DE3446927A1

DE3446927A1 - Verfahren zur herstellung von fructose-1,6-diphosphatsaeure

Info

Publication number: DE3446927A1
Application number: DE19843446927
Authority: DE
Inventors: Guglielmo Mario Rom/Roma Bisso; Massimo Diana
Original assignee: Biomedica Foscama Industria Chimico Farmaceutica SpA
Current assignee: Biomedica Foscama Industria Chimico Farmaceutica SpA
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1985-07-04
Anticipated expiration: 2004-12-22
Also published as: GB2152056B; GB8432116D0; JPS60156697A; DE3446927C2; US4575549A; GB2152056A; ES539007A0; IT1175309B; ES8605282A1; IT8324355A0; FR2557113B1; FR2557113A1

Description

BIOMEDICA FOSCAMA INDUSTRIA CHIMICO-FARMACEUTICA S.p.A.

Rom/ Italien

Verfahren zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphat-

säure

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphatsäure (FDPH^) im Industriemaßstab, welche als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphat (FDP) und der entsprechenden Isomeren verwendet wird.

Fructose-1,6-diphosphat (FDP) ist ein Mittel mit hoher glykometabolischer Aktivität, das in der Medizin in großem Umfang eingesetzt wird. Insbesondere werden zwei Isomere desselben verwendet, nämlich das Fructose-2,6-diphosphat F2, 6P2 und das Fructose-1,2-cycl.-phosphat-6-phosphat (FDPC).

Die Herstellung dieser beiden Isomeren im Industriemaßstab erfordert sehr reine und konzentrierte Lösungen von Fructose-1,6-diphosphatsäure (FDPH^), die das Basisreagens für derartige Herstellungen ist.

Das Problem, das die Erfindung löst, besteht daher darin, sehr reine Lösungen von FDPH/ zur Verfügung zu stellen, um Lösungen zu erhalten, die für die Herstellung von FDP-Salzen in Form lyophiler Pulver und von deren Isomeren geeignet sind.

Die vorliegend verwendeten Verfahren zur industriellen Herstellung von FDP und von dessen Salzen umfassen:

(a) die Ausfällung von FDP in Form eines unlöslichen Salzes aus der Flüssigkeit einer mit Hefen durchgeführten biologischen Fermentation nach Unterbrechung bzw. Abbruch mit Säure;

(b) die Chromatographie durch Ionenaustausch und anschließende Neutralisation mit Alkali, um den Niederschlag in das Salz zu überführen.

Die so erhaltenen Lösungen enthalten jedoch zahlreiche Verunreinigungen. Daher ist eine weitere Reinigungsstufe erforderlich, die entweder durch Salzausfällung (mit dem Nachteil einer Verwendung großer Lösungsmittelmengen und einer Abtrennung eines stark hydratisierten Salzes) oder durch Lyophilisierung erfolgt, was andererseits ein FDP-Salz ergibt, das in höherem Ausmaß Verunreinigungen enthält

Insbesondere erlauben es die gegenwärtig verwendeten Systeme für die industrielle Herstellung von FDP nicht, auf direktem Weg eine FDPH^-Lösung zu erhalten, die ausreichend rein und konzentriert ist, um als Ausgangsmaterial für die Herstellung von FDPC und F 2,6 P2 verwendet zu werden. Bis heute wurden diese Substanzen nur nach Laboratoriumsmethoden hergestellt, die zur Herstellung von FDPHa-Lösungen komplexe und aufwendige Methoden zur Lösung der FDP-Natriumsalzkristalle in bidestilliertem Wasser und die anschließende Behandlung der Lösung mit einem Kationenaustauscherharz, das anschließend durch Zentrifugieren entfernt wird, verwenden.

Es wurden verschiedene Versuche von der Anmelderin durchgeführt, die zu einem Verfahren führten, das die industrielle Herstellung von FDPH^ mit einem hohen Reinheitsgrad und hoher Konzentration ermöglicht. Dieses Verfahren erfordert weder die Ausfällung eines unlöslichen,

durch biologische Fermentation gebildeten FDP-Salzes noch die anschließende Reinigung von FDPH- oder dessen Salz mit Hilfe einer Ausfällung durch Kristallisation nach Zugabe organischer Lösungsmittel zu den Lösungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend eingehender anhand des Beispiels erläutert.

Zur Durchführung des Verfahrens verwendet man Glucose-Lösungen, denen anorganische Phosphate zugesetzt worden sind und die durch biologische Fermentation mit Hefen erhalten wurden.

