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Verfahren zur Gewinnung von 5'-Mononucleotiden
In der biochemischen Forschung wie in der Heilmittelchemie gewinnen infolge ihrer zentralen Stellung im Stoffwechselgeschehen die Ribose-5-Phosphate der Purine und Pyrimidinbasen eine ständig wachsende Bedeutung. Die bisherigen Verfahren zur Herstellung dieser Produkte konnten nicht befriedigen. Die chemische Synthese beansprucht nach wie vor umständliche und kostspielige Reaktionsschritte. Die Biosynthese aus den entsprechenden Basen und Ribose-l'-phosphat bzw. den Ribosiden (Nucleosiden) setzt eine Reindarstellung der Ausgangsprodukte aus biologischem Material voraus, wodurch auch diese Verfahren einen erheblichen technischen Aufwand erfordern.
Der Abbau von Nucleinsäuren auf chemischem Wege führt nicht zu den gewünschten 5'-Mononucleotiden, sondern zu einem Gemisch von 2'-und 3'-Mononucleotiden. Auch der enzymatische Abbau der Nucelinsäuren mit den üblichen Depolymerasen führt nur zu 2'-und 3'-Mononucleotiden.
Es ist auch schon bekannt, dass man Nucleinsäuren zu Mononucleotiden mit Hilfe von Enzymen spalten kann. Als enzymhaltige Substanzen sind für diesen Zweck neben bestimmten Mikroorganismen vor allem Dingen Schlangengifte genannt worden.
Wie Khorana gezeigt hat, beginnt der hydrolytische Angriff an dem endständigen Mononucleotid einer Ribonucleinsäure, dessen 3-Hydroxylgruppe der Ribose frei, d. h. nicht mit Phosphorsäure verestert ist. Sukzessiv erfolgt dann der Abbau weiter, wobei jeweils ein Mononucleotid abgespalten wird.
Der Verwendung von Schlangengiften haftet jedoch der Nachteil an, dass infolge ihres Gehaltes an den verschiedenartigsten Enzymen der Abbau schwer zu kontrollieren ist und häufig bis zu den Nucleosiden erfolgt. Ein so weitgehender Abbau ist in den meisten Fällen unerwünscht. Man hat daher versucht, die enzymatische Wirkung der Schlangengifte herabzusetzen, vor allen Dingen die Wirksamkeit der 5'-Phosphor-diesterase weitgehend zu erhalten und gleichzeitig die Aktivität der 5'-Nucle- otidase zu hemmen. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Beispielsweise hat man die Schlangengifte unter Verwendung verschiedener Fällungsmanipulationen gereinigt. Ein weiterer Weg zur Inaktivierung der Nucleotidase besteht darin, dass man die Schlangengifte einer Hitzeeinwirkung aussetzt.
Ferner ist bekanntgeworden, dass bestimmte Metallionen zu inaktivieren vermögen. Auch die Kombinationen einzelner Inaktivierungsverfahren ist beschrieben worden.
An allen diesen Verfahren ist jedoch nachteilig, dass sie bei den meisten der zur Verfügung stehenden Schlangengifte umständlich zeitraubend und nur unter Einhaltung von bestimmten Bedingungen durchführbar sind. Zudem ist die Beschaffung der als Ausgangsmaterial für die enzymatische Spaltung erforderlichen Schlangengifte kostspielig und gefährlich.
Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von 5'-Mononucleotiden durch enzymatischen Abbau von Nucleinsäuren mit aus Pflanzenextrakten gewonnenen Enzymen gefunden. Erfindungsgemäss gelang man zu den genannten Mononucleotiden, wenn man als Enzymquelle S'-phosphordiesteraseaktive
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wässerige Pflanzenextrakte verwendet deren Nucleotidasen inaktiviert und/oder entfernt wurden.
Es hat sich nämlich gezeigt, dass in pflanzlichem Material der verschiedenstenPflanzen und/oder Pflanzenteile Phosphor-Diesterase enthalten ist und durch Auslaugen mit Wasser, gegebenenfalls auch in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, ein aktiver Enzymextrakt aus diesen erhalten werden kann.
