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Verfahren zur Reinigung von Insulin Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Reinigung von Insulin.
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Als Insulin-Ausgangmaterial für das Reinigungscerfahren wird gewöhnlich
handelsübliches Insulin verwendet, d.h.
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amorphes Insulin oder kristallines Insulin, das mehrmals kristallisiert
worden sein kann. Man kann aber auch Rohinsulin verwenden wie z.B. den insulinhältigen
Salzkuchen, der während der Gewinnung von Insulin aus Pankreasdrüsen gebildet wird
und gewöhnlich 10-30 Gew.% Insulin enthält, doch ist dieses Ausgangsmaterial wegen
seines hohen Gehaltes an Verun reinigungen für die erfindungsgemässe Reinigung weniger
gut geeignet. Ein besseres Ausgangsmaterial kann erhalten werden, wenn r.'an eine
Lösung des Salzkuchens durch Einstellen des phl-Wertes der Lösung auf 5,5 einer
isoelektrischen Ausfällung unterzieht und den Niederschlag abzentrifugiert.
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Unrsprünglich wurde allgemein angenommen, dass richtig umkristalisiertes
Insulin in der Form scharfkantiger, durch ebene Kristallflächen begrenzter Rhomboeder
das reine Protc in Insulin darstellte, dessen Konfiguration von Sanger und Mitarbeitern
festgelegt
werden war, siehe z. B. Biochemical Journal 50 (1955), 556. Später wurde jedoch
gefunden, dass dies nicht zutrifft. Wissenschaftliche analytische Untersuchungen
zeigten, dass das vorgenann-te kristalline Insulin Proteine aus dein Pankreas mit
einem höheren Molekulargewicht als demjenigen des reinen Insulins und ausserdem
insulinähnliche Substanzen mit ungefähr dem gleichen Molekulargewicht wie demjenigen
des reinen Insulins etwa 6000 enthält.
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So konnte nachgewiesen werden, dass kristallines Insulin, in 1 m
Essigsäure gelöst, an einer Kolonne aus Sephadex G-50 [mit Epichlorhydrin vernetztes
Dextran mit einer Obergrense der Durchdringbarkeit von ungefähr 10.000 (Mindest-Molgewicht
der ausgeschlossenen Substanzen) in Form von Perlen mit 20-80 /u Durchmesser; Herstellerfirma
PHARMACIA, Uppsala, Schweden 7 in Komponenten (a), (b) und (c) aufge= trennt werden
kann. Diese drei Komponenten lassen sich aus ihren Lösungen nach üblichen methoden,
z.B. Aussalzen, Ausfällen mit einem Zinksalz bei neutraler Reaktion, Ge= friertrocknung
usw. isolieren. Jede der Komponenten (a) und (b) enthält Pankreas-Proteine mit einem
Molekulargewicht über 6000, während die Komponente (c) reines Insulin, ver= unreinigt
mit insulinartigen Proteinen von etwa dem gleichen Molekulargewicht wie demjenigen
des reinen Insulins, enthält.
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Die Menge der Komponente (a) kann 2-5 Gew.-0/o des kristallisierten
Insulins betragen und weniger als 1 Gew.-% des rekristallisierten Insulins. Die
Menge der Komponente (b) kann in beide Fällen 4-8 Gew.-% ausmachen, und die Menge
der insulinartigen Proteine in der Komponente (c) kann 5-13 Gew.-% der Komponente
(c) betragen
Immunologische Tierversuche, welche die Grundlage für
die vortiegende Erfindung lieferten, zeigten, dass die oben genannten Komponenten
(a) und (b) und bis zu einem gewissen Ausmass auch die insulinartigen Proteine in
der Komponente (c) im Prinzip für das antigene Verhalten der bisher bekannten Insulinpräparate
verantwortlich sind.
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Die Erfindung bezweckt, in einfacher und wirksamer Weise die Verunreinigungen
zu entfernen, die nicht nur in rohem Insulin, sondern insbesondere auch in handelsüblichem
Insulin enthalten sind, so dass das gereinigte Insulin keine oder wesentlich verringerte
antigene Eigenschaften besitzt.