Die Fermentationsflüssigkeit wird durch eine Pasteurisierung von 2 min bei 85⁰C deproteiniert und dann zur Entfernung der Hefezellen und sämtlicher nach der Denaturierung durch Hitze unlöslich gemachter Proteine filtriert. Alternativ kann anstelle der Pasteurisierung die Deproteinierung durch Behandlung mit HCl durchgeführt werden.

Die so hergestellte Lösung wird den folgenden Stufen unterworfen:

(a) einer Chromatographie mit einem starken kationischen Harz, um die durch Filtration aus der Fermentationsflüssigkeit erhaltene Lösung auf einen pH von geringer als 1 zu bringen;

(b) einer Chromatographie mit einem starken anionischen Harz der so erhaltenen, sauren Lösung, die FDPH^ und die anderen Phosphatanionen fixiert, woran sich ein Waschen der Säule mit Wasser anschließt, um die Substanzen, die durch das Harz nicht zurückgehalten wurden, zu entfernen;

(c) eine Elution in drei Phasen mit zwei Eluierungsmitteln mit zunehmender Ionenstärke zur Entfernung

3 A 4.6 9

des anorganischen Phosphats als Teil der phosphorylierten Kohlenhydrate (erste Phase, bei der das erste Eluierungsraittel verwendet wird) und der verbliebenen phosphorylierten Kohlenhydrate (zweite Phase, bei der 25% des zweiten Eluierungsmittels verwendet werden) und um FDPH₄ zu sammeln (dritte Phase, bei der der verbliebene Teil des zweiten Eluierungsmittels verwendet wird);

(d) eine partielle Neutralisation mit NaOH bis zu einem pH von 3 des Eluats, das das in der vorangegangenen Phase gesammelte FDPH^enthält;

(e) einer Molekularfiltration der bei (d) erhaltenen Lösung, um NaCl und einen Teil des V/assers zu entfernen;

(f) einer Chromatographie mit einem starken kationischen Harz, um die Lösung auf einen pH von geringer als 1 zu bringen.

Die so erhaltene Lösung, enthält konzentrierte FDPH₄ (bis zu 20%) hoher Reinheit.

Als Beispiel wurde die nachstehende Tabelle aufgestellt, in der die Eigenschaften eines ^salzes angegeben sind, das erhalten wurde durch Lyophilisierung einer in geeigneter Weise neutralisierten Lösung, die der Arbeitsweise nach bekannten Verfahren entstammt (Spalte I), verglichen mit den Eigenschaften eines Salzes, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde (Spalte ID. j n

FDPH₄ % 62,4 75,25

PO₄ % 5,15 0,18

F6P % 0,86 0,87

G6P % 0,91

H₂O % 7,77 7,88

Na⁺ % 14,53 15,31

3U6927

Das Verfahren sieht somit eine Kombination einer Molekularfiltration mit einer kationischen Chromatographie- und einer anionischen Chromatographie-Behandlung vor.

Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Man pasteurisiert 2 1 Fermentationsflüssigkeit 2 min bei 85⁰C und filtriert dann über einem Glasfilter nach Zugabe der erforderlichen Menge Filtererde, um das Filtern zu erleichtern, und läßt dann das unlösliche Harz abtropfen. Man erhält so etwa 1,5-1 klare, gefilterte Flüssigkeit, die man durch eine Säule, die ein starkes kationisches Harz enthält,und anschließend durch eine zweite Säule, die ein starkes anionisches Harz enthält, laufenläßt.

Arbeitsbedingungen

Harze:

kationisch: 200 ml Amberlite IRG 120, H⁺-Form, oder Duolite C264, H⁺-Form; Säule: Bett, Höhe 500 mm, Innendurchmesser 25 mm; Beschickungsgeschwindigkeit: 5 ml/min;

anionisch: 350 ml Duolite 374, Cl"-Form; Säule: Bett, Höhe 750 mm, Innendurchmesser 25 mm; Elutionsgeschwindigkeit:20 ml/min.

Nachdem sämtliche Flüssigkeit der kationischen Säule zugeführt worden war und in einem Sturz bzw. einer Kaskade über die anionische Säule geleitet worden war, wurden beide Säulen mit 400 ml destilliertem Wasser gewaschen. Hiernach wurde die Kaskadenverbindung der beiden Säulen herausgetrennt und die Elution lediglich der anionischen Säule durchgeführt.

Die FDPH^-Konzentration in der Beschickungslösung und in dem Abstrom der anionischen Säule wurde zuvor bestimmt. Bezeichnende Daten sind die folgenden:

FDPH₄ in der Beschickungslösung: 65 g FDPHr in dem Abstrom nach der anionischen Säule: 28 g (einschließlich des Waschwassers).

