DE1226588C2 - Verfahren zur anreicherung von 5'-inosinsaeure und 5'-guanylsaeure - Google Patents
Verfahren zur anreicherung von 5'-inosinsaeure und 5'-guanylsaeureInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Anreicherung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure
aus einem durch enzymatische Hydrolyse von Nucleinsäuren erhaltenen 5'-Pyrimidinnucleotide und
diese 5'-Purinnucleotide enthaltenden Gemisch von 5'-Mononucleotiden.
Unter der Bezeichnung »5'-Purinnucleotid« ist ein Nucleosid-S'-monophosphat mit einem Purinkern im
Molekül zu verstehen, im vorliegenden Fall 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure, während unter »5'-Pyrimidinnucleotid«
ein Nucleosid-5'-monophosphat mit einem Pyrimidinkern in seinem Molekül zu verstehen
ist, wie 5'-Cytidylsäure, 5'-Uridylsäure.
5'-Mononucleotide werden großtechnisch hergestellt, weil sie auf Grund ihrer guten Geschmacksund
Aromawirkung so .vie ihrer Ungiftigkeit ausgezeichnete
chemische Würzstoffe darstellen. Als Ergebnis von Geschmacksanalysen hat sich gezeigt, daß
diese Wirkung der 5'-MononucIeotide auf die 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure zurückzuführen ist, die
zu den 5'-Purinnucleotiden gehören, während die 5'-Cytidylsäure, 5'-Uridylsäure usw., die zu den
5'-Pyrimidinnucleotiden gehören, als solche keine Geschmackswirkung aufweisen.
Als brauchbare Methode zur Abtrennung der einzelnen 5'-Mononucleotide aus 5'-Mononucleotidgemischen
wurde die Kolonnenchromatographie mit Ionenaustauschharzen, z.B. mit einem stark basischen
Harz oder einem stark sauren Harz angewendet. Hierbei wurde beispielsweise wie folgt gearbeitet: Die
5'-Nucleotide werden einmal am Harz adsorbiert und mit einem Lösungsmittel eluiert. Zur Gewinnung der
Fraktion, die die einzelnen 5'-Nucleotide enthält, werden Art und Gehalt der 5'-Nuclcotide in jedem
Eluat ermittelt.
Es ist zwar möglich, ein Gemisch von 5'-Mononucleotiden nach diesem Verfahren in die einzelnen
5'-Mononucleotide zu fraktionieren, jedoch ist es sehr schwierig, dieses Verfahren in den großtechnischen
Maßstab zu übertragen, weil es große Mengen an Harz und Lösungsmittel für die Elution und
einen großen Zeitaufwand erfordert, um die am Harz adsorbierten 5'-Mononucleotide vollständig zu
eluieren. Bei diesem Verfahren ist wenigstens die 10- bis 10Ofache Harztnenge, bezogen auf iie zu
behandelnden S'-Mononucleotide, erforderlich; selbst
wenn also nur 100 kg 5'-Mononucleotide der Behandlung nach diesem Verfahren unterworfen werden,
wird eine Reihe von Türmen oder ein Riesenturm mit einer Füllung von wenigstens 1 bis 10 t
Harz gebraucht. Außerdem wird für die Adsorption und Elution der 5'-Mononucleotide beim Betrieb in
diesem Maßstab etwa 1 Woche benötigt. Aus diesen Gründen war es bisher schwierig, 5'-Mononucleotide
wirtschaftlich herzustellen.
Das Problem der Trennung von verschiedenen Nucleotidsalzen ist dabei auch schon in einem anderen
Zusammenhang bearbeitet worden. In der USA.-Patentschrift 25 49 827 wird ein Verfahren zur
Trennung von Alkalinucleotidsalzen, die ihrerseits schwer trennbar sind, beschrieben, das darin besteht,
daß man sie in entsprechende Schwermetallsalze, insbesondere Kupfersalze, umwandelt, die dann veränderte
und unterschiedliche Löslichkeitsverhältnisse zeigen.
Abgesehen von der Kostspieligkeit eines solchen Verfahrens ist für den erfindungsgemäßen Zweck ein
solcher Vorschlag unbrauchbar. Erfindungsgemäß sollen ja Würz- und Aromastoffe hergestellt werden,
d. h. Produkte, die für den menschlichen Verzehr gedacht sind. Die physiologischen Nebenwirkungen
von Schwermetall verbieten eine Anwendung dieses Verfahrens aus dem Stand der Technik auf die erfindungsgemäße
Problemstellung.