Unter pflanzlichem Material werden in der Erfindung in erster Linie Pflanzen, oder Pflanzenteile, wie Früchte, Samen, Knollen Wurzeln und/oder Rüben, ferner Pflanzenkeimlinge sowie Gemische verschiedener und beliebiger Pflanzen oder Pflanzenteile, gegebenenfalls mit Keimlingen, verstanden.
Als besonders geeignet haben sich rohe Extrakte aus Samen, Keimen und/oder Keimbestandteilen von Di- oder Monokotyledonen, wie beispielsweise Leguminosen, Weizen, Reis, Gerste und/oder Gräser sowie die bei der Malzbereitung anfallenden sogenannten Putzkeime erwiesen. Es liegt auch im Rahmen der Erfindung, dass man an Stelle der rohen Extrakte solche verwenden kann, die teilweise vorgereinigt sind. Beispielsweise können die Extrakte durch fraktionierte Calciumphosphatgelfraktionierungen oder Ausfällungen durch Aceton oder Alkohol erhalten werden.
Im allgemeinen ist es zweckmässig, den erhaltenen Extrakt durch wenige Reinigungsschritte an Enzym anzureichern. Zur Reinigung kann beispielsweise das Enzym an Calciumphosphatgel, das der klaren Lösung zugegeben wird, absorbiert, dann nach Abzentrifugieren mit Ammoniumsulfat- und Phosphatpufferlösung eluiert und aus der Lösung mit Methanol, Äthanol, Aceton od. dgl. organischen Lösungsmitteln gefällt werden. Durch anschliessendes Chromatographieren entfernt man auch die noch vorhandene 5'-Nucleotidase, ein Enzym, das aus den 5'-Mononucleotiden Phosphorsäure abspaltet.
Zur Gewinnung vonMononucleotiden wird derEnzymextrakt einer nucleinsäurehaltigen Lösung oder Aufschlämmung zugesetzt und die gebildeten Mononucleotide zweckmässigerweise als Erdalkalisalze ausgefällt. Eine vorherige Reinigung der Nucleinsäuren ist beim erfindungsgemässen Verfahren nicht erforderlich; vielmehr können auch einfache Hefeextrakte als nucleinsäurehaltiges Material verwendet werden.
Das erhaltene Reaktionsprodukt stellt eine Mischung der Nucleotide des Adenins, des Guanins, des Uridins und des Cytosins dar. Die Auftrennung der einzelnen Nucleotide kann mit Hilfe von Anionenaustauschern erfolgen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können auch in derselben Weise wie oben beschrieben, die Desoxyribonucleotide des Adenins, des Guanins, des Cytosins und des Thymins gewonnen werden, wenn als Ausgangsstoff Desoxyribonucleinsäuren bzw. desoxyribonucleinsäurehaltiges Material zum Einsatz kommen.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet man zur enzymatischen Spaltung von Nucleinsäuren zu 5'-Mononucleotiden solche Extrakte aus pflanzlichem Material, die einer kurzzeitigen Wärmebehandlung, gegebenenfalls in Gegenwart von Schwermetallsalzen, ausgesetzt worden sind.
Danach werden die heterogen zusammengesetzten Extrakte aus pflanzlichem Material, die gegebenenfalls zwecks Verhinderung von unerwünschten Infektionen mit in Wasser schwer oder unlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Toluol und/oder Chloroform, versetzt sein können, vor ihrer Anwendung zur Spaltung der Nucleinsäuren kurze Zeit, etwa 5 - 40 min, zweckmässigerweise 15 - 25 min, gegebenenfalls in Gegenwart von Schwermetallsalzen, auf Temperaturen zwischen 45 und 70 C, vorzugsweise 55 - 650, erwärmt. Von besonderem Vorteil ist die Verwendung von anorganischen Salzen, wie Chloride, Sulfate, Nitrate der Metalle Zink, Nickel und Kupfer. Die Konzentration an Schwermetallsalzen in den Extrakten soll zweckmässigerweise 10-2 - 10-5 molar betragen.