Die Elution wird in drei Phasen durchgeführt; in der ersten Phase werden etwa 2,5 1 einer Lösung durchgeleitet, die 1,4 g IW₄Cl + 2 ml 25%iges NH₄/1 enthält. In der zweiten und dritten Phase werden 2 1 Eluierungsmittel B (ClNa 0,2 - HCl 0,05 N) durchgeleitet, fünf Fraktionen gesammelt, zwei von 250 ml und die verbliebenen von 500 ml. Die erste und erforderlichenfalls auch die zweite Phase werden entfernt, da sie Monophosphat-Kohlenhydrate und anorganisches Phosphat (zweite Phase) enthalten, und die anderen werden unter Erzielung eines Volumens zwischen 15ΟΟ und 1750 mit einer FDPH--Konzentration von etwa 2,25 bis 2,5% (dritte Phase) vereint. Dieses Eluat wird nach der Neutralisation bis auf pH 4 3 einer umgekehrten Osmose unterzogen, während der die vorliegenden organischen Anionen und Mineralsalze, sofern vorhanden, beseitigt werden, um eine FDP-Lösung mit einem hohen Reinheitsgrad zu erhalten.

Verfahrensmerkmsale

Arbeitsdruck: 24 at

Molekularsieb-Filtermembranen: 500 in Celluloseacetat ρ

Filteroberfläche: mq 1,5 bzw. 1,5 m .

Durch Lyophilisieren der Lösung, die in geeigneter Weise mit NaOH neutralisiert worden war, erhielt man ein Salz, dessen analytischen Merkmale in der vorstehenden Tabelle (I) angegeben sind.

Es können jedoch Variationen des beschriebenen Verfahrens vorgenommen werden.

Beispielsweise kann man zur Neutralisation des Eluats Pyridin verwenden. Dieses ermöglicht es, die anschließende Phase f (Chromatographie mit stark kationischem Harz) auszuschalten und ein FDP-Pyridinsalz zu erhalten, das direkt bei der Herstellung der beiden vorstehend genannten Isomeren eingesetzt werden kann.

Eine zweite Variation sieht stattdessen eine Neutralisation in der Phase d mit KOH vor. Auf diese Weise wird es möglich, stets die Phase f zu eliminieren und ein Kaliumsalz zu erhalten, das, wenn es mit KOH weiter neutralisiert wird, bei der Herstellung von FDP-Kaliumsalz oder in Form eines lyophilen Pulvers eingesetzt werden kann.

Im Gegensatz hierzu kann durch Abbrechen des erfindungsgemäßen Verfahrens am Ende der Phase e die entstandene Lösung nach vorheriger Neutralisation rait NaOH verwendet werden, um das FDP-Natriumsalz in Form einer Lösung oder eines lyophilen Pulvers zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es somit, industriell 1,6-Fructose-diphosphatsäure bzw. saures 1,6-Fructose-diphosphat mit einer Ausbeute und einem solchen Reinheitsgrad zu erhalten, wie sie nach bekannten Methoden bisher nicht erhältlich waren.

Der Fachmann ist in der Lage, zahlreiche Änderungen und Abwandlungen vorzunehmen, die auch in den Bereich der Erfindung fallen.

Claims

Dr. F. Zurnöteih sen. - or. E." Assmann q / / η η >-\ η Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT REpRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE Case 15764 Patentansprüche

1..' Verfahren zur Herstellung von Fructose-1 ,6-di-

-—S

phosphatsäure bzw. saurem Fructose-1,6-diphosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Reinigung von Fructose-1,6-diphosphat-Lösungen eine Kombination einer zweifachen Chromatographie (kationisch und anionisch) mit einer Molekularfiltration vorsieht.

2. Verfahren zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphatsäure aus einer Glucose-Lösung, der anorganische Phosphate zugesetzt worden sind, wobei die Lösung durch biologische Fermentation mit Hefen erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

(a) die Chromatographie der Lösung mit einem starken kationischen Harz;

(b) die anschließende Chromatographie mit einem starken anionischen Harz und das Vfaschen der Säule mit Wasser;

(c) die Elution;

(d) die partielle Neutralisation des Eluats bis zu einem pH von 3;

(e) die Molekularfiltration;

(f) die Chromatographie der entstandenen Lösung mit einem starken kationischen Harz bis zu einem pH von geringer als 1.

3· Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution der Phase- c in drei Phasen mit zwei Eluierungsmitteln mit zunehmender Ionenstärke durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Neutralisation der Phase d unter Verwendung von Pyridin durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Neutralisation der Phase d unter Verwendung von KOH durchgeführt wird.