Es wurde gefunden, daß es zur Herstellung von Würzstoffen nicht erforderlich ist, Gemische von
5'-Mononucleotiden vollständig durch Fraktionierung in die einzelnen 5'-Mononucleotide zu zerlegen,
wie es bisher geschehen ist. Es ist vielmehr nur erforderlich, die 5'-Purinnucleotide mit guter Geschmackswirkung aus den S'-Mononucleotidgemischen abzutrennen.
Außerdem müssen die 5-Purinnucleotide nicht unbedingt bis zur vollständigen Entfernung der
Pyrimidinnucleotide gereinigt werden.
Es wurde ferner die überraschende Tatsache festgestellt, daß ein deutlicher Unterschied zwischen der
Löslichkeit von Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden und der Löslichkeit von Dinatriumsalzen von
S'-Pyrimidinnucleotiden in einem Gemisch aus Wasser und Methanol, Äthanol oder Aceton besteht. Es
ist interessant, daß die Dinatriumsalze sowohl von 5'-Purinnucleotiden als auch von 5'-Pyrimidinnucleotiden
in Wasser sehr leicht löslich und in der genannten organischen Lösungsmitteln unlöslich sind,
jedoch in einem Gemisch, das aus Wasser und einem der genannten organischen Lösungsmittel in einem
gewissen Verhältnis besteht, ein völlig verschiedenes Verhalten zeigen. Das Verfahren gemäß der Erfindung
wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnis entwickelt.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Anreicherung von 5'-Inosinsäurc
und "i'-Guanylsäure aus einem durch Hydrolyse vor
Nucleinsäuren mit adenylsäuredeaminasehaltigen Enzymsystemen erhaltenen Purin- und Pyrimidinnucleosid-5'-monophosphate
enthaltenden Gemisch von Nucleosid-S'-monophosphaten, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
a) entweder 1 Gewichtsteil der Dinatriumsalze des Nucleosid-S'-monophosphatgemisches in einem
!Lösungsmittelgemisch, das die 4- bis lOfache Volumenmenge Wasser — bezogen auf Nucleo-5id-5'-monophosphatsalze
— im Gemisch mit Methanol, Äthanol oder Aceton im Volumenverhältnis von etwa 2:1 bis 1: 2 enthält, unter
Erwärmen auflöst und die Mischung abkühlen läßt oder
b) eine Lösung von 1 Gewichtsteil der Dinatriumsalze des Nucleosid-5'-monophosphatgemisches
in 4 bis 10 Volumteilen Wasser mit Methanol, Äthanol oder Aceton versetzt, bis das Volumenverhältnis
von Wasser zu den genannten organischen Lösungsmitteln etwa 2:1 bis 1:2 beträgt,
und anschließend das abgeschiedene, zum überwiegenden Teil aus den Dinatriumsalzen
der 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure bestehende NucIeosid-5'-monophosphatgemisch
isoliert.
Die gewünschten 5'-Purinmononucleotide können damit im großtechnischen Maßstab erhalten werden,
wobei die beim bekannten, mit Ionenaustauschharzen arbeitenden Verfahren notwendige Harzmenge verringert
und die dabei erforderliche lange Zeit verkürzt wird, und zwar auch dann, wenn das 5'-Mononucleotidgemisch
in die Einzelkomponenten zerlegt werden soll.
Die bei dem Verfahren der Erfindung einzusetzenden Gemische von 5'-Mononucleotiden können in
nicht beanspruchter Weise hergestellt werden durch Hydrolyse von Nucleinsäuren oder ihren Teilhydrolysaten
mit einem Adenylsäuredeaminase enthaltenden Enzymsystem, das bei einer sehr großen Zahl
von Mikroorganismen zu finden ist, z. B. Strcptomyces aureus, Aspergillus elegans, Aspergillus
flavipes und Glomerella cingulata.
