FR2557113A1 - Procede pour la preparation d'acide fructose-1,6-diphosphate - Google Patents
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Abstract
PROCEDE POUR LA PREPARATION D'ACIDE FRUCTOSE-1,6-DIPHOSPHATE; POUR PURIFIER DES SOLUTIONS CONTENANT DE L'ACIDE FRUCTOSE-1,6-DIPHOSPHATE, ON COMBINE UNE DOUBLE CHROMATOGRAPHIE A UNE FILTRATION MOLECULAIRE POUR OBTENIR DES SOLUTIONS CONCENTREES ET TRES PURES CONTENANT DE L'ACIDE FRUCTOSE-1,6-DIPHOSPHATE CONVENANT TRES BIEN A LA PREPARATION INDUSTRIELLE DU FRUCTOSE-1,6-DIPHOSPHATE ET DE SES SELS.
Description
-1 - La présente invention concerne un procédé pour
la préparation d'acide fructose-1,6-diphosphate.
Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la préparation à l'échelle industrielle de l'acide fructose-1,6-diphosphate (FDPH4) qui est le com-
posé de base utilisé pour la production du fructose-1,6-
diphosphate (FDP) et des isomères correspondants.
Le fructose-1,6-diphosphate (FDP) est un agent
actif dans le métabolisme des glucides qui est très uti-
lisé en médecine.
En particulier, deux de ses isomères sont uti-
lisés, le fructose-2,6-diphosphate (F2,6P2) et le fruc-
tose-6-phosphate I,2-cyclique (FDPC).
La préparation à l'échelle industrielle de ces
deux isomères nécessite des solutions très pures et con-
centrées d'acide fructose-1,6-diphosphate (FDPH4) qui
est le composé de base de ces préparations.
Le problème que l'invention tente de résoudre
est l'obtention de solutions très pures de FDPH4 conve-
nant à la préparation des sels du FDP sous forme d'une
poudre lyophilisée et de leurs isomères.
Les procédés actuellement utilisés pour la
production industrielle du FDP et de ses sels compren-
nent: a) la précipitation du FDP sous forme d'un sel
insoluble dans un liquide obtenu par fermentation bio-
logique avec des levures, puis arrêt de la fermentation avec un acide; b) la chromatographie avec échange d'ions suivie d'une neutralisation avec un alcali pour transformer le
précipité en un sel.
Les solutions ainsi obtenues contiennent ce-
pendant de nombreuses impuretés; il est donc nécessaire
d'effectuer un autre stade de purification soit par pré-
cipitation sous forme d'un sel (avec l'inconvénient -2- d'utiliser des quantités importantes de solvant et de
séparer un sel fortement hydraté), soit par lyophilisa-
tion, ce qui fournit d'autre part un sel de FDP conte-
nant un taux accru d'impuretés. Plus particulièrement, les systèmes actuellement utilisés pour la production
industrielle du FDP ne permettent pas d'obtenir directe-
ment une solution suffisamment pure et concentrée de FDPH4 utile comme composé de base pour la production du
FDPC et du F2,6P2. A ce jour, ces substances sont pré-
parées uniquement selon des procédés de laboratoire utilisant, pour la préparation de la solution de FDPH4,
des procédés complexes et coûteux comprenant la dissolu-
tion de cristaux du sel de sodium du FDP dans de l'eau bidistillée, puis le traitement de la solution avec une résine échangeuse de cations que l'on sépare ensuite par centrifugation.
Plusieurs expériences effectuées par la deman-
deresse ont conduit à un procédé permettant la produc-
tion industrielle de FDPH4 avec un degré élevé de pure-
té elde concentration.
Ce procédé ne nécessite ni précipitation sous forme d'un sel insoluble du FDP produit par fermentation biologique ni la purification ultérieure du FDPH4 ou de
son sel par précipitation par cristallisation après ad-
dition de solvants organiques aux solutions.
Le procédé selon l'invention va maintenant
être décrit de façon détaillée par un exemple non limi-
tatif.
