DE3446927C2 - Verfahren zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphatsäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphatsäureInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Fructose-1,6-diphosphatsäuren (FDPH₄), wie in den Patentansprüchen
definiert. Das nach diesem Verfahren im Industriemaßstab
erhaltene Produkt dient als Ausgangsmaterial zur
Herstellung von Fructose-1,6-diphosphat (FDP) und der entsprechenden
Isomeren.
Fructose-1,6-diphosphat (FDP) ist ein Mittel mit hoher
glykometabolischer Aktivität, das in der Medizin in großem
Umfang eingesetzt wird. Insbesondere werden zwei Isomere
desselben verwendet, nämlich das Fructose-2,6-diphosphat
F2, 6P2 und das Fructose-1,2-cycl.-phosphat-6-
phosphat (FDPC).
Die Herstellung dieser beiden Isomeren im Industriemeßstab
erfordert sehr reine und konzentrierte Lösungen von
Fructose-1,6-diphosphatsäure (FDPH₄), die das Basisreagens
für derartige Herstellungen ist.
Zwar war aus der DE-A-27 26 535 ein Verfahren zur Abtrennung
von Zuckern wie Glucose oder Fructose, die gegebenenfalls mit
Oxyanionen der Gruppen IV, V oder VI des Periodensystems komplexiert
sind, mit Hilfe kationischer oder anionischer Harze
bekannt. Die Verwendung kationischer Harze wird dort im Zusammenhang
mit der Abtrennung eines Zucker-Germaniumkomplexes
beschrieben. Konkrete Hinweise auf das erfindungsgemäße Verfahren
bzw. die Lösung des dem erfindungsgemäßen Verfahren
zugrundeliegenden Problems sind diesem Stand der Technik nicht
zu entnehmen.
Gleiches gilt auch für Acta Chemica Scandinavia B 28 (1974),
Seiten 555-558, wonach im Rahmen einer Beschreibung von Herstellung
und Reinigung von Fructose-1,6-diphosphat auf eine
Molekularfiltration und etwaige Verwendung ionischer Harze
Bezug genommen wird.
Das Problem, das die Erfindung löst, besteht
daher darin, sehr reine Lösungen von FDPH₄ zur Verfügung
zu stellen, um Lösungen zu erhalten, die für die Herstellung
von FDP-Salzen in Form lyophiler Pulver und von deren
Isomeren geeignet sind.
Die vorliegend verwendeten Verfahren zur industriellen
Herstellung von FDP und von dessen Salzen umfassen:
- (a) die Ausfällung von FDP in Form eines unlöslichen Salzes aus der Flüssigkeit einer mit Hefen durchgeführten biologischen Fermentation nach Unterbrechung bzw. Abbruch mit Säure;
- (b) die Chromatographie durch Ionenaustausch und anschließende Neutralisation mit Alkali, um den Niederschlag in das Salz zu überführen.
Die so erhaltenen Lösungen enthalten jedoch zahlreiche
Verunreinigungen. Daher ist eine weitere Reinigungsstufe
erforderlich, die entweder durch Salzausfällung (mit
dem Nachteil einer Verwendung großer Lösungsmittelmengen
und einer Abtrennung eines stark hydratisierten Salzes)
oder durch Lyophilisierung erfolgt, was andererseits
ein FDP-Salz ergibt, das in höherem Ausmaß Verunreinigungen
enthält.
Insbesondere erlauben es die gegenwärtig verwendeten
Systeme für die industrielle Herstellung von FDP nicht,
auf direktem Weg eine FDPH₄-Lösung zu erhalten, die ausreichend
rein und konzentriert ist, um als Ausgangsmaterial
für die Herstellung von FDPC und F 2,6 P2 verwendet
zu werden. Bis heute wurden diese Substanzen nur nach
Laboratoriumsmethoden hergestellt, die zur Herstellung
von FDPH₄-Lösungen komplexe und aufwendige Methoden zur
Lösung der FDP-Natriumsalzkristalle in bidestilliertem
Wasser und die anschließende Behandlung der Lösung mit
einem Kationenaustauscherharz, das anschließend durch
Zentrifugieren entfernt wird, verwenden.
Es wurden verschiedene Versuche von der Anmelderin durchgeführt,
die zu einem Verfahren führten, das die industrielle
Herstellung von FDPH₄ mit einem hohen Reinheitsgrad
und hoher Konzentration ermöglicht. Dieses Verfahren
erfordert weder die Ausfällung eines unlöslichen,
durch biologische Fermentation gebildeten FDP-Salzes
noch die anschließende Reinigung von FDPH₄ oder dessen
Salz mit Hilfe einer Ausfällung durch Kristallisation
nach Zugabe organischer Lösungsmittel zu den Lösungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend eingehender
anhand des Beispiels erläutert.