Das Enzymsystem kann in Form des lebenden Mikroorganismus oder als extrahierte Enzymlösung
oder Zeil- oder Mycelsuspension od. dgl. verwendet werden. Der Mikroorganismus kann auf einem
Medium, das Hefeextrakt sowie andere Nährstoffe enthält, bebrütet werden, oder das Kulfurfiltrat des
Mikroorganismus wird mit dem Hefeextrakt zusammengeführt, oder eine Zeil- oder Mycelsuspension
des Mikroorganismus wird mit den Nucleinsäuren
5 oder ihren Teilhydrolysaten zusammengeführt. Ip allen Fällen erfolgt die Bebrütung des Mikroorganismus
2 bis S Tage bei etwa 20 bis 40° C. Zuweilen ist das Enzymsystem mit Phosphormonoesterase verunreinigt,
die die 5'-Mononucleotide zu den entsprechenden Nucleosiden zu hydrolysieren vermag, die
als Würzstoffe wertlos sind. In solchen Fällen kann ein Inhibitor für Phosphormonoesterase, z. B. ein
Phosphat, Fhiorid, Arsenat usw., dem Reaktionssystem zugesetzt werden, oder das Enzymsystem kann
einer Wärmebehandlung unterworfen werden, durch die die Phosphormonoesterase deaktiviert wird.
Das auf diese Weise erhaltene 5'-Mononucleotidgemisch enthält 5'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure,
5'-Uridylsäure und 5'-Cytidylsäure in ungefähr gleichen Mengen Natürliche Nucleinsäuren enthalten
keine 5'-Inosinsäure, jedoch 5'-Adenylsäure als Komponente. Gleichzeitig mit der Hydrolyse der
Nucleinsäure zu 5'-Mononucleotiden wird jedoch die 5'-Adenylsäure in den natürlichen Nucleinsäuren
»5 durch Deaminierung, die durch die Wirkung von sogenannter
Adenylsäuredeaminase im gebrachten Enzymsystem verursacht wird, in 5'-Inosinsäure umgewandelt.
Im Gemisch der 5'-Mononucleotide sind somit
Im Gemisch der 5'-Mononucleotide sind somit
3« 5'-Purinnucleotide enthalten, die aus 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure sowie 5'-Pyrimidinnucleotiden,
wie 5'-Cytidylsäure, 5'-Uridylsäure, bestehen. Das durch Hydrolyse von Nucleinsäure oder Teilhydrolysaten
erhaltene Gemisch von 5'-Mononucleotiden
3:5 kann der Kolonnenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschharzen oder Aktivkohle
oder der Elektrodialyse unter Verwendung von Ionenaustauschmembranen unterworfen werden, um
Verunreinigungen in gewissem Umfange oder ganz
zu entfernen. Die gereinigte wäßrige Lösung wird, falls zu verdünnt, so eingeengt, daß die Konzentration
an 5'-Mononucleotiden auf das 4- bis lOfache erhöht wird und mit Natriumhydroxyd neutralisiert,
wobei die 5'-Mononucleotide die entsprechenden Dinatriumsalze bilden. Die so erhaltene Ausgangslösung
kann nach einer der erfindungsgemäßen Arbeitsweisen wie oben angegeben aufgearbeitet werden.
| Organisches | Konzentration | Menge der aus der Lösung auskristallisierten Dinatriumsalze von | Dinatrium- | Dinatrium- | Dinatrium- |
| Lösungsmittel | des organischen | 5 '-M ononucleotiden | 5'-guanylat | 5'-uridylat | 5'-cytidyIat |
| Lösungsmittels | Dinatrium- | g | g | g | |
| 5'-inosinat | 0,00 | 0,00 | 0,00 | ||
| Volumprozent | g | 0,15 | 0,00 | 0,00 | |
| 0 | 0,00 | 0,75 | 0,00 | 0,00 | |
| 30 | 0,21 | 1,21 | 0,21 | 0,34 | |
| 40 | 0,80 | 1,31 | 0,63 | 0,75 | |
| Methanol | 50 | 1,33 | 0,88 | 0,00 | 0,05 |
| 66 | 1,63 | 1,27 | 0,26 | 0,24 | |
| 30 | 0,92 | 1,32 | 0,36 | 0,32 | |
| 40 | 1,35 | 1,32 | 0,85 | 0,92 | |
| Äthanol | 50 | 1,43 | 0,69 | 0,07 | 0,08 |
| 66 | 1,65 | 1,11 | 0,18 | 0,33 | |
| 30 | 0,73 | 1,30 | 0,41 | 0,45 | |
| 40 | 1,12 | 1,35 | 0,68 | 0,54 | |
| Aceton | 50 | 1,20 | |||
| 66 | 1,59 |
Vorstehend sind mehrere Ergebnisse von typischen Versuchen zusammengestellt In den Versuchen wurden
jeweils 50cmsDinatriumsalzlösimg der 5'-Mononucleotide
verwendet. Hergestellt war die Lösung durch Hydrolyse von Hefe-Ribonucleinsäure mit dem
Enzymsystem von Streptomyces aureus. In 50 cm3
der Lösung waren 1,72 g Dinatrium-5'-inosinat, 1,40 g Dinatrium-5'-guanylat, 1,30 g Dhiatrium-5'-uridyIat
und 1,72 g Dinatrium-S'-cytidylat enthalten. Das organische Lösungsmittel wurde der wäßrigen
Lösung bei 25° C bis zur genannten Konzentration zugegeben, worauf ein Gemisch von Kristallen
ausgefällt wurde. Die Kristalle wurden abfiltriert und analysiert, wobei die nachstehend aufgeführten
Werte erhalten wurden.
