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| Ver#-'a"I-ren zur I'erstellung von 5t-Nueleotiden |
| Die Er-'Zndtzn; ;etrifft eire V°.rfa@ren zur Gewinnun- und
Reinigung |
| dert-_:J@nu^leotic!e ridenosin-5'-monophosphat |
| :^.n-t-monophosphat (G-=-PF) . Cytidir@-51-:m@@ph isphat |
| (C-f-I:T@ und @ridin-t-monopriospl,at (U-J-MPs |
| A--:} rii,c1 auf",-rund seiner Kre-i sI.auf"-firlci,n" |
| dient aiz`erdem als folxsto:z #' :#u- ra::.nr# in; des |
| ebenf'alI_r intere:'santen @täenü.n-@ °.1@'_.>sp@@ats |
| . .;i.l-,rln@@n , ce^ alce<'1@::@ac:l@@z..Fe |
U-5-MP hat als Bestandteil von pharmazeutischen Präparaten Bedeutung.
Alle 4- Nuoleotide gelangen. züm Einsatz als _bia"-chemische Einzelreagenzien und
dienen. außerdem als Rohstoff für die Synthese von hochwertigen Folgeprodukten.
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In sehr geringen Mengen liegen die 5t- Ribonucleotide in den meisten
biologischen Materialien vor und können hieraus-nach bekannter Verfahren isoliert
werden. Diese Verfahren sind nur dann. wirtschaftlich, wenn die 51-Ribonucleotide
als Nebenprodukt mit der Isolierung von wertvolleren t.05stanzen anfallen. Infolge
der äußerst niedrigen Ausbeute@' @:.'. der Bedarf nach diesen Verfahren jedoch nicht
gedeckt", _ Es wurden b""-, _: its Verfahren _ znr Herstellung von
5. --Rbonucleotiden aL;- mikrebielogiscem Weg beschrieben. Hierbei handelt es sich
entweder uni vollständige mIkrobölogische ge= Synthesen aus einfachen. Grundstoffen
(s. Deutsche . AUsle. schritt 1 201 797) oder um einen mikrobioloiseheri
Abbau von auf anderm Weg gewonnener Ribonuclensäure (Deutsche Auslegeschrift 1
130 785). - .
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Z. Shuster und N.C. Kaplan$ fourn.Bial.Ghem.; 201, 5x5 (1`.153) und
2@2@` ,, 289 (1957) haben beobachtet, daß die Ke m-linge ge- -wisser Pflanzen,
insbesondere die von Grasarten Enzyme enthalten,
welche in der Lage
sind, Hibonucleinsäure zu 5t-Mononuc-leotiden abzubauen. Hierauf beruhen die Verfahren
der Deutsehen Auslegeschriften 1 181 151, 1 1.84 313 1 185 144, die sich auf Verfahren
zur Herstellung und Eieinigung von Malzkeimextrakten beziehen, welche geeignet sind,
Nuelein,äuren zu . 5 r-Mononucleotiden zu spalten. Ferner ist aus der Franzö si-.
sehen Patentschrift 1_ 331. 615 ein Verfahren zum enzymatischen Abbau von Nucleinsäurlen
bekannt. Eingesetzt wird ein wässeriger Malzkeimextrakt, der nach verschiedenen
Bedingungen hergestellt und vorbehandelt ist. Mit diesem Extrakt werden Nucleinsäuren
hydrolisiert und die hieraus gebildeten 5f-Mononucleotide nach bekannten Verfahren
aufgearbeitet.
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A -len im obigen,Absatz erwähnten Verfahren ist gemeinsame daß Malzkeime
gemahlen werden und daß hieraus ein Extrakt hergestellt wird, der nach im einzelnen
beschriebenen Verfahren vorgereinigt werden muß. Des weiteren wird bei allen vorgenannte
Verfahren ausschließlich Riuonucleinsäure eingesetzt, so daß schließlich. eine Reaktionslösung
erhalten wird, die neben geringen Mengen Enzymprotein aus dem gereinigten Extrakt
nur Nueleinsäüren und deren Abbauprodukte sowie gege#enenfalls zur Konstanthaltung
des pH-Werts zugesetzte Puffersrzbstanzen enthält Alle diese bekannten Verfahren
sind relativ kompliziert u.nä mit Ausbeuteverlusten verbunden. Die mikrobä.logischen
Verfahren erfordern einen großen technischen Aufwand hinsiehtlieh
der
Herstellung der Kulturen von Mikroorganismen. Außerdem müssen vorgereinigte bzw.-vollkommen
isolierte Nucleinsäuren eingesetzt werden.
