heftet til ionebytteren. 9) Washing the ion exchanger twice to remove insulin residues attached to the ion exchanger.

10) Rensing og regenerering av ionebytteren. 10) Cleaning and regeneration of the ion exchanger.

Den samlede produksjonssyklus fra 1-9 tar 12 timer + rensning og regenerering av ionebytteren 4 timer - ialt 16 timer. The overall production cycle from 1-9 takes 12 hours + cleaning and regeneration of the ion exchanger 4 hours - a total of 16 hours.

Elueringsekstrakten fra fase 7 kan efter justering av The elution extract from phase 7 can, after adjustment of

pH og ionestyrke tilføres direkte på katione- eller anionebytter efter de kjente metoder på kolonner. Denne prosess foregår best på programstyrte kolonner med automatisk fraksjonering hvor man tar ut den sentrale del av insulinkurven som nu inneholder det rene insulin som kun oppviser 1 bånd ved polyakrylamidelektroforese med 15% polyakrylamid. pH and ionic strength are added directly to cation or anion exchangers according to the known methods on columns. This process is best carried out on program-controlled columns with automatic fractionation, where the central part of the insulin curve is taken out, which now contains the pure insulin which only shows 1 band by polyacrylamide electrophoresis with 15% polyacrylamide.

Fra det konsentrerte insulinholdige eluat fra den siste kolonne kan insulinet utvinnes på vanlig måte, dvs. ved fortynning av oppløsningen og påfølgende utfelning, f.eks. ved tilsetning av sinkioner. From the concentrated insulin-containing eluate from the last column, the insulin can be recovered in the usual way, i.e. by dilution of the solution and subsequent precipitation, e.g. by adding zinc ions.

Det har imidlertid ifølge oppfinnelsen vist seg at det ikke er nødvendig å foreta en fortynning av den høykonsentrerte vandige alkoholiske ekstrakt før utfelning. Ekstrakten kan felles direkte med f.eks. sinkioner når tilsetningen herav skjer kaldt, f.eks. ved -30 til -45°C. According to the invention, however, it has been shown that it is not necessary to dilute the highly concentrated aqueous alcoholic extract before precipitation. The extract can be combined directly with e.g. zinc ions when they are added cold, e.g. at -30 to -45°C.

Man kan således sette en sinkacetatoppløsning til filtratet, og derefter sette oppløsningen i 24 timer i fryserom ved -35°C. Herved utfelles insulinet kvantitativt fra den f.eks. 62%ige alkoholiske oppløsning. Det utfelte insulin sentrifugeres fra, vaskes f.eks. med aceton og tørres. Om ønsket kan det senere krystalliseres. You can thus add a zinc acetate solution to the filtrate, and then put the solution for 24 hours in a freezer at -35°C. In this way, the insulin is quantitatively precipitated from the e.g. 62% alcoholic solution. The precipitated insulin is centrifuged off, washed e.g. with acetone and dried. If desired, it can later be crystallized.

Det ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte insulin The insulin produced by the present method

er som nevnt rent monokomponent-insulin som kun viser en enkelt komponent når det analyseres ved polyakrylamidgelelektroforese (DISC PAGE) under anvendelse av en 15% konsentrasjon av polyakryl-amidet (angående det generelle prinsipp ved denne metode henvises til Ann. N.Y. Acad. Sei., 121, side 321-349 og 404-427 (1964)). is, as mentioned, pure monocomponent insulin which only shows a single component when analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (DISC PAGE) using a 15% concentration of the polyacrylamide (regarding the general principle of this method refer to Ann. N.Y. Acad. Sei. , 121, pp. 321-349 and 404-427 (1964)).

har vist seg å være overordentlig stabilt i motsetning til de kjente høyrensede insuliner, hvor det f.eks. ofte under opp-bevaringen dannes ytterligere små mengder desamidoinsulin. Man vet ikke hva dette skyldes, men grunnen kan muligens være at has proven to be extremely stable in contrast to the known highly purified insulins, where e.g. often during storage additional small amounts of desamidoinsulin are formed. It is not known what causes this, but the reason could possibly be that

de fremstilte insuliner til tross for den vidtgående rensing stadig inneholder spor av stoffer som virker nedbrytende på insulinet. the manufactured insulins, despite the extensive purification, still contain traces of substances that have a degrading effect on the insulin.

Det ved foreliggende fremgangsmåte fremstilte insulin viser ikke en slik nedbrytning, noe som kan skyldes den mer fullstendige fjernelse av alle stoffer med annen molekylstørrelse enn insulinet. The insulin produced by the present method does not show such degradation, which may be due to the more complete removal of all substances with a different molecular size than the insulin.

Av det beskrevne rene insulin kan det fremstilles insulinpreparater på vilkårlig kjent måte, f.eks. ved oppløsning og/eller suspendering av insulinet i amorf og/eller krystallinsk form, i et vandig medium egnet til injeksjon, infusjon eller implanteringsteknikk. From the pure insulin described, insulin preparations can be prepared in any known manner, e.g. by dissolving and/or suspending the insulin in amorphous and/or crystalline form, in an aqueous medium suitable for injection, infusion or implantation techniques.

Claims

1. Process for the preparation of insulin which is purified to such an extent that it shows only a single component when analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis using a gel containing 15% polyacrylamide, by which method an extract of insulin from pancreatic glands is prepared, which extract is processed in several stages into pure insulin, characterized by the processing taking place at temperatures that do not significantly exceed room temperature, and taking place in such a way that during the entire processing process until the final extraction, the insulin is kept in a dissolved state in a solvent consisting of a mixture of water and an organic solvent, which mixture contains at least 50% organic solvent by volume, or is successively kept dissolved in several different solvents of this type, since the unwanted substances, from the beginning to the end of the process, are removed from the various solvents used, until pure insulin is present in a solvent that is free from impurities, whereupon the insulin is precipitated from the solvent, if desired, as known per se with metal ions, preferably zinc ions.

2. Method according to claim 1, characterized in that aqueous ethyl alcohol or aqueous acetone with at least 50% of the organic solvent is used as solvent or solvents;

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the insulin-containing extract, after having been subjected to a treatment for the removal of fat, preferably consisting in cooling the extract to a temperature below -25°C and subsequent separation of the secreted fat crystals, is concentrated by reverse osmosis using two different membranes, one of which separates out impurities with larger molecules than the monoinsulin that go into the permeate, and the other separates out impurities with smaller molecules than the monoinsulin that remain in the concentrate, after which the insulin-containing concentrate is subjected to further purification by ion exchange and/or gel filtration, possibly after prior washing in an osmosis apparatus to remove dyes and salts from the concentrate.

4. Method according to claim 1, 2 or 3 for precipitation of the insulin, characterized in that the metal ions are added to the concentrated purified solution under strong cooling, e.g. to -30 to -45°C.