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Das erfindungsgemä.sse Verfahren ist dadurch gekenn= zeichnet, dass
man handelsübliches oder rohes Insulin der Säulenchromatographie an einem vorzugsweise
stark basischen Anionenaustauscher unter Verwendung eines wasserháltigen, mit '.Wasser
mischbaren organischen Lösungsinittels, vorzugsweise eines aliphatischen Alkohols,
als Elutionsmit-tel, unterwirft, jene Fraktionen sammelt, welche dem mittleren Hauptteil
der Insulinspitze entsprechen und bei der Analyse durch Polyacryl= amidgel-Elektrophorese
(DISC PAGE) im wesentlichen eine einzige Komponente zeigen, und das gereinigte Insulin
aus den gesammelten Fraktionen gewinnt. Es überraschend, dass es möglich ist, durch
einmalige Säulenchromatographie Insulin von so hoher Reinheit wie der vorstehend
angegebenen zu er= halten.
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Für analytische Zwecke wurde schon früher diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese
(DISC PAGE) verwen
det, u. zw. auch im Zusammenhang mit kristallinem
Insu]in.
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Diese spezielle Gel-Elektrophorese wurde von B.J. Davis und L.
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Ornatein entwickelt und ist in Ann. N,Y. Acad. Sci., 121, S.
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321-349 und 404-427 (1964) beschrieben.
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Es ist bekannt, zur Gewinnung von Insulin sauere oder neutralisierte
alkoholische Pankreas-Extrakte der Säulenchromatographie an einem Kationenaustauscher,
z.B. Alginsäure (U.'.A. Patentschrift Nr. 2,878.159), Carboxymethylcellulose (französ.
Patentschrift Nr. 1.499.126), sulfonierten Harzen, die aus dem Telomer von Styrol
und Divinylbenzol syntheti= siert sind (brit. Patentschrift Nr. 1.054.523), oder
an einem Anionenaustauscher wie Diäthylaminoäthyl-cellulose (U.S.A.
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Patentschrift Nr. 3.069.323) zu unterwerfen. Das nach diesen Verfahren
erhaltene Insulin enthält jedoch Verunreinigungen, ebenso wie das kristalline Insulin,
das nach den gebräuchlichen Gewinnungsmethoden einschliesslich mehrmaliger Ausfällung
durch Aus salzen aus den Rohinsulinlösungen mittels Natriumchlorid erhalten wird.
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Auch ist es -aus der brit. Patentschrift Nr. 881.855 bekannt, nicht
näher spezifiziertes Insulin der Säulenc@chromatographie an dein Kationenaustauscher
"DoweX 50-X1" (einem sulfonierten Styrol-Divinylbenzolcopolymer in Perlenform, hergestellt
von The Dow Chemical Company, Midland U.S.A.) zu unterwerfen, wobei wässriges lithanol
als Elutionsmittel verwendet wird; aber selbst wenn rekristallisiertes Insulin als
Ausgangsmaterial verwendet wird, zeigt das gewonnene Insulin in der llauptsache
dieselben Verunreinigungen wie
das Ausgangsmaterial.
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Ferner ist aus der brit. Patentschrift Nr. 913.042 be kann, kristallines
insulin, das mit amorphen oder mikrokri= stallinen Fremdstoffen vermischt ist, dadurch
zu reinigen, dass man das unreine Kristallisat mit einer wässrigen Flüssigkeit wäsch-t,
deren pH-Wert mit Hilfe einer schwachen Säure oder eines Puffergemisches auf 3,8-4,3
eingestellt ist. Dieser Reinigungs= vorgang entfernt jedoch nicht Verunreinigungen
wie Proinsulin, das Dimer oder das intermediat.
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Schliesslich wird in der brit. Patentschrift Nr. 871.541 vorgeschlagen,
6-mal kristallisiertes Insulin und Insulin, das wie von Lens (Biochem. et Biophys.
Acta (4948), 2, 76) beschrieben, gereinigt worden war, der Säulenchromatographie
an einem Styrol-DivinylbenzoSpolymer-Kationenaustauscher zu unterziehen, der auf
einem inerten Streckmittel mit grosser Oberfläche abgelagert ist; doch auch nach
dieser Chromatographie wird das Insulin immer noch Verunreinigungen wie Proinsulin,
das Dimer und das Intermediat zusammen mit Arginininsulin und Monodesamido-insulin
enthalten, da durch die Anwesenheit dieser Verunreinigungen nicht verhindert wird,
dass das Chromatogramm so aussieht, als wäre das aus der Kolonne eluierte ljiaterial
im wesentlichen homogen.