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Bei den Malzkeimverfahren ist die Rohstoffbasis für das Enzympräparat
wirtschaftlicher, jedoch ist die Bereitung des Extraktes und dessen Reinigung immer
noch mit einem beträchtlichen Aufwand und Verlust an Enzymaktivität_verbunden. Außerdem
ist auch hier die immer mit Verlusten verbundene Herstellung.der Ribonueleinsäure
notwendig. Ribönueleinsäure wird im allgemeinen aus verschiedenen:Hefearten, insbesondere
Saccarömyces und Torula gewonnen. Die Verfahren zur Gewinnung von Ribonücleinsäure
liefern maximal ca. 80 % der Theorie-Ausbeute (Deutsche Patentschrift
1 jjl 615 ) .
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zügrundg, ein Verfahren
zur Herstellung von 51-Nucleotiden zu schaffen, welches die_Nachteile der bekannten
Verfahren vermeidet und einfach und in industriellem Maßstab ohne Schwierigkeiten
durchführbar ist.
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Es wäre denkbar, auf die Herstellung des :Extraktes zu ver-' zichten
und stattdessen feingepulverte Malzkeime in die Reaktion einzusetzen. Da diese jedoch
unspezifische Phospha:-Lasen in beträchtlicher Aktivität enthalten, tritt, wenn
auf die in den bekannten Verfahren beschriebene Aufbereitung,, des 1;nzymes;trahtes
verzichtet wird, sonst aber gleiche J3edingungen
eingehalten werden,
ein unerwünschter Abbau der primär gebildeten 5t-Nucleotide zu Nucleoäiden ein-.
Außerdem werden aus den gepulverten Keimlingen, wenn sie für die Dauer des Reaktionsansatzes
anwesend sind, unerwünschte Begleitstoffe, vor allem Schleimstoffe, herausgelöst,
welchecdie weitere Aufarbeitung des Produktes stören. Das Einsetzen von unzerkleinerten
Malzkeimen verbietet- die Ansieht des Fachmanns. Die intakten Zellwände pflanzlichen
Materials gelten nämlich. als undurchlässig für hochmolekulare Proteine, wie es
die bnzyme sind. .Eigene Untersuchungen haben auch ergeben, daß es nicht möglich
ist, aus unzerkleinerten Malzkeimen die Enzyme herauszulösen, welche Nue'leinsäuren
zu 5 t-Monontieleotiden spalten.
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Zur Ausbeuteverbesserungkönnte man daran denken, auf die mit Verlusten
verbundene Isolierung der Ribflnuoleinsäuren zu verzichten, wenn die infrage kommenden
Hefearten. direkt in den Reaktionsansatz eingebracht werden könnten. Diesem Verfahren
steht entgegen, daß die Ribonuoleinsäure in der Hefe in einer unlöslichen Form vorliegt,
weiche niol:t durch Malzkeimenzyme gespalten werden kann. Durch Zugabe von Alkali
läßt sich die Ribonueleinsäure zwar in Lösung bringen', jedoch werden hierbei je
nach Dauer der Einwirkung mehr oder weniger große Mengen an 3t- und' 2-Mononueleotden
gebildet. Diese den 5t-Mononuc'.leotiden isomeren Substanzen lasse, sch von letzteren
nicht oder nur sehr eAwierig und unter großen Yetlusten abtrennen. Schließlich verbietet
sioh die Verwendung von intakter Hefe zur" Gewinnung von 5t-Nucleotden auf enzymatischem
Wege,
wüil der Zellsaft der Hefe in großen Mengen anorganische Salze, Aminosäuren, Peptide
und Kohlen= hydrate enthält (vgl. H.Vogel, "Die Bierhefe und ihre Verwertung", Seite
158, Basel 1959), welche die Isolierung und Reinigung der evtl. gebildeten 5t-Mononucleotide
nach den klassischen Methoden (z.B. Ausfällung als Blei- oder Bariumsalze) unmöglich
machen würde.