Pour mettre en pratique le procédé de l'in-
vention, on utilise des solutions de glucose auxquelles on a ajouté des phosphates minéraux que l'on soumet à
une fermentation biologique avec des levures.
On élimine les protéines de la liqueur de fer-
mentation par pasteurisation pendant 2 minutes à 85 C puis filtration pour éliminer les cellules des levures -3- et toutes les protéines insolubilisées par dénaturation par chauffage. Sinon, au lieu d'une pasteurisation, on peut éliminer les protéines par traitement par l'acide chlorhydrique. On soumet la solution ainsi obtenue aux sta- des de traitement suivants: a) une chromatographie avec une résine fortement
cationique pour porter la solution obtenue par filtra-
tion de la liqueur de fermentation à un pH inférieur à 1;
b) une chromatographie de la solution ainsi ob-
tenue avec une résine fortement anionique qui fixe le FDPH4 et les autres anions phosphates suivie d'un lavage de la colonne avec de l'eau pour éliminer les substances qui n'ont pas été retenues par la résine; c) une élution en trois stades avec deux éluants ayant une force ionique croissante pour éliminer les
phosphates minéraux, une partie des glucides phospho-
rylés (dans le premier stade o on utilise le premier éluant) et les glucides phosphorylés restants (second stade dans lequel on utilise 25 % du second éluant), et recueillir le FDPH4 (troisième stade dans lequel on utilise le reste du second éluant);
d) une neutralisation partielle avec NaOH jus-
qu'à ce que l'éluat contenant le FDPH4 recueilli dans le stade précédent ait un pH de 3; e) une filtration moléculaire de la solution obtenue en d) pour éliminer NaCl et une partie de l'eau; et f) une chromatographie avec une résine fortement cationique pour porter la solution à un pH inférieur à 1. La solution ainsi obtenue contient du FDPH4
concentré (jusqu'à 20 %) très pur.
Egalement à titre d'exemple, le tableau ci-
-4.- après indique les caractéristiques d'un sel obtenu par
lyophilisation de la solution convenablement neutrali-
sée qui a été obtenue selon les procédés connus (colon-
ne I) par rapport aux caractéristiques d'un sel obtenu selon le procédé de l'invention (colonne II).
I II
FDPH4% 62,4 75,25
P04-% 5,15 0,18
F6P-% 0,86 0,87
G6P=-% 0,91 --
H20 % 7,77 7,88
Na % 14,53 15,31 Dans le procédé de l'invention, on combine donc une filtration moléculaire à une chromatographie
cationique et & une chromatographie anionique.
L'invention est illustrée par l'exemple non
limitatif suivant.
Exemple
On pasteurise 2 i de liqueur de fermentation pendant 2 minutes à 850C puis on filtre sur une plaque de verre après addition de la quantité nécessaire de terre filtrante pour faciliter la filtration, puis on essore le résidu insoluble. On obtient ainsi environ 1,5 1 de filtrat limpide que l'on fait passer à travers une colonne contenant une résine fortement cationique puis & travers une seconde colonne contenant une résine
fortement anionique.
Caractéristiques opératoires Résines: - cationique: 200 ml d'Amberlite IRG 120 forme H+ ou de Duolite C 264 forme H; colonne: hauteur du lit 500 mm; diamètre intérieur 25 mm;
5 7 ? 1 3
-5- débit d'alimentation: 5 ml/min; - anionique: 350 ml de Duolite 374 forme C1 colonne: hauteur du lit 750 mm, diamètre intérieur 25 mm; débit d'élution: 20 ml/min.
Dès que la liqueur a traversé la colonne ca-
tionique puis la colonne anionique, on lave les deux colonnes avec 400 ml d'eau distillée; on sépare ensuite les deux colonnes et on élue uniquement la colonne
anionique.
La concentration en FDPH4 de la solution d'a-
limentation et dans l'effluent de la colonne anionique
a été préalablement déterminée.