Zur Durchführung des Verfahrens verwendet man Glucose-
Lösungen, denen anorganische Phosphate zugesetzt worden
sind und die durch biologische Fermentation mit Hefen
erhalten wurden.
Die Fermentationsflüssigkeit wird durch eine Pasteurisierung
von 2 min bei 85°C deproteiniert und dann zur
Entfernung der Hefezellen und sämtlicher nach der Denaturierung
durch Hitze unlöslich gemachter Proteine
filtriert. Alternativ kann anstelle der Pasteurisierung
die Deproteinierung durch Behandlung mit HCl durchgeführt
werden.
Die so hergestellte Lösung wird den folgenden Stufen unterworfen:
- (a) einer Chromatographie mit einem starken kationischen Harz, um die durch Filtration aus der Fermentationsflüssigkeit erhaltene Lösung auf einen pH von geringer als 1 zu bringen;
- (b) einer Chromatographie mit einem starken anionischen Harz der so erhaltenen, sauren Lösung, die FDPH₄ und die anderen Phosphatanionen fixiert, woran sich ein Waschen der Säule mit Wasser anschließt, um die Substanzen, die durch das Harz nicht zurückgehalten wurden, zu entfernen;
- (c) eine Elution in drei Phasen mit zwei Eluierungsmitteln mit zunehmender Ionenstärke zur Entfernung des anorganischen Phosphats als Teil der phosphorylierten Kohlenhydrate (erste Phase, bei der das erste Eluierungsmittel verwendet wird) und der verbliebenen phosphorylierten Kohlenhydrate (zweite Phase, bei der 25% des zweiten Eluierungsmittels verwendet werden) und um FDPH₄ zu sammeln (dritte Phase, bei der der verbliebene Teil des zweiten Eluierungsmittels verwendet wird);
- (d) eine partielle Neutralisation mit NaOH bis zu einem pH von 3 des Eluats, das das in der vorangegangenen Phase gesammelte FDPH₄ enthält;
- (e) einer Molekularfiltration der bei (d) erhaltenen Lösung, um NaCl und einen Teil des Wassers zu entfernen;
- (f) einer Chromatographie mit einem starken kationischen Harz, um die Lösung auf einen pH von geringer als 1 zu bringen.
Die so erhaltene Lösung enthält konzentrierte FDPH₄
(bis zu 20%) hoher Reinheit.
Als Beispiel wurde die nachstehende Tabelle aufgestellt,
in der die Eigenschaften eines Salzes angegeben sind,
das erhalten wurde durch Lyophilisieerung einer in geeigneter
Weise neutralisierten Lösung, die der Arbeitsweise
nach bekannten Verfahren entstammt (Spalte I),
verglichen mit den Eigenschaften eines Salzes, das nach
der erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde (Spalte
II).
Das Verfahren sieht somit eine Kombination einer Molekularfiltration
mit einer kationischen Chromatographie-
und einer anionischen Chromatographie-Behandlung vor.
Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.
Man pasteurisiert 2 l Fermentationsflüssigkeit 2 min bei
85°C und filtriert dann über einem Glasfilter nach Zugabe
der erforderlichen Menge Filtererde, um das Filtern
zu erleichtern, und läßt dann das unlösliche Harz abtropfen.
Man erhält so etwa 1,5 l klare, gefilterte
Flüssigkeit, die man durch eine Säule, die ein starkes
kationisches Harz enthält, und anschließend durch eine
zweite Säule, die ein starkes anionisches Harz enthält,
laufenläßt.
Harze:
kationisch:
200 ml Amberlite® IRG 120, H⁺-Form, oder Doulite® C264, H⁺-Form; Säule: Bett, Höhe 500 mm, Innendurchmesser 25 mm; Beschickungsgeschwindigkeit: 5 ml/min;
200 ml Amberlite® IRG 120, H⁺-Form, oder Doulite® C264, H⁺-Form; Säule: Bett, Höhe 500 mm, Innendurchmesser 25 mm; Beschickungsgeschwindigkeit: 5 ml/min;
anionisch:
350 ml Duolite® 374, Cl--Form; Säule: Bett, Höhe 750 mm, Innendurchmesser 25 mm; Elutionsgeschwindigkeit: 20 ml/min.
350 ml Duolite® 374, Cl--Form; Säule: Bett, Höhe 750 mm, Innendurchmesser 25 mm; Elutionsgeschwindigkeit: 20 ml/min.
Nachdem sämtliche Flüssigkeit der kationischen Säule zugeführt
worden war und in einem Sturz bzw. einer Kaskade
über die anionische Säule geleitet worden war, wurden
beide Säulen mit 400 ml destilliertem Waser gewaschen.
Hiernach wurde die Kaskadenverbindung der beiden Säulen
herausgetrennt und die Elution lediglich der anionischen
Säule durchgeführt.