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Überraschenderweise wurde nun gefunden; daß es möglich ist, mit 'ganzen,
urzerkleinerten und nicht vorbehandelten Malzkeimen die in der Hefe vorkommende
Ribonueleinsäure ohne vorhergehende Isolierung derselben in einem Eintopfverfahren
in.-5t:-Mononucleotide überzuführen und diese in einem einzigen:-weiteren Schritt
abzutrennen und zu reinigen Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 5°-Ribonucleotiden
aus Hefe besteht daher darin, daß urzerkleinerte
| Malzputzkeime Temperaturen zwischen 50 und 700 G auf
eine |
vorbehandelte Hefesuspension bei einem zwischen 7,5 un-_d 8,9 liegenden pH-Wert
einwirken gelassen werden.
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Nach dem erfindungsgemUen:Verfahren läßt sich jede Art von Hefe, vor
allem jedoch Bierhefe, Bäckerhefe, Sprithefe und Torulahefe mit jeder Art von Keimlingen
von Gräsern und Getreidearten, insbesondere jedoch mit: den In-technischen Mengen
leicht erhältlichen Malzputkeimen umsetzen.
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Die lebende Hefe wird durch Erhitzen auf etwa 900 bis
1000 0
abgetötet., wobei wesentlich ist, daß die Struktur
der Zellwand durch -diesen Schritt. teilweise zerstört wird. Die Erhitzung kann
z.B. im Durchflußverfahren mit einer-Heißhaltezeit von mindestens 1,5 min. erfolgen:
Die Hefesuspension wird daßn vorzugsweise auf 400 G abgekühlt und unter intensivem
Mischen etwa 8-12 min. lang, vorzugsweise 10 min: mit Alkali, vorzugsweise Natronlauge
auf pH 12,5 bis 13,5, vorzugsweise 13,0 gestellt._Dänn wird sofort auf pH 7,5 bis
8,9, vorzugsweise pH 8,4 eingestellt, vorzuggweise' mit :Essigsäure. Wenn die Hitzebehandlung
nicht wie angegeben durchgeführt wird oder wenn die Zeitdauer der Alkalisierung
kürzer ist als angegeben, ist die Endausbeute an 5t-Nueleotider wesentlich niedriger.
Eine längere Alkalisierung bewir._t, e' Bildung der unerwünschten 2t- und 3t-Isomeren.
Die Wirksami#.-des Alkalischritts ist außerdem von der Temperatur abhängig.
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So muß bei Raumtemperatur etwa 2U min. lang alkalisiert werden, während
bei über 45 - 50° liegenden Temperaturen die Bildung von unerwünschten Isomeren
unvermeidlich ist.
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Die vorstehend beschriebene Alkalisierung der Hefe ist jedoch nicht
erfindungswesentlich, da je nach dem verwendeten Ausgangsmaterial auch hierauf verzichtet
werden kann. So kann das erfindungsgemäße Verfahren bei Verwendung von Torulahefe,
die auf Sulfid ablaugen gezüchtet wird, auch ohne diese Alkalisierung vorteilhaft
durchgeführt werden.
Die durch Erhitzen und gegebenenfalls Alkalisierung
vorbehandelte Hefesuspension wird auf' 5u bis 700 C, vorzugsweise jedoch
auf 60o C erwärmt. Ein Arbeiten außerhalb diesesTemperatürbereiches ist ungünstig,
da unterhalb 500 Nucleoside entstehen und oberhalb 700 das Enzym die Aktivität verliert,
Ein besonders geeigneter Bereich liegt zwischen 50°und etwa 60° C. Dann werden unzerkleinerte
Keimlinge von Gräsern, oder Getreidearten, vorzugsweise Malzputzkeime zugesetzt.