Des valeurs indicatives sont les suivantes: FDPH4 dans la solution d'alimentation: 65 g
FDPH4 dans l'effluent de la colonne anionique (y com-
pris l'eau de lavage): 28 g On effectue l'élution en trois stades: dans le premier, on fait passer environ 2,5 1 d'une solution contenant 1,4 g de NH4C1 + 2 ml de NH4 à 25 %/î; dans le second et le troisième stade, on fait passer 2 1 d'éluant B (ClNa 0,2 N-HCl 0,05 N) en recueillant fractions, 2 de 250 ml et les autres de 500 ml. On élimine la première et au besoin la seconde phase car elles contiennent des glucides monophosphatés et des phosphates minéraux (deuxième stade) et on réunit les autres pour obtenir un volume de 1 500 à I 750 ml avec
une concentration en FDPH4 d'environ 2,25-2,5 % (troi-
sième stade). On soumet cet éluat après neutralisation à un pH de 4,3 à une osmose inverse pendant laquelle les ions organiques et les sels minéraux éventuellement présents sont éliminés afin de fournir une solution de
FDP très pure.
Caractéristiques opératoires - Pression opératoire: 24 bars -6- - Membrane filtrante de type tamis moléculaire: 500 dans l'acétate de cellulose
- Surface filtrante: 1,5 m2.
Par lyophilisation de la solution que l'on a convenablement neutralisée avec NaOH, on obtient un sel ayant les caractéristiques analytiques indiquées dans
le tableau précédent.
Cependant, certaines variantes peuvent être
apportées au procédé décrit.
Par exemple, on peut utiliser la pyridine pour neutraliser l'éluat. Ceci permet d'éliminer le stade f) (chromatographie avec une résine fortement cationique)
et d'obtenir un sel de pyridine du FDP que l'on peut em-
ployer directement pour produire les deux isomères pr6-
cités.
Une seconde variante consiste à effectuer la
neutralisation du stade d) avec KOH. On peut ainsi éli-
miner également le stade f) et obtenir un sel de potas-
sium qui, après une nouvelle neutralisation avec KOH,
peut être employé pour la préparation du sel de potas-
sium du FDP ou sous forme d'une poudre lyophilisée.
D'autre part, lorsqu'on arrête le procédé de l'invention à la fin du stade e), la solution obtenue peut être utilisée après neutralisation par NaOH pour
obtenir le sel de sodium du FDP sous forme d'une solu-
tion ou d'une poudre lyophilisée.
Le procédé selon l'invention permet donc l'ob-
tention industrielle de l'acide fructose-1,6-diphosphate avec un rendement et un degré de pureté que les procédés
connus n'ont jamais permis d'atteindre.
Bien entendu, l'homme de l'art pourra effec-
tuer de nombreuses modifications et variantes sans sor-
tir du cadre de l'invention.
-7-
Claims (4)
1 - Procédé pour la production d'acide fruc-
tose-1,6-diphosphate, caractérisé en ce que, pour pu-
rifier des solutions d'acide fructose-I1,6-diphosphate, on emploie une combinaison de deux chromatographies
(cationique et anionique) avec une filtration molécu-
laire.
2 - Procédé pour la préparation d'acide fruc-
tose-1,6-diphosphate à partir d'une solution de glucose
à laquelle on a ajouté des phosphates minéraux pour ob-
tenir une liqueur de fermentation biologique par des levures, caractérisé en ce qu'il comprend les stades suivants:
a) une chromatographie de la liqueur avec une ré-
sine fortement cationique;
b) une chromatographie ultérieure avec une ré-
sine fortement anionique et un lavage de la colonne à l'eau; c) une élution;
d) une neutralisation partielle de l'éluat jus-
qu'à pH 3; e) une filtration moléculaire; et f) une chromatographie avec une résine fortement cationique de la solution obtenue pour porter le pH à
une valeur inférieure à 1.
3 - Procédé selon la revendication 2, carac-
térisé en ce que l'élution du stade c) est effectuée en
trois stades avec deux éluants de force ionique crois-
sante.
4 - Procédé selon la revendication 2, carac-
térisé en ce que la neutralisation du stade d) est ef-
fectuée avec de la pyridine.
- Procédé selon la revendication 2, carac-
térisé en ce que la neutralisation du stade d) est ef-
fectuée avec KOH.
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