Es hat sich als überraschend herausgestellt, dass bei vorliegendem Verfahren der PH-Wert in weiten Grenzen schwanken kann, wobei verständlicherweise extrem saure oder alkalische Bereiche zu vermeiden sind. Zur Erzielung einer weitgehenden Inaktivierung der 5'-Mononucleotidase hat sich die Einstellung des Extraktes auf pH-Werte zwischen 4 und 7 als besonders zweckmässig herausgestellt. Gegebenenfalls kann man das Verfahren auch in Gegenwart von Pufferlösungen, wie beispielsweise Phosphat-, Phthalat-, Acetat-oderTris- (oxymethyl)-aminomethan-Puffer, durchführen.
Bei dieser Ausführungsform wird ein erheblicher Zeitgewinn und eine grösstmögliche Schonung der 5'-Phosphor-diesterase-Aktivität bei gleichzeitig weitestgehender Inaktivierung der 5'-Nucleotidase erzielt. Zudem arbeitet das beanspruchte Verfahren mit einem sehr geringen Aufwand an Fremdmaterialien.
Arbeitet man ohne Schwermetallsalzzusatz, so hat sich zur Erzielung einer weitgehenden Inakti-
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vierung der 5'-Nucleotidase die Einstellung des Extraktes auf PH-Werte zwischen 4 und 7 als besonders zweckmässig herausgestellt. Es ist dabei zusätzlich gefunden worden, dass die Pflanzen während des Extrahierprozesses nicht mit einer auf einen bestimmten PH-Wert eingestellten wässerigen Lösung behandelt zu werden brauchen. Gegebenenfalls kann man das Verfahren auch in Gegenwart von Pufferlösungen, wie beispielsweise Phosphat-, Phthalat-, Acetat-oder Tris- (oxymethyl)-aminomethan-Puffer, durchführen.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Extrakte werden als solche direkt zur Spaltung von Nucleinsäuren eingesetzt.
In den folgenden Beispielen wird das Verfahren näher erläutert : Beispiel l : 20g Gerstenputzkeime werden 3 h mit 200cm* Tris-Pufferlösung von PH 8,5 extrahiert, dann 30 min bei zirka 10 000-15 000mal Gramm zentrifugiert. Die Lösung wird über Nacht gegen Leitungswasser dialysiert und dann auf einen Austauscher auf Basis Dextran mit DiäthylaminoäthylGruppen ("Sephadex DEAE, Type A 50, coarse" der Firma Pharmacia Upsala, Schweden) gegeben, der zuvor mit 1/100 Mol Trispuffer eingestellt ist. Die Elution des Enzyms erfolgt mit einem Acetatpuffer von PH 5, 5 unter Verwendung eines Kochsalzgradienten. Das eluierte Enzym ist in der anfallenden farblosen Lösung hoch aktiv.
Beispiel 2 : Für den Spaltungsansatz werden 60 Raumteile bzw. 1, 4 oder 1, 0 Raumteile, des gemäss dem Beispiel 1 erhaltenen Extraktes mit 10 Raumteilen Nucleinsäurelösung (5 /oig) und 30 (bzw.
10) Raumteilen 0, 1 m Tris-Puffer (bzw. Collidin-Puffer) von PH 8, 0 unter Zusatz von Toluol bzw.
Chloroform versetzt. In den zugehörigen Blindversuchen ersetzt man die Nucleinsäurelösung durch 10 Raumteile Wasser. Die enzymatische Spaltung wird bei 370C durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Spalten 6 und 7 der nachstehenden Tabelle I aufgeführt.
Tabelle l
EMI3.1
<tb>
<tb> Spalte <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7
<tb> Bei- <SEP> Enzym- <SEP> Nuclein- <SEP> Puffer- <SEP> Spaltungs- <SEP> Nucleinsäure
<tb> spiel <SEP> lösung <SEP> säurelö- <SEP> lösung <SEP> dauer <SEP> Nuclein- <SEP> P2O5-Abspalcm3 <SEP> sung <SEP> (5%ig) <SEP> pH <SEP> 7,5 <SEP> Stunden <SEP> säurespal- <SEP> tung <SEP> %
<tb> cm3 <SEP> cm3 <SEP> tung <SEP> %
<tb> 1 <SEP> 1,0 <SEP> 10 <SEP> (0,2%ig) <SEP> 19 <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 0,0
<tb>
Beispiel 3 : Zur Bestimmung des Spaltungsverlaufes werden nach beendeter Bebrütung die An- sätze nach vorhergehender Abkühlung mit Trichloressigsäure-Uranylacetatlösung (MacFadyens-Reagens) versetzt und filtriert, um nicht umgesetzte Nucleinsäure zu entfernen.