Hiermit wird die enzymatische Hydrolyse eingeleitet. Da hierbei ,Säureäquivalente
frei werden, wird durch Zudosierung von Lauge über einen pH-Btat der pH-Wert auf
7,5 bis 8,9; vorzugsweise 8,4 gehalten. Überraschenderweise wird unter diesen Bedingungen
die Ribonucleinsäure zu 51-Mononucleotiden gespalten, während praktisch keine Dephosphörylierung
zu=Nucleösiden erfolgt. Es wird. angenommen, daß äie für die Spaltung der Ribonucleinsäure
verantwortlichen Phosphodiesterasen und Nucleasen die vorgenannte Reaktionstemperatur
aushalten,-während die Phosphatasen zerstört werden. Dabei entsprechenden Versuchen
festgestellt wurde, daß es nicht möglich ist, die benötigten Enzyme aus unzerkleinerten
Malzkeimen mit Wasser oder mit Pufferlösungen zu extrahieren:, muß angenommen werden,
d-aß die gelöstet Ribonucleinsäure in die Malzheime eintritt. Eine Erklärung für
diese, allen thenretischen'-Erkenntnissen widersprechende Reaktionsweise konnte
nicht gefunden werden.
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Die Reaktionsdauer ist von der Menge der eingesetzten Keime abhängig.
Im allgemeinen ist :..die Reaktion nach etwa 2 bis l2
Stunden abgelaufen.
-Die Aufarbeitung des Ansatzes erfolgt auf einfache Weise, indem die Keime abgesiebt
und die zurückbleibende Hefesuspension auf etwa 90 - 10U° C erhitzt und darauf das
ungelöste Zellmaterial der Hefe auf geeignete Weise, beispielsweise durch Filtration,
mit einem Separator oder durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Man erhält so einen
klaren bis schwachtrüben Hefe-1-.ochsaft, der die #ier 5t-Mönonueleotide neben den
anderen lösliehen Kompnenten der Hefe und Natriumaeetat enthält.
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hach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Nucleoside sowie 21- bzw.
3i-Nueleotide überhaupt nicht oder nur in. äußerst geringem Maße gebildet. Die Bestimmung
der entstandenen Produkte kann auf bekannte Weise erfolgen, beispielsweise dureh-Austauscher-
ehromatografische Analyse nach W.F.Cohn in E.Ghargaff und J.N.Davidson, "The. Nueleio
AcidsVol: Z, 230-232, -Academie Press New York 1955.
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Auch die Auftrennung und Reinigung der 5 t-Nueleotide kann nach dem
angegebenen Verfahren von W.E.Cohn erfolgen. Als besonders geeignet hat sieh jedoch
eine Abwandlung des Verfahrens von Cohn erwiesen..Infolge des hohen Gehalts an Na#-triumacetat
(ca. 1 Molar) sowie an aus der Hefe und den Malzkeimen stammenden Verunreinigungen,
insbesondere Schleimstoffe, Kohlehydrate, t eptide, anorganische Salze usw., ergaben
sich bei der teeiinitschen Durchführung der Austauscherehromatografie wier:i.pkeiten,
die erfindungsgemäß durch- besondere .Auswahl
und Anordnung der
Austauscherharze überwunden wurden.
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Es hat sich, gezeigt, daß die Nucleotde von schwach basscheu Anionenaustauscherharzen,
welche zuvor mit Acetationen beladen wurden, selektiv adsorbiert werden, ohne daß
die in der Lösung befindlichen anderen _dissozilerbaren Substan.-,-zen stören. Wird
ein feinkörniges Austauscherharz Körnung ü,3 - 1,0 mm) verwendet, so scheiden sich
jeddch an der Qberfläche der Harzkörner Schleimstoffe ab, welche durch Verkleben
der Säulenpackung diese undurchlässig machen. Wird dagegen ein grobkörniges und
wenig vernetztes Austauscherharz eingesetzt, so findet zwar das Verkleben der Säulenpackung
nicht .statt und es ist möglich, die gewünschten Substanzen am Ionenaustauscher
zu adaorbieren, doch ist es bei der nachfolgenden Elutaxi unmöglich, das Gemisch
der vier Mononucleo= tde in die Einzelkomponenten aufzutrennen.- Es wird vielmehrein
Gemisch aller Vier Komponenten vom. Austauscherharz her= untergewäschen.