Die FDPH₄-Konzentration in der Beschickungslösung und in
dem Abstrom der anionischen Säule wurde zuvor bestimmt.
Bezeichnende Daten sind die folgenden:
FDPH₄ in der Beschickungslösung: 65 g
FDPH₄ in dem Abstrom nach der anionischen Säule: 28 g (einschließlich des Waschwassers).
FDPH₄ in dem Abstrom nach der anionischen Säule: 28 g (einschließlich des Waschwassers).
Die Elution wird in drei Phasen durchgeführt; in der ersten
Phase werden etwa 2,5 l einer Lösung durchgeleitet,
die 1,4 g NH₄Cl + 2 ml 25%iges NH₄/l enthält. In der
zweiten und dritten Phase werden 2 l Eluierungsmittel B
(NaCl 0,2 - HCl 0,05 N) durchgeleitet, fünf Fraktionen
gesammelt, zwei von 250 ml und die verbliebenen von
500 ml. Die erste und erforderlichenfalls auch die zweite
Phase werden entfernt, da sie Monophosphat-Kohlenhydrate
und anorganisches Phosphat (zweite Phase) enthalten, und
die anderen werden unter Erzielung eines Volumens zwischen
1500 und 1750 mit einer FDPH₄-Konzentration von
etwa 2,25 bis 2,5% (dritte Phase) vereinigt. Dieses Eluat
wird nach der Neutralisation bis auf pH 3 einer umgekehrten
Osmose unterzogen, während der die vorliegenden organischen
Anionen und Mineralsalze, sofern vorhanden, beseitigt
werden, um eine FDP-Lösung mit einem hohen Reinheitsgrad
zu erhalten.
Arbeitsdruck: 24 bar
Molekularsieb-Filtermembranen: 500 in Celluloseacetat
Filteroberfläche: 1,5 m².
Molekularsieb-Filtermembranen: 500 in Celluloseacetat
Filteroberfläche: 1,5 m².
Durch Lyophilisieren der Lösung, die in geeigneter Weise
mit NaOH neutralisiert worden war, erhielt man ein Salz,
dessen analytischen Merkmale in der vorstehenden Tabelle
(I) angegeben sind.
Es können jedoch Variationen des beschriebenen Verfahrens
vorgenommen werden.
Beispielsweise kann man zur Neutralisation des Eluats
Pyridin verwenden. Dieses ermöglicht es, die anschließende
Phase f (Chromatographie mit stark kationischem Harz)
auszuschalten und ein FDP-Pyridinsalz zu erhalten, das
direkt bei der Herstellung der beiden vorstehend genannten
Isomeren eingesetzt werden kann.
Eine zweite Variation sieht stattdessen eine Neutralisation
in der Phase d mit KOH vor. Auf diese Weise wird
es möglich, stets die Phase f zu eliminieren und ein Kaliumsalz
zu erhalten, das, wenn es mit KOH weiter neutralisiert
wird, bei der Herstellung von FDP-Kaliumsalz oder
in Form eines lyophilen Pulvers eingesetzt werden kann.
Im Gegensatz hierzu kann durch Abbrechen des erfindungsgemäßen
Verfahrens am Ende der Phase e die entstandene
Lösung nach vorheriger Neutralisation mit NaOH verwendet
werden, um das FDP-Natrimsalz in Form einer Lösung oder
eines lyophilen Pulvers zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es somit, industriell
1,6-Fructose-diphosphatsäure bzw. saures 1,6-
Fructose-diphosphat mit einer Ausbeute und einem solchen
Reinheitsgrad zu erhalten, wie sie nach bekannten Methoden
bisher nicht erhältlich waren.
Der Fachmann ist in der Lage, zahlreiche Änderungen und
Abwandlungen vorzunehmen, die auch in den Bereich der
Erfindung fallen.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Fructose-1,6-diphosphatsäure
bzw. saurem Fructose-1,6-diphosphat
aus eienr Glucose-Lösung, der anorganische
Phosphate zugesetzt worden sind, wobei die Lösung
durch biologische Fermentation mit Hefen erhalten worden
ist, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen
umfaßt:
- (a) die Chromatographie der Lösung mit einem starken kationischen Harz;
- (b) die anschließende Chromatographie mit einem starken anionischen Harz und das Waschen der Säule mit Wasser;
- (c) die Elution, die in drei Phasen mit zwei Eluierungsmitteln mit zunehmender Ionenstärke durchgeführt wird;
- (d) die partielle Neutralisation des Eluats bis zu einem pH von 3;
- (e) die Molekularfiltration;
- (f) die Chromatographie der entstandenen Lösung mit einem starken kationischen Harz bis zu einem pH von geringer als 1.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Neutralisation der Phase d unter Verwendung
von Pyridin durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Neutralisation der Phase d unter Verwendung
von KOH durchgeführt wird.
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