Die Tabellenwerte lassen erkennen, daß es möglich ist, Kristalle von 5'-Purinnuclertiden durch eine
einfache Behandlung abzutrennen, ohne daß 5'-Pyrimidinnucleotide mitkristallisiert werden. Es ist jedoch
nicht ratsam, reine 5'-Purinnucleotide durch eine einmalige einfache Behandlung abzutrennen, da hierbei
eine erhebliche Menge der 5'-Purinnucleotide zwangsläufig in der Mutterlauge zurückbleibt. In der Praxis
können im Rahmen obiger Grenzen ziemlich hohe Mengen an organischen Lösungsmitteln verwendet
werden. Diese Mengen sind nachstehend aufgeführt:
Organisches
Lösungsmittel
Lösungsmittel
Praktisch brauchbare Konzentration
des organischen
Lösungsmittels
Volumprozent
des organischen
Lösungsmittels
Volumprozent
Vorteilhafteste
Konzentration
des organischen
Lösungsmittels
Volumprozent
Konzentration
des organischen
Lösungsmittels
Volumprozent
Methanol
Äthanol
Aceton
30 bis 65
30 bis 50
30 bis 50
30 bis 50
30 bis 50
etwa 50
etwa 40
etwa 40
etwa 40
etwa 40
Zur Entfernung einer geringen Menge an 5'-Pyrimidinnucleotiden,
mit der die erhaltenen Kristalle verunreinigt sind, kann der gleiche Frozeß wiederholt
werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann wie folgt modifiziert werden: Ein Gemisch der Dinatriumsalze
von 5'-Mononucleotiden wird in einem Gemisch, das die 4- bis 1Ofache Menge Wasser und
daneben Methanol, Äthanol oder Aceton enthält, unter Erwärmen gelöst. Das Verhältnis von organischem
Lösungsmittel zu Wasser ist das gleiche wie das Endverhältnis des Lösungsmittelsystems bei der
vorstehenden Arbeitsweise der fraktionierten Fällung. Die heiße Lösung wird dann — gegebenenfalls
unter Rühren — gekühlt, wobei die Kristalle der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden sich niederschlagen.
In den Teilen b) der folgenden Beispiele 1, 2 und 4 und in den Beispielen 3 und 5 bis 7 werden bevorzugte
Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben. Die Temperaturen sind sämtlich
unkorrigiert, und die Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.
Die zahlenmäßige Auswertung der Beispiele 1 bis 3 und 5 bis 7 findet sich in einer Tabelle im Anschluß
an das Beispiel 7.
a) Wie in dem Beispiel 2 der deutschen Auslegeschrift 11 30785 beschrieben, wurde Hefe durch Einwirkung
einer, Enzymlösung hydrolysiert, die durch Züchten von Streptomyces aureus (Krainsky
emend. Waksman et al.) Waksman et al. erhalten
ίο worden war. Hierbei wurde eine Mischung von
5'-Mononucleotiden im Reaktionsgemisch gebildet. Unter Verwendung eines Filtermittels wurden 35 000
Volumteile der die 5'-Mononucleotide enthaltenden Mischung filtriert. Nach Einstellung auf pH 1,5 ließ
man das Filtrat durch eine mit 500 Gewichtsteilen Aktivkohle gefüllte Kolonne laufen. Die Aktivkohle,
die die 5'-Mononucleotide adsorbierte, wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 20 000 Volumteilen
eines 20 %> Methanol enthaltenden ammoniakalischen Methanol-Wasser-Gemisches eluiert.
