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Verfahren zur Anreicherung von Purinnucleosid-5'-monophosphaten Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Anreicherung von Purinnucleosid-5'-monophosphaten
aus einem durch enzymatische Hydrolyse von Nucleinsäurenerhaltenen, 5'-Pyrimidinnucleotide
und 5'-Purinnucleotide enthaltenden Gemisch von 5'-Mononucleotiden.
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Unter der Bezeichnung »5'-Purinnucleotid« ist ein Nucleosid-5'-monophosphat
mit einem Purinkern im Molekül zu verstehen, z. B. 5'=Inosinsäure, 5'-Guanylsä.ure,
während unter »5'-Pyrimidinnucleotid« ein Nucleosid-5'-monophosphat mit einem Pyrimidinkern
rseinem Molekül zu verstehen ist, wie 5'-Cytidylsäure, 5 ,Uridylsäure.
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5'-Mononucleotide werden großtechnisch hergestellt; weil sie auf Grund
ihrer guten Geschmacks- und Arömawirkung sowie ihrer Ungiftigkeit ausgezeichnete
chemische Würzstoffe darstellen. Als Ergebnis von Geschmacksanalysen hat sich gezeigt,
daß' diese Wirkung der 5'-Mononucleotide auf die 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure
zurückzuführen ist, die zu den 5'-Pürinnucleotiden gehören, während die 5'-Cytidylsäure,
5'-Uridylsäure usw., die zu den 5'-Pyrimidinütcleotiden gehören, als solche keine
Geschmacks-,Wirkung, aufweisen, allerdings die Geschmacks- bzw. Aromawirkung von
5'-Purinnucleotiden verstärken, ,Wenn 'eine geringe Menge der ersteren den letzteren
zugemischt wird.
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Als ' brauchbare Methode zur Abtrennung der einzelnen 5'-Mononucleotide
aus 5'-Mononucleotdgeinischen wurde die Kolonnenchromatographie mit Iönenaustauschharzen,
z: B. mit einem stark basischen Harz oder einem stark sauren Harz angewendet. Hierbei
wurde beispielsweise wie folgt gearbeitet: Die 5f-I,ucleotide werden einmal am Harz
adsorbiert und mit-,einem Lösungsmittel eluiert. Zur Gewinnung der Fraktion, die
die einzelnen 5'-Nucleotide enthält, werden Art und Gehalt der 5'-Nucleotide in
jedem Eluat ermittelt. -`' Es ist zwar möglich, ein Gemisch von 5'-Mononücleotiden
nach diesem Verfahren in die einzelnen t5''#Mönönueleotide zu fraktionieren; jedoch
ist es sehr @ch-wierig, dieses Verfahren in den großtechnischen Maßstab zu übertragen,
weil es große Mengen an Harz und Lösungsmittel für die Elution und einen großen
Zeitaufwand erfordert, um die am Harz adsorbierten 5'-Mononucleotide vollständig
zu eluieren. Bei diesem Verfahren ist wenigstens die 10- bis 100fache Harzmenge,
bezogen auf die zu behandelnden 5-'Mononucleotide; erforderlich; selbst wenn also
nur 100 kg 5'-Mononucleotide der Behandlung nach diesem Verfahren unterworfen werden,
wird eine Reihe von Türiren oder ein Riesenturm mit einer Füllung von wenigstens
1 bis 10 t Harz gebraucht. Außerdem wird für die Adsorption und Elution der 5'-Mononueleotide
beim Betrieb in diesem Maßstab etwa 1 Woche benötigt. Aus diesen Gründen war es
bisher schwierig, 5'-Mononucleotide wirtschaftlich herzustellen.
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Das Problem der Trennung von verschiedenen Nucleotidsalzen ist dabei
auch schon in einem anderen Zusammenhang bearbeitet worden. In der USA-Patentschrift.-2
549 827 wird ein Verfahren zur Trennung von Alkalinueleotidsalzen, die ihrerseits
schwer trennbar sind; beschrieben, das darin besteht, daß man sie in entsprechende
Schwermetallsalze, insbesondere Kupfersalze, umwandelt; die dann veränderte, und
unterschiedliche Löslichkeitsverhältnisse zeigen.