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Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Anionenaustauscher
sind an sich bekannt. Beispiele von schwach basischen Anionenaustauschern sind Bio-Gel
DM, her= gestellt auf der Basis von Polyacrylamiden, DEAE-Sephadex,
hergestellt
aus vernetzten Dextranen, und DnAR-Cellulose, hergestellt aus Cellulose. Beispiele
für stark basische Anionenaustauscher sind Dowex 1, hergestellt aus Polystyrolen,
und QAE-Sephadex, hergestellt aus vernetzten Dextranen. Die Sephadex-Anionenaustauscher
werden von der Firma PHARMACIA, Uppsala, Schweden, erzeugt.
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Beispiele für wasserhältige, mit Wasser mischbare organische Elutionslösungsmittel
sind Tetramethylharnstoff, Dimethylformamid, Dioxan, mit wasser mischbare Ketone
wie Aceton, und niedere Alkohole wie ethanol, Athanol und Pro= panole. Bevorzugt
werden die Alkohole, die in einer Kon zentration von 30-80% (v/v), vorzugsweise
50-70% (v/v), verwendet werden.
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Wenn das Elutionsmittel weniger als 50% (v/v) des niit Wasser mischbaren
organiscilen Lösungsmittels enthält, kann es als wässriges Medium bezeichnet werden.
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Das Elutionsmittel enthält immer einen Puffer zur Kontrolle seines
pH-Wertes. Vorzugsweise wird bei konstantem pH-Wert gearbeitet. Der pH-Wert des
lutionsmittels innerhalb des Bereiches von 6 - 10, vorzugsweise 6,5 - 8,5, gemessen
mittels einer in der üblichen gleise gegen einen Standardpuffer eingestellten Glaselektrode,
gehalten werden.
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Geeignete Puffersubstanzen finden sich in der verfü= baren Literatur.
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Es ist wesentlich, dass die Temperatur während des Ionenaustauschvorganges
im wesentlichen konstant ist. Die Temperatur kann innerialb eines Bereiches von
-10 bis 40°C, vorzugsweise 0 bis 30°C, gewählt werden.
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I)as gereinigte Insulin kann aus den gesammelten Fraktionen in üblicher
Weise gewonnen werden, z.B. durch Ein dampfen, aussalzen oder Ausfällen in amorpher
oder kristalliner Form in Anwesenheit von Zinkionen.
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Beispiel 1 Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung herge stellt:
0,1 m NICl 0.02 rn Ni-13 60% (v/v) Äthanol pH 8,3 bei 25°C 15 g Dowex 1x2 (mesh:
50/100) werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert.
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Das material wird zum Packen einer Säule von 1,6 cm Durch= messer
und 25 cm Höhe verwendet, welche mit dem Puffer equili= briert wird. Dowex 1x2 ist
ein Copolymer aus Styrol und 2% Divinylbenzol in Perlenform mit B enzyltrimethylammoniumgruppen
als funktionelle Gruppen und wird von The Dow Chemical Companyof Midland, U.S.A.,
hergestellt, 500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristalli= sierten Insulins
werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz, 5
ml Puffer, 5 ml 60%-igem (v/v) Äthanol und 0.04 ml 13,3 m NH3 gelöst (End-pH 8,5).
Unlöschliches Material wird abzentrifugiert und die klare Lösung wird auf die Spüle
aufgebracht. Die Elution erfolgt
mit dem Puffer bei einer Temperatur
von 25 0C mit; 7,5 ml/h. Es werden Fraktionen von je 5 ml aufgefangen.
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Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern
aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze)
entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz
von 100 ml Wasser, 1,3 ml 1 n HCl und 2 ml 1 m Zinkacetat je 100 ml der vereinigten
Fraktionen ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in an sich bekannter
Weise aus einem acetonhältigen Citratpuffer kristEll::siert.
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Die Ausbeute an gereinigtem Insulin betragt 200 mg.