Dann wird die UV-Adsorption im Spektrophotometer gegen den Blindansatz gemessen. Die P 05 -Bestimmung erfolgt mit Hilfe des Spektrophotometers nach den Angaben von M. Rockstein und P. N. Herron, Analyt. Chemistry 23 [1951], 1500.
Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemässe Verfahren, bei denen die Extrakte aus pflanzlichen Materialien kurzzeitg erwärmt und dann abgekühlt werden.
Beispiel 4 : Zur Herstellung eines Extraktes aus pflanzlichem Material, z. B. Gerstenputzkeime, werden 10 Gew. - Teile des pflanzlichen Materials in 100 Gew. - Teilen Wasser eingetragen. Danach wird2hbeiZimmerstemperaturgerührtunddannzentrifugiert. DerExtraktweistdanacheinenpH-Wert von 5 bis 6 auf und wird mit Natronlauge oder mit Essigsäure auf den gewünschten PH-Wert eingestellt. Anschliessend wird bei den zu untersuchenden Temperaturen und Zeitintervallen in einem Wasserbad erhitzt. Nach der Hitzebehandlung wird abgekühlt und der PH-Wert auf 8 eingestellt.
EMI3.2
mit 10 Raumteilen Natriumnucleinatlösung zig in bezug auf Nucleinsäure) und 12 Raumteilen 0, 1 m Tris-Puffer von PH 8,0 unter Zusatz von Toluol versetzt. In den zugehörigen Blindversuchen ersetzt man die Nucleinsäurelösung durch 10 Raumteile Wasser.
Die Dauer der enzymatischen Spaltung beträgt bei 370C zirka 20h. Die Ergebnisse sind in den Spalten 5 und 6 der nachstehenden Tabelle II aufgeführt.
Beispiel 6 : Die Bestimmung des Spaltungsverlaufs erfolgt wie nach Tabelle I angegeben.
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Tabelle II
EMI4.1
<tb>
<tb> Spalte <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> Bei- <SEP> Extraktions <SEP> - <SEP> Vorbehandlung <SEP> Nucleinsäure <SEP>
<tb> spiel <SEP> material <SEP> des <SEP> Extraktes <SEP>
<tb> Erwärmung <SEP> PH-Wert
<tb> Tempe-Dauer <SEP> Nuclein-PO-Ab- <SEP>
<tb> ratur <SEP> in <SEP> säure <SEP> spaltung
<tb> oc <SEP> Minuten <SEP> Spaltung <SEP> % <SEP> 0/0
<tb> 2 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> 55 <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> 81 <SEP> 2,0
<tb> 3 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 87 <SEP> 1,6
<tb> 4 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> 65 <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 92 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 5 <SEP> Weizenölkeime <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 78 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 6 <SEP> Weizenölkeime <SEP> 65 <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 84 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
In der nachstehenden Tabelle III sind Beispiele aufgeführt,
bei denen die Extrakte aus pflanzlichen Materialien in Gegenwart von Schwermetallsalzen sowie Erwärmung behandelt worden sind.
Beispiel 7 : a) Herstellung des Keimextraktes : lOGew.-Teile Gerstenputzkeime und 100 Raum- teile Wasser, zu Beginn desExtrahierens mit Natronlauge auf PH 8,0 eingestellt, werden 2 h bei Zimmertemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Der Extrakt wird mit Natronlauge oder mit Essigsäure auf den gewünschten PH-Wert eingestellt. Dann wird soviel einer Schwermetallösung hinzugefügt, dass die gewünschte Molarität erreicht wird. Die anschliessende Erhitzung erfolgt bei den zu untersuchenden Temperaturen und Zeitintervallen in einem Wasserbad. Nach der Hitzebehandlung wird abgekühlt und der pH-Wert des so vorbehandelten Extraktes wieder auf 8,0 eingestellt (vgl.