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Nach dem erfindungsgemäßen V-Erfahren wird dieses Problem dadurch
gelöst, daß aus der Reaktionslöaung alle` vier Piononucleotide an einem grobkörnigen,
schwach basischen Anionenaustauschen im Acetatsystem adsorbiert.werden. Als besonders
geeignet: erwies sich hierfür das- unter der Bezeichnung MAC A 17 im Handel erhältliche
Austauscherharz. Dann-*ird mit ent® ionisiertem Wasser gewaschen und der nunmehr.
mit .clean Ntxc liotidgemi ch: beladenen ersten .Säule eine kleinere zweite Säule
nachgeschaltet., welche ebenfalls mit einem acetatbelade.nen schwachbasischen
Anionenaustauscherharz
beschickt ist, welches jedoch in einer feinkörnigen Form vorliegt. Diese zweite
Säule dient als Trennzone, so daß, wenn nun wie üblich mit einer steigenden Ameisensäure-
bzw. Formiatkonzentration eluiert wird, im Säulenablauf ein Nucleotid nach dem anderen
in der Reihenfolge C-5-MP, A-5-MP, U-5-MP und G-5-MP völlig rein und: frei von verunreinigenden
Komponenten anfällt. Die Größe der zweiten Säule ist nicht kritisch, vorteilhafte
Ergebnisse werden jedoch mit einer Säule erhalten, die etwa 1/4 der Größe der ersten
Säule hat. Besonders günstige Ergebnime wurden mit IMAC A 17 Austauscherharz erhalten,
jedbch können auch andere feinteilige: schwachbasische Anionenaustauscherharze verwendet
werden. Die Ausbeute bei di&sem erfir-aungsgemäßen Trennungs- und' Reinigungsverfahren
beträgt annähernd lUU % der Theorie.
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Das folgende Beispiel zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Beisp§Iäl 1o0 kg Bäckerhefe (Trockenmasse = 27 A werden mit 100 1 Wasser
angerührt, 2,5 min:" auf 950'C erhitzt und anschlie-Pend auf Z1-00 C abgekühlt.
Dann wird mit 5() oger Natronlauge unter intensivem Rühren auf pH @= 13,0 gestellt
und nach 10 min. mit Essigsäure auf pH = 8,4 zurückgestellt. Nachdem atff
60o C aufgeheizt wurde, werden 4 kg handelsübliche Malzputzkeime zugesetzt. Während
12 Stunden wird unter Umrühren die Temperatur auf 6(j 0 C und der pH-Wert
auf 8,4 durch Zudosieren von Natrongehalten;
dann. wird mit Essigsäure
auf pH = 5,5 gestellt und auf 900 C erhitzt. Die Malzputzkeime werden abgesiebt-und
die ungelösten Hefeanteile absepariertDie so erhaltene klare Lösung läßt man über
dhe,8 1 acetatbeladenen Anionenaustauscher IMAC A 27 (KorngrößeC2 mm) enthaltende
Säule fließen. Dann wird mit ea. 10 1-entsalztem Wässer nachgewaschen. Hinter diese
Säule wird-nun eine -zweite Säule, welche mit ca. 2 1 acetatbeladenem IMAC A 17
(Korngröße<l mm) beschickt ist, geschaltet:
mit 0,-I m Ameisensäure wird Gytidin#5 t-monophosphat, (Lösung 1)-mit 03 m Ameisensäure
wird--Adenosin-5f-monophosphat, (Lösung 2) mit 0,4-m Ammoniumformiat wird Uridin-5'-monophosphat,
(Lösung 3) mit 0,5 m Am moniumformiat wird Guanosin-5t¢monophosphat,(Lösung von
der Säule heruntergewaschen.
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Nach dem Eindampfen der ameisensauren Lösung kristallisieren aus Lösung
1 107 g Cytidin-5t@monophosphat (92 % rein) und: aus Lösung 2 163 g Adenosin=5t-monophosphat
(g5 % rein). Die ammoniumformiathaltigen Lösungen .3 und 4 werden durch eine Aktivkohlepassage
entsalzt. Aus dem gluat der Aktivkohlesäule können nach Neutralisation mit Xetronlauge
16G g Uridin-5ttmonopho,4phat als Natriumsalz kristallisiert werden (9U % rein)
bzw. 155 g Guanogin-:5 t-monophosphat als Natriumsalz mit Alkohol-gefällt werden.
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