Das Eluat wurde auf 10 000 Volumteile eingeengt. Die konzentrierte Lösung ließ man durch eine Kolonne
fließen, die mit 6000 Volumteilen stark basisches quaternäres Ammonium-Anionaustauschharz
gefüllt war. Die 5'-Mononucleotide wurden am Harz adsorbiert. Das Harz wurde dann mit 0,2°/oiger Salzsäure
eluiert. Um die Salzsäure aus dem Eluat zu entfernen, wurde es durch eine Kolonne geschickt,
die mit 200 Gewichtsteilen Aktivkohle gefüllt war.
Die Aktivkohle adsorbierte die 5'-Mononucleotide. Sie wurde mit Wasser gewaschen und dann mit
10000 Volumteilen Ammoniakwasser eluiert, das 20% Methanol enthielt. Das erhaltene Eluat enthielt
5'-Purinnucleotide und 5'-Pyrimidinnucleotide. Die Lösung wurde mit Natronlauge versetzt. Hierdurch
wurden die 5'-Mononucleotide in die entsprechenden Dinatriumsalze umgewandelt. Die Mischung wurde
unter vermindertem Druck eingeengt, und zwar auf 500 Volumteile, die je etwa 50 Gewichtsteile
5'-Purinnucleotide und 5'-Pyrimidinnucleotide enthielten.
b) Dem so erhaltenen Konzentrat wurde das gleiche Volumen Methanol zugesetzt. Die Mischung
wurde erwärmt, um die darin gefällten Substanzen zu lösen. Die Lösung wurde unter leichtem Rühren
24 Stunden in einen kühlen Raum gestellt, wobei sich weiße Kristalle abschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert
und bei 50° C unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden 59,3 Gewichtsteile Produkt erhalten.
Auf Grund der quantitativen Analyse, die durch Elektrophorese bei hoher Spannung und auf enzymatischem
Wege durchgeführt wurde, bestand das Gemisch aus 46,0 Gewichtsteilen der Dinatriumsalze
von 5'-Purinnucleotiden und 1,5 Gewichtsteilen der Dinatriumsalze von S'-Pyrimidinnucieotiden.
a) In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wurde Ribonucleinsäure-Hefeextrakt mit einem Enzymsystem
behandelt, das durch Streptomyces aureus (Krainsky emend. Waksman et al.) Waksman
et al. gebildet worden war, wobei ein Gemisch von 5'-Mononucleotiden gebildet wurde. Das Gemisch
wurde teilweise gereinigt, wobei eine Lösung erhalten
wurde, die 5'-Purinnucleotide und 5'-Pyrimidinnucleotide enthielt. Die Lösung wurde mit Natronlauge
neutralisiert, wodurch die 5'-Mononucleotide in die entsprechenden Dinatriumsalze umgewandelt
wurden, und dann auf 400 Volumteile eingeengt, die die Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und
5'-Pyrimidinnucleotiden in Mengen von je etwa 50 Gewichtsteilen enthielten.
b) Dem Konzentrat wurden 400 Volumteile Methanol zugegeben. Die Mischung wurde erwärmt, um
die ausgefällten Kristalle zu lösen, worauf sie langsam abkühlen gelassen wurden. Nach einer Kühlzeit von
24 Stunden wurde die Mischung nitriert, wobei die ausgefällten weißen Kristalle abgetrennt wurden. Die
Kristalle wurden bei 50° C unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden 71.8 Gewichtsteile
Produkt erhalten.
Das Produkt enthielt laut quantitativer Analyse 47,5 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden
und 10,0 Gewichtsteile Dinatriumsalze χο
von S'-Pyrimidinnucleotiden.
Zu 500 Volumteilen einer wäßrigen Lösung, die je 50 Gewichtsteile der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden
und von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielt, wurden 500 Volumteile Methanol gegeben. Die
Mischung wurde erwärmt, um die kristallisierten Substanzen zu lösen. Nach Abkühlen wurden 500 Volumteile
Methanol langsam zugesetzt. Die Mischung wurde filtriert, um die ausgeschiedenen farblosen
Kristalle abzutrennen, die aus 48,0 Gewichtsteilen Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden und 25,0
Gewichtsteilen Dinatriumsalzen von 5'-Pyrimidinnucleotiden bestanden.