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Beispiel 2 Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung herge= stellt:
25 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan 29,0 ml 6 n HCl 1,2 1 Methanol Wasser bis
zu einem Gesamtvolumen von 2 1 pH 7,3 bei 250C 40 g QAE-Sephade-x A-25 werden in
dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert'.- Das
Material wird zum Packen eine Säule von 2,5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet.
Die Säule wird mit dem Puffer equilibriert. QAE-Sephadex A-25 ist ein mit Epichlorhydrin
vernetztes Dextran mit einer Obergrenze der Durchdringbarkeit von ungefähr 5000
(Mindest-Molgewicht der ausgeschlossenen Substanzen), welches Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylgruppen
als
funktionelle Gruppen trägt, in Form von Perlen mit 40 - 120 µ Durchmesser; hergestellt
von PHARMACIA, Uppsala, Schweden.
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500 mg eines einmal aus einem Citratpuffer kristalli= sierten Insulin
werden in einer Mischung von 20 mg äthylen diamintetraessigsäure-dinatriumsalz,
94 mg Tris . thydroxyme-thyl) aminomethan, 10 ml 60%-igem (v/v) Methanol und O.073
ml 6 n HCl gelöst (End-pH 7,3). Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und
die klare Lösung auf die Säule aufgebracht.
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Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 250C' mit 30 ml/h. Frak= tionen
von je 5 ml werden aufgefangen.
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Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern
aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der grössten-Spitze)
entsprechenden Frak= tionen werden vereinigt und das Insulin durch Zusatz von 100
ml Wasser und 2 ml 1 m Zinkacetat je 100 ml der vereinigten Fraktionen ausgefällt.
Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen
Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an gereinigtem Insulin beträgt 250 mg.
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Beispiel 3 Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt;
o.Q6 rn Tris (hydroxymethyl)aminomethan 0,02 n HCl 0,075 Nagel 60%-iges (v/v) Äthanol
pH 8,3 bei 25°C
8Q g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers
werden in dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert.
Das Material wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 50 cm Höhe verwendet.
Die Säüle wird mit dem Puffer equilibriert.
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2,5 g eines einmal aus einem Citratpuffer kristalli= sierten Insulins
werden bei 0°C in einer Mischung von 450 mg Tris (hydroxymethyl ) aminomethan, 100
mg ÄthylendiamintetraessigsSure-dinatriumsalz, 25 ml des Puffers, 25 ml 60%-iges
(v/v) Athanol und 0,08 ml 4 n HOl gelöst (End-pH bei 2-50C: 8,4). Das unlösliche
Material wird bei 2 - 40C abzentrifu= giert und der klare Uberstand wird auf die
Säule aufgebracht.
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Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 40C mit 26 ml/h.
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Fraktionen von je 20 ml werden aufgefangen.
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Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern
aufgetragen. Die dem mittleren Haupt teil der Insulinspitze (der grössten Spitze)
entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz
eines gleichen Volumens von 0.02 m Zinkacetat + 0,03 n HCl ausgefällt. Der Niederschlag
wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem aeetonhältigen Citratpuffer
kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 1,3 g gereinigtes Insulin.
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Beispiel 4 Ein Puffer folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
14,9 g Histidinium-monochlorid 38,7 ml 1 n NaOfI 16,1 g NaCl
3,12
l 96%-iges (v/v) Äthanol Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 5 1 pH 6,5 bei 25°C
35 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer quellen
gelassen und die feinsten Teilchen werden abzentrifugiert. , Das Material wird zum
Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 25 ciii Höhe verwendet. Die Säule
wird mit dein Puffer equilibriert.
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500 mg eines einmal aus einem Citratpuf-fer kristallisier= ten Insulins
werden in einer Mischung von 20 mg Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, 6,5
ml des Puffers und 6 ml 60%-igem (v/v) Ethanol gelöst und das pH wird mit 1 n NaOH
auf 6,8 eingestellt. Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare
Lösung wird auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei 25
0C mit 30 ml/h. Es werden Fraktionen von je 5 ml gesammelt, Die Extinktionen bei
276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern aufgetragen. Die dem mittleren
Hauptteil der Insulinspitze (der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden
vereinigt und das Insulin durch Zusatz eines gleichen Volumens 0.02 m Zinkacetat
ausgefällt. per Nieder schlag wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem
acetohältigen Citratpuffer kristallisiert. Die Ausbeute an gereinigtem Insulin beträgt
210 mg.