Spalten 1 - 6 der nachstehenden Tabelle 1lI).
EMI4.2
in bezug auf Nucleinsäure) und 3 Raumteilen 0,1 m Tris-Puffer von PH 8,0 unter Zusatz von Toluol versetzt. In den zugehörigen Blindversuchen ersetzt man die Nucleinsäurelösung durch 2 Raumteile Wasser. Die Dauer der enzymatischen Spaltung beträgt bei 370C zirka 20 h. Die Ergebnisse sind in den Spalten 7 und 8 der nachstehenden Tabelle III aufgeführt.
Die Bestimmung des Spaltungsverlaufes erfolgt wie nach Tabelle I angegeben.
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Tabelle III
EMI5.1
<tb>
<tb> Versuche <SEP> mit <SEP> verschiedenen <SEP> Salzen, <SEP> Salzkonzentrationen <SEP> und <SEP> pH-Werten <SEP> :
<tb> Spalte: <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8
<tb> Bei <SEP> Extraktions- <SEP> Vorbehandlung <SEP> des <SEP> Extraktes
<tb> Metallsalz <SEP> Erwärmung <SEP> pH-Wert <SEP> Nucleinsäure
<tb> Art <SEP> Konzen- <SEP> Tempe- <SEP> Dauer <SEP> Nucle- <SEP> P2O5-Abtration <SEP> ratur <SEP> in <SEP> insäure- <SEP> spaltung
<tb> mol <SEP> C <SEP> Minuten <SEP> Spaltung <SEP> 0/0 <SEP>
<tb> %
<tb> 7 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> CuCl2 <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 87 <SEP> 11
<tb> 8 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> CuCl2 <SEP> 0,
<SEP> 0002 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 91 <SEP> 4
<tb> 9 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> NiCl <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 15
<tb> 10 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> NiCl <SEP> 0,00025 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP> 18
<tb> 11 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> Nicol <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 6 <SEP> 100 <SEP> 15
<tb> 12 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> NiCl2 <SEP> 0,00025 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 6 <SEP> 100 <SEP> 16
<tb> 13 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> NiCl2 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 7 <SEP> 96 <SEP> 15
<tb> 14 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> NiCl2 <SEP> 0,00025 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 7 <SEP> 87 <SEP> 8
<tb> 15 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCI <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> 96 <SEP> 10
<tb> 16 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnC12 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> 92 <SEP> 3,
6
<tb> 17 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> Zinc12 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 6 <SEP> 85 <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 18 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl2 <SEP> 0,001 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 6 <SEP> 79 <SEP> 2,7
<tb> Versuche <SEP> in <SEP> Abhängigkeit <SEP> der <SEP> Temperatur <SEP> und <SEP> der <SEP> Zeit <SEP> : <SEP>
<tb> 19 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 55 <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 92 <SEP> 32
<tb> 20 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 55 <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 97 <SEP> 23
<tb> 21 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl2 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 55 <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> 87 <SEP> 16
<tb> 22 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl2 <SEP> 0,001 <SEP> 55 <SEP> 40 <SEP> 4 <SEP> 69 <SEP> 2
<tb>
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Tabelle III (Fortsetzung) :
EMI6.1
<tb>
<tb> Versuche <SEP> mit <SEP> verschiedenen <SEP> Salzen, <SEP> Salzkonzentrationen <SEP> und <SEP> PH-Werten <SEP> : <SEP>
<tb> Spalte <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8
<tb> Bei-Extraktions-Vorbehandlung <SEP> des <SEP> Extraktes
<tb> spiel <SEP> material <SEP> Metallsalz <SEP> Erwärmung <SEP> PH-Wert <SEP> Nucleinsäure
<tb> Art <SEP> Konzen-Tempe-Dauer <SEP> Nucle-PO-Ab- <SEP>
<tb> tration <SEP> ratur <SEP> in <SEP> insäure-spaltung
<tb> mol <SEP> C <SEP> Minuten <SEP> Spaltung <SEP> % <SEP>
<tb> %
<tb> 23 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCI <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> 85 <SEP> 0,5
<tb> 24 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> Zinc12 <SEP> 0,001 <SEP> 65 <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 80 <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> 25 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl2 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> 75 <SEP> 0,
<SEP> 3 <SEP>
<tb> 26 <SEP> Gerstenputzkeime <SEP> ZnCl2 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 65 <SEP> 40 <SEP> 4 <SEP> 59 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Beispiel 27 : a) Herstellung des Keimextraktes : 150 g Weizenölkeime werden in 1000cm' Wasser eingetragen und bei Raumtemperatur und bei einem pH-Wert von 7, 5 (durch Zugabe von Kalilauge eingestellt) 2 h gerührt. Danach wird die Mischung zentrifugiert.