Durch eine Kolonne, die mit 4250 Volumteilen eines porösen, stark basischen quatemären Ammonium-Anionen-Austauschharzes
gefüllt war, wurden 100 000 Volum teile eines Ribonucleinsäurehydroly- sats fließen gelassen, das 56,6 Gewichtsteile 5'-Inosinsäure, 49,0 Gewichtsteile 5'-Guanylsäure, 57,3 Gewichtsteile 5'-Uridylsäure und 45,3 Gewichtsteile
5'-Cytidylsäure enthielt. Hierbei wurden die 5'-Mononucleotide am Harz adsorbiert. Das Harz wurde dann
mit 0,2 η-Salzsäure eluiert. Das Eluat wurde mit 850 Gewichtsteilen Aktivkohle in Berührung gebracht, die anschließend mit einer l,5<Voigen wäßrigen
Ammoniaklösung eluiert wurde, wobei eine gereinigte wäßrige Lösung von 5'-Mononucleotiden erhalten
wurde. Zur Lösung wurde eine 10 η-Natronlauge gegeben, wodurch die 5'-Mononucleotide in die entsprechenden Dinatriumsalze umgewandelt wurden.
Die Lösung wurde auf 660 Volumteile eingeengt. Das Konzentrat enthielt 45,1 Gewichtsteile Dinatrium-5'-inosinat, 38,2 Gewichtsteile Dinatrium-5'-guanyiat, 45,1 Gewichtsteile Dinatrium-5'-uridylat
und 364 Gewichtsteile Dinatriurn-S'-cytidylat.
b) Zur konzentrierten Lösung wurden 660 Volumteile Methanol gegeben, wodurch Kristalle ausgeschieden wurden, die laut Analyse durch Elektro-
phorese bei hoher Spannung und auf enzymatischem Wege aus 36,0 Teilen Dinatrium-5'-inosinat, 33,2
Teilen Dinatrium-5'-guanylat, 6,4 Teilen Dinatrium-5'-uridylat und 7,3 Teilen Dinatrium-5'-cytidylat bestanden.
Zu 50 Volumteilen einer durch Hydrolyse von Nucleinsäuren gewonnenen wäßrigen Lösung, die
3,10 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und 3,00 Gewichtsteile Dinatriumsalze
von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielten, wurden 50 Volumteile Methanol gegeben. Die Mischung
wurde über Nacht bei 25° C stehengelassen, wobei sich Kristalle abschieden. Diese wurden abfiltriert
und getrocknet, wobei 2,75 Gewichtsteile Mischkristalle erhalten wurden, die laut Analyse aus 2,06 Gewichtsteilen
der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden, einer kaum feststellbaren Menge der Dinatriumsalze
von 5'-Pyrimidinnucleotiden und etwa 0,6 Gewichtsteilen Wasser bestanden. Die Ausbeute
an Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden betrug 66,6 »/0.
Zu 50 Volumteilen einer durch Hydrolyse von Nucleinsäuren gewonnenen wäßrigen Lösung, die
3,10 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und 3,00 Gewichtsteile Dinatriumsalze
von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielten, wurden 33 Volumteile Äthanol gegeben. Die Mischung wurde
über Nacht bei 25° C stehengelassen, wobei sich Kristalle abschieden. Diese wurden durch Filtration abgetrennt
und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 2,45 Gewichtsteile Mischkristalle erhalten
wurden, die laut Analyse durch Elektrophorese aus 2,02 Gewichtsteilen der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden,
einer kaum feststellbaren Menge der Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden und etwa
0,4 Gewichtsteilen Wasser bestanden. Die Ausbeute an Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden betrug
65,5 »/ο.
Zu 50 Volumteilen einer durch Hydrolyse von Nucleinsäuren gewonnenen wäßrigen Lösung, die
3,10 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und 3,00 Gewichtsteile Dinatriumsalze
von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielt, wurden 30 Volumteile Aceton gegeben. Die Mischung wurde über
Nacht bei 25° C stehengelassen, wobei sich Kristalle abschieden. Diese wurden durch Filtration abgetrennt
und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 1,65 Gewichtsteile eines kristallinen Pulvers erhalten
wurden, das laut Analyse durch Elektrophorese zu 1,36 Gewichtsteilen aus den Dinatriumsalzen von
5'-Purinnucleotiden, einer kaum feststellbaren Menge der Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden und
zu etwa 0,25 Gewichtsteilen aus Wasser bestand. Die Ausbeute an 5'-Purinnucleotidsalzen betrug 44,0 Vo.