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Beispiel 5 -Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung herde stellt:
1,25 kg Tris (hydroxymethyl)aminomethan
725 ml 12,3 n HCl 62,4
1 96%-iges (v/v) Ethanol Wasser bis zu einem Gesamtvolumen- von 100 1 pH 7,3 bei
250C 1;3 kg des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in dem Puffer
quellen gelassen und die-feinsten Teilchen werden abdekantiert. Das Material wird
zum Packen einer Säule von 15 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die Säule
wird mit dem Puffer equilibriert.
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18 g rekristallisiertes Schweine- oder Rinder-Insulin, welches ungefähr
0,4% Zn enthält werden in einer Mischung von 0,72 g Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz,
10,2 g Tris (hydroxymethyl)aminomethan und 720 ml 60%-igem (v/v) Athanol gelöst.
Das unlösliche Material wird abzentrifugiert Die klare Lösung wird nach Zusatz von
10,7 ml 6 n HCl auf die Säule aufgebracht. Die Elution erfolgt mit dem Puffer bei
250C und mit 1,2 l/h. Es werden Fraktionen von je 0,51 ge= sammelt.
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Die Extinktionen bei 276 nm (E276) werden gemessen und gegen die
Volumteile des Eluats aufgetragen. Die dem mittleren=Hauptteil der Insulinspitze
(der grössten Spitze) entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin
wird durch Zusatz eines gleichen Volumens von-O,02 m Zink= acetat ausgefällt. Der
Niederschlag wird'abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen
Citratpuffer kri= stallisiert.
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Die Ausbeute beträgt 8,2 g gereinigtes Insulin.
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Das Insulin wird aus einem Puffer folgender Zusam= mensetzung umkristallisiert:
2,0%
Insulin 0,8% Zn+ F (als Chlorid) berechnet auf das Gewicht des Insulins), 0,1 m
Natriumacetat 7,0% Natriumchlorid HCl bis einem pH von 5,45 - 5,55.
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Das Insulin wird in HCl und ZnCl2 enthaltendem Wasser gelöst, wonach
eine erforderliche Menge an einer Lösung von Natriumacetat und Natriumchlorid zugesetzt
wird. Die Kristal lisation erfolgt bei Raumtemperatur un-ter mechanischem Rühren.
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Sie ist innerhalb von 1 bis 2 Tagen vollendet. Das Drklsulin wird
abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Die Ausbeute beträgt 8,0 g.
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Das gereinigte Insulin kann zur Herstellung aller Arten von pharmazeutischen
Jnsulinpräpäraten für den -klinischen Gebrauch verwendet werden.
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Beispiel 6 Es wird ein Puffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
0,1 m NH4Cl 0,0036 n NH3 60%-iges (v/v) Äthanol pH 7,7 bei 250C.
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40 g des in Beispiel 2 verwendeten Anionenaustauschers werden in
dem Puffer quellen gelassen und die feinsten Teilchen werden abdekantiert Das Material
wird zum Packen einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 25 cm Höhe verwendet. Die
Säure wird mit dem Puffer equilibriert.
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1 g rekristallisiertes Rinder-Insulin mit einem Gehalt von ungefähr
0,4% Zn wird in 10 ml 60%-igem (v/v) Athanol, 10 ml des Puffers, 0,5 ml einer 0,2
m Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz und 0,04 ml 14 n Ammoniak
(End-pH 7,7) gelöst. Das unlösliche Material wird abzentrifugiert und die klare
Lösung wird auf die Säule auf= gebracht. Die. Elution. erfolgt mit dem Puffer bei
einer Tempera-tur von 25 0C mit 25 ml/h. Es werden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen.
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Die Extinktionen bei 276 nm werden gemessen und gegen die Fraktionsnummern
aufgetragen. Die dem mittleren Hauptteil der Insulinspitze (der'grössten Spitze)
entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und das Insulin wird daraus durch Zusatz
eines gleichen Volumens von 0,02 m Zinkacetat + 0,003 n HCl ausgefällt, Der Niederschlag
wird abzentrifugiert und in bekannter Weise aus einem acetonhältigen Citrat= puffer
kristallisiert. Die-Ausbeute an reinem Insulin beträgt 0,6 g.