Nach Einstellung des Extraktes auf einen pH-Wert von 5 durch Zugabe von Salzsäure wird eine Zinkchloridlösung zugefügt, so dass die
EMI6.2
molabgekühlt und der pH-Wert des erhaltenen Keimextraktes wieder auf PH 5 eingestellt. b) 25 cm3 des nach a) erhaltenen Weizenkeimextraktes werden mit 25 cm3 einer 2% gen Nucleinsäurelösung, die aus Fischspermen hergestellt ist und hauptsächlich Desoxyribonucleinsäure enthält, versetzt und der pH-Wert dieses Gemisches auf PH 7, 5 eingestellt. Dieser pH-Wert wird durch laufende Zugabe von verdünnter Kalilauge auf diesem Wert gehalten. Das Ende des Spaltungsverlaufs zeigt sich durch Bestehenbleiben des PH-Wertes an. Die durchschnittliche Dauer des Verlaufs beträgt bei 370C etwa 27 h.
Nucleinsäure-Spaltung 85%, PO -Abspaltung 6%.
Beispiel 28 : Es wird ein Keimextrakt verwendet, der entsprechend den Angaben unter (27a) hergestellt worden ist. Als Metallsalz wird ZnCI. in einer Konzentration von 0, 001 mol genommen, das auf den Gerstenputzkeimextrakt bei einer Temperatur von 650C und einem pH-Wert von 5 während 20 min zur Einwirkung gelangte.
40 cm3 des vorstehend genannten Gerstenputzkeimextraktes werden mit 10 cm3 einer 2, 5% eigen neutralisierten Desoxyribonucleinsäurelösung versetzt. Der Ansatz wird durch Zugabe von Natronlauge auf einen PH-Wert von 8 eingestellt. Nach einer Dauer von 24 h, während der PH-Wert auf 8 durch laufende Zugabe von verdünnter Natronlauge sowie die Inkubationstemperatur auf 370C gehalten werden, beträgt die Nucleinsäurespaltung 75% bei einer Phosphatabspaltung von 9, 6%.
Beispiel29 :50gvakuumgetrockneteKeimwurzelnderSaubohne(viciafaba)werdenfeinzermahlen und mit 50 cm3 Wasser bei PH 8 (NaOH) 5 h extrahiert. Dieser Extrakt wird durch Zugabe von Salzsäure auf PH 5 eingestellt und mit einer Cucul-Lösung versetzt, so dass die Schwermetallkonzentration in der Mischung 0,0002 Mol beträgt. Es wird 20 min auf 600C erwärmt. Nach Abkühlung wird der Extrakt durch Zugabe von Natronlauge wieder auf einen pH-Wert von 8 eingestellt.
Zu 50 cm3 dieses Extraktes werden 40 cm3 0,1 m Tris-(oxymethyl)-aminomethan - Puffer von PH 8 unter Zusatz von Chloroform und 10 cm3 einer 2, 51oigen Natriumnucleinatlösung gegeben und die Mischung auf 370C erwärmt. Nach 18 h beträgt die enzymatische Spaltung 92% der Nucleinsäure bei einer Phosphatabspaltung von 5, 5%.