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Abgesehen von der Kostspieligkeit eines solchen Verfahrens ist für
den erfindungsgemäßen Zweck ein solcher Vorschlag unbrauchbar: Erfindungsgemäß sollen
ja Würz- und Aromastoffe hergestellt werden, d. h. Produkte, die für den menschlichen
Verzehr gedacht sind. Die physiologischen Nebenwirkungen von Schwermetallen verbieten
eine Anwendung dieses Verfahrens aus dem Stand der Technik auf die erfindungsgemäße
Problemstellung.
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Es wurde gefunden, daß es zur Herstellung von, Würzstoffen nicht erforderlich
ist, Gemische von 5'-Mononucleotiden vollständig durch Fraktionierung in die
einzelnen
5'-Mononucleotide zu zerlegen, wie es bisher geschehen ist. Es ist vielmehr nur
erforderlich, die 5'-Purinnucleotide mit guter Geschmackswirkung aus den 5'-Mononucleotidgemischen
abzutrennen. Außerdem müssen die 5'-Purinnucleotide nicht unbedingt bis zur vollständigen
Entfernung der Pyrimidinnucleotide gereinigt werden.
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Es wurde ferner die überraschende Tatsache festgestellt, daß ein deutlicher
Unterschied zwischen der Löslichkeit von . Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden
und der Löslichkeit von Dinatriumsalzen von 5'-Pyrimidinnucleotiden in einem Gemisch
aus Wasser und Methanol, Äthanol oder Aceton besteht. Es ist interessant, daß die
Dinatriumsalze sowohl von 5'-Purinnucleotiden als auch von 5'-Pyrimidinnuleotiden
in Wasser sehr leicht löslich und in den genannten organischen Lösungsmitteln unlöslich
sind, jedoch in einem Gemisch, .das aus Wasser und einem der genannten organischen
Lösungsmittel in einem gewissen Verhältnis besteht, ein völlig verschiedenes Verhalten
zeigen: Das Verfahren geiüäß der Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnis
entwickelt.
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Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Anreicherung
von Purinnucleosid-5'-monophosphaten aus einem. durch enzymatische Hydrolyse von
Nucleinsäüren erhaltenen, Purin- und Pyrimidinnucleosid-5'-monophosphate enthaltenden
Gemisch von Nucleosid-5'-monophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß -man a) entweder
1 Gewichtsteil der Dinatriumsalze des Nucleosid-5'-monophosphatgemisches in einem
Lösungsmittelgemisch, das die 4- bis 10fache Volumenmenge Wasser - bezogen auf Nucleosid-5'-monophosphatsalze
- im Gemisch mit Methanol, Äthanol oder - Aceton im Volumenverhältnis von etwa 2:
1 bis 1 : 2 enthält, unter Erwärmen auflöst und die Mischung abkühlen läßt oder
b) eine Lösung von 1 Gewichtsteil der Dinatriumsalze des Nücleösid-5'-mönöphösphatgemisches
in 4 bis 10 Volumteilen Wasser mit Methanol, Äthanol oder Aceton versetzt, bis das
Volumenverhältnis von Wasser zu den genannten organischen Lösungsmitteln etwa. 2:
1 bis 1 : 2 beträgt; und anschließend das abgeschiedene, zum überwiegenden Teil
aus Dinätriumsälzen von PuririnucleO'sid-5'-möüöphosphaten bestehende Nucleosid-5'-mönopfiosphätgeinisch
isoliert.
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Die gewünschten 5'-Purinmononucleotide können damit im großtechnischen
Maßstab erhalten werden, wobei die beim bekannten, mit lonenaustauschharzen arbeitenden
Verfahren notwendige .Harzmenge verringert und die dabei erforderliche lange Zeit
verkürzt wird, und zwar auch dann, wenn das. 5'-Mononucleotidgemisch in- die Einzelkomponenten_zerlegt
werden soll.
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Die. bei dem Verfahren der Erfindung. einzusetzenden Gemische von
5'-Mononucleotiden können in nicht beanspruchter Weise hergestellt werden durch
Hydrolyse von Nucleinsäuren oder ihren Teilhydrolysaten mit einem Enzymsystem, das
bei einer sehr großen Zahl von Mikroorganismen zu finden ist, z. B. Streptomyces
griseus; Streptomyces fiavus, StreptQ-myces aureus, Streptomyces lavendurae, Fusarium
roseum, Helminthosporium sigmoideum, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Anixiella
reticulispora, Aspergillus elegans, :Aspergillus flavipes,. Botryospbaeria ribis
chromogena, Chaetomidium japonicum, Glomerella cingulata, Neurospqra crassa, Neurospora
sitophila, Ophiobolus miyabeanus, Ophiostoma ulmi, Sordaria fimicola, Tilachlidium
humicolo.
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Das Enzymsystem kann in Form des lebenden Mikroorganisinus..oder als
extrahierte Enzymlösung oder hell-. oder_Mycelsuspgusion od. dgl. verwende werden.
Der Mikroorganismus kann auf einem Medium, das Hefeextrakt sowie andere Nährstoffe
enthält, bebrütet werden, oder das Kulturfiltrat des Mikroorganismus wird mit dem
Hefeextrakt zusammengeführt, oder eine Zell- oder Mycelsuspension des Mikroorganismus
wird mit den Nucleinsäuren oder ihren Teilhydrolysaten zusammengeführt. In allen
Fällen erfolgt die Bebrütung des Mikroorganismus 2 bis 5 Tage bei etwa 20 bis 40°C.
Zuweilen ist das Enzymsystem mit Phosphormonoesterase verunreinigt, die die 5'-Mononucleotide
zu den entsprechenden Nucleosiden zu hydrolysieren vermag,, die als Würzstoffe wertlos
sind. In solchen Fällen kann ein Inhibitor für Phosphormonoesterase; .z. B. ein
Phosphat, Fluorid, Arsenat usw., dem Reaktionssystem zugesetzt werden, oder das
Enzymsystem kann. einer Wärmebehandlung unterworfen werden, durch die die Phosphormonoesterase
deaktiviert wird.
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Das auf diese Weise erhaltene 5'-Mononucleotidgemisch enthält 5'-Inosinsäure,
5'-Guanylsäure, 5'-Uridylsäure und 5'-Cytidylsäure in ungefähr gleichen Mengen.
Natürliche Nucleinsäuren enthalten keine 5'-Inosinsäure, jedoch 5'-Adenylsäure als
Komponente. Gleichzeitig mit der Hydrolyse der Nucleinsäure zu 5'-Mononucleotiden
wird jedoch die 5'-Adenylsäure in den natürlichen Nucleinsäuren durch Deaminierung,
die durch die Wirkung von sogenannter Adenylsäuredeaminase im gebrachten Enzymsystem
verursacht wird, in 5'-Inosinsäure umgewandelt. Wenn Adenylsäuredeaminase im verwendeten
Enzymsystem abwesend ist, kann 5'-Adenylsäure an Stelle von 5'-Inosinsäure im Hydrolysat
angereichert werden. Da jedoch nicht die 5'-Adenylsäure, sondern die 5'-Inosinsäure
der Geschmacksträger ist, wird die angereicherte 5'-Adenylsäure in nicht beanspruchter
Weise nach oder vor der Abtrennung beispielsweise durch Diazotierung mit einem Nitrat
und anschließende Hydrolyse. der Diazoniumsalze deaminiert, Wenn die Deaminierüng
durch Diazotierung vorgenommen wird, erfolgt auch die Deaminierung von 5'-Guanylsäure
zu 5'-Xanthylsäure, die in natürlicher Nucleinsäure nie ,gefunden wurde. 5'-Xanthylsäure
bewirkt jedoch ebenfalls einen sehr- guten Geschmack und. kann als Würze zur Verbesserung
oder Entwicklung des Geschmacks bzw. Aromas von Nahrungs- und Genußmitteln sowie
Getränken verwendet werden.
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Im Gemisch der 5'-Mononucleotide sind somit 5'-Purinnucleotide enthalten,
die aus 5'-Inosinsäure (bzw. 5'-Adenylsäure) und 5'-Guanylsäure (bzw. 5'-Xanthylsäure)
sowie 5'-Pyrimidinnucleotiden,, wie 5'-Cytidylsäure, 5'-Uridylsäure, bestehen. Das
durch Hydrolyse von Nucleinsäure oder Teilhydrolysaten erhaltene Gemisch von 5'-Mononucleotiden
kann der Kolonnenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschharzen oder
Aktivkohle oder der Elektrodialyse unter Verwendung von Ionenaustauschmembranen
unterworfen werden, um Verunreinigungen in gewissem Umfange oder ganz zu entfernen.
Die gereinigte _wäßrige. Lösung wird, falls zu verdünnt, so eingeengt, daß die Konzentration
an 5'-Mononucleotiden auf das 4- bis 10fache erhöht wird, und mit Natriumhydroxyd
neutralisiert, wobei die 5'-Mononucleotide
die entsprechenden Dinatriumsalze
bilden. Die so erhaltene Ausgangslösung kann nach einer der erfindungsgemäßen Arbeitsweisen
wie oben angegeben aufgearbeitet werden.
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Nachstehend sind mehrere Ergebnisse von typischen Versuchen zusammengestellt.
In den Vei suchen wurden jeweils 50 cm3 Dinatriumsalzlösung der 5'-Mononucleotide
verwendet. Hergestellt war die Lösung durch Hydrolyse von Hefe-Ribonucleinsäure
mit dem Enzymsystem von Streptomyces aureus. In 50 cm3 der Lösung waren 1,72 g Dinatrium-5'-inosinat,
1,40 g Dinatrium-5'-guanylat, 1,30 g Dinatrium-5'-uridylat und 1,72 g Dinatrium-5'-cytidylat
enthalten. Das organische Lösungsmittel wurde der wäßrigen Lösung bei 25°C bis zur
genannten Konzentration zugegeben; worauf ein Gemisch von Kristallen ausgefällt
wurde. Die Kristalle wurden abfiltriert und analysiert, wobei die nachstehend aufgeführten
Werte erhalten wurden.
| Konzentration Menge der aus der Lösung auskristallisierten
Dinatriumsalze von 5'-Mononucleotiden |
| Organisches des organischen Dinatrium- Dinatrium- Dinatrium-
Dinatrium- |
| Lösungsmittel Lösungsmittels 5'-inosinat 5'-guanylat 5'-uridylat
5'-cytidylat |
| Volumprozent g g g g |
| - 0 0,00 0,00 0,00 0,00 |
| 30 0,21 0,15 0,00 0,00 |
| Methanol ....... 40 0,80 0,75 0,00 0,00 |
| 50 1,33 1,21 0,21 0,34 |
| 66 1,63 1,31 0,63 0,75 |
| 30 0,92 0,88 0,00 0,05 |
| Äthanol . . . . . . . . 40 1,35 1,27 0,26 0,24 |
| 50 1,43 1,32 0,36 0,32 |
| 66 1,65 1,32 0,85 0,92 |
| 30 0,73 0,69 0,07 0,08 |
| Aceton . . . . . . . . . 40 1,12 1,11 0,18 0,33 |
| 50 1,20 1,30 0,41 0,45 |
| 66 1,59 1,35 0,68 0,54 |
,Die Tabellenwerte lassen erkennen, daß es möglich ist, Kristalle von 5'-Purinnucleotiden
durch eine einfache Behandlung abzutrennen, ohne daß 5'-Pyrixnidinnucleotide mitkristallisiert
werden. Es ist jedoch nicht ratsam, reine 5'-Purinnücleotide durch eine einmalige
einfache Behandlung abzutrennen, da hierbei eine erhebliche Menge der 5'-Purinnucleotide
zwangläufig ii., der Mutterlauge zurückbleibt. In der Praxis können im Rahmen obiger
Grenzen ziemlich hohe Mengen an organischen Lösungsmitteln verwendet werden. Diese
Mengen sind nachstehend aufgeführt:
| Praktisch brauchbare Vorteilhafteste |
| Organisches Konzentration Konzentration |
| Lösungsmittel des organischen des organischen |
| Lösungsmittels Lösungsmittels |
| Volumprozent Volumprozent |
| Methanol .... 30 bis 65 etwa 50 |
| Äthanol ..... 30 bis 50 etwa 40 |
| Aceton ...... 30 bis 50 etwa 40 |
Zur Entfernung einer geringen Menge an 5'-Pyrimidinnucleotiden, mit der die erhaltenen
Kristalle verunreinigt sind, kann der gleiche Prozeß wiederholt werden.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung kann wie folgt modifiziert werden:
Ein Gemisch der Dinatriumsalze von 5'-Mononucleotiden wird in einem Gemisch, das
die 4- bis 10fache Menge Wasser und daneben Methanol, Äthanol oder Aceton enthält,
unter Erwärmen gelöst. Das Verhältnis von organischem Lösungsmittel zu Wasser ist
das gleiche wie das Endverhältnis des Lösungsmittelsystems bei der vorstehenden
Arbeitsweise der fraktionierten Fällung. Die heiße Lösung wird dann - gegebenenfalls
unter Rühren - gekühlt, wobei die Kristalle der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden
sich niederschlagen. In den Teilen b) der folgenden Beispiele 1, 2 und 4 und in
den Beispielen 3 und 5 bis 7 werden bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens
gemäß der Erfindung beschrieben. Die Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert, und
die Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.
Beispiel 1 a) Wie in dem Beispie12 der deutschen Auslegeschrift 1130 785
beschrieben, wurde Hefe durch Einwirkung einer Enzymlösung hydrolysiert, die durch
Züchten von Streptomyces aureus (K r a i n s k y emend. W a k s m a n et a1.) Waksman
et a1. erhalten worden war. Hierbei wurde eine Mischung von 5'-Mononucleotiden im
Reaktionsgemisch gebildet. Unter Verwendung eines Filtermittels wurden 35 000 Volumteile
der die 5'-Mononucleotide enthaltenden Mischung filtriert. Nach Einstellung .auf
pH 1,5 ließ man das Filtrat durch eine mit 500 Gewichtsteilen Aktivkohle gefüllte
Kolonne laufen. Die Aktivkohle, die die 5'-Mononucleotide adsorbierte, wurde mit
Wasser. gewaschen und dann mit 20000 Voluinteilen eines 20 °/o Methanol enthaltenden
ammoniakalischen Methanol-Wasser-Gemisches eluiert.
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Das Eluat wurde auf 10000 Volumteile eingeengt. Die konzentrierte
Lösung ließ man durch eine Kolonne fließen, die mit 6000 Volumteilen stark basisches
quaternäres Ammonium-Anionaustauschharz gefüllt war. Die 5'-Mononucleotide wurden
am Harz adsorbiert. Das Harz wurde dann mit 0,2°/oiger Salzsäure eluiert. Um die
Salzsäure aus dem Eluat zu entfernen; wurde es durch eine Kolonne geschickt, die
mit 200 Gewichtsteilen Aktivkohle gefüllt war. Die Aktivkohle adsorbierte die 5'-Mononucleotide.
Sie wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 10000 Volumteilen Ammoniäkwasser eluiert,
das 200/0 Methanol enthielt. Das erhaltene Eluat enthielt 5'-Purinnucleotide
und
5'-Pyrimidinnucleotide. Die Lösung wurde mit Natronlauge versetzt. Hierdurch wurden
die 5'-Mononucleotide in die entsprechenden Dinatriumsalze umgewandelt. Die -Mischung
wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und zwar auf 500 Volumteile; die je etwa
50 Gewichtsteile 5'-Purinnucleotide und:5'-Pyrimidinnucleotide enthielten.
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b) Dem so erhaltenen Konzentrat wurde das gleiche Volumen Methanol
zugesetzt. Die Mischung wurde erwärmt, um die darin gefällten Substanzen zu lösen.
Die Lösung wurde unter leichtem Rühren 24 Stunden in einen kühlen Raum gestellt,
wobei sich weiße Kristalle abschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert und bei
50