Umstehend Tabelle zu den Beispielen 1 bis 3 und 5 bis 7.
609632/30!
ίο
5'-Purinnucleotide 5'-Pyrimidinnucleotide
5'-IMP · Na2 5'-GMP · Na2 5'-UMP · Na2 5'-CMP · Na2
| Gewichtsteile | in der | und 3 | und 7 | ί | etwa | 50 | 22,5 | etwa 50 | 23 | 27 | 6,1 | 25,0 | 14,5 | 3,0 | 1 6 |
| Ausgangslösung der | 1 | 5 | 1 | 27,5 | J-J V^ | ||||||||||
| Beispiele 1, 2 | 21,2 | 0,6 | 1,5 0,9 |
feststellbar | |||||||||||
| Betrag im |
2 | 0 | { | 24,8 | 46,0 | 10,0 | feststellbar | ||||||||
| Produkt | Ί | 7 | J | 47,5 | 21,7 | 3,9 | |||||||||
| der | J | \ | 25,8 | feststellbar | |||||||||||
| Beispiele | in der | j | 48,0 | 22,0 | 10,5 | ||||||||||
| Ausgangslösung der | ι | 26,0 | |||||||||||||
| Gewichtsteile | Beispiele 5, 6 | ί | 3,1 | 1,5 | 1,4 | ||||||||||
| Betrag im |
1 | 1,6 | |||||||||||||
| Produkt | 0,98 | kaum | |||||||||||||
| der | { | 1,08 | 2,06 | kaum | |||||||||||
| Beispiele | j | 2,02 | 0,98 | ||||||||||||
| 1,04 | kaum | ||||||||||||||
| f | 1,36 | ||||||||||||||
0,66
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Anreicherung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guany]säure aus einem durch Hydrolyse von Nucleinsäuren mit adenylsäuredeaminasehaltigen Enzymsystemen erhaltenen Purin- und Pyrimidinnucleosid-5'-monophosphate enthaltenden Gemisch von Nudeosid-5'-monophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß mana) entweder 1 Gewichtsteil der Dinatriumsalze des Nucleosid-S'-monophosphatgemisches in einem Lösungsmittelgemisch, das die 4- bis lOfache Volumenmenge Wasser — bezogen auf Nucleosid-S'-monophosphatsalze — im Gemisch mit Methanol, Äthanol oder Aceton im Volumenverhältnis von etwa 2:1 bis 1:2 enthält, unter Erwärmen auflöst und die Mischung abkühlen läßt oderb) eine Lösung von 1 Gewichtsteil der Dinatriumsalze des Nucleosid-S'-monophosphatgemisches in 4 bis 10 Volumteilen Wasser mit Methanol, Äthanol oder Aceton versetzt, bis das Volumenverhältnis von Wasser zu den genannten organischen Lösungsmitteln etwa 2 :1 bis 1 : 2 beträgt, und anschließend das abgeschiedene, zum überwiegenden Teil aus den Dinatriumsalzen der 5'-lnosinsäure and 5'-Guanylsäure bestehende Nucleosid-5'-monophosphatgemisch isoliert.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1961T0020610 DE1226588C2 (de) | 1961-08-17 | 1961-08-17 | Verfahren zur anreicherung von 5'-inosinsaeure und 5'-guanylsaeure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1961T0020610 DE1226588C2 (de) | 1961-08-17 | 1961-08-17 | Verfahren zur anreicherung von 5'-inosinsaeure und 5'-guanylsaeure |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1226588B DE1226588B (de) | 1966-10-13 |
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Family
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|---|---|---|---|
| DE1961T0020610 Expired DE1226588C2 (de) | 1961-08-17 | 1961-08-17 | Verfahren zur anreicherung von 5'-inosinsaeure und 5'-guanylsaeure |
Country Status (1)
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Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1961
- 1961-08-17 DE DE1961T0020610 patent/DE1226588C2/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE1226588B (de) | 1966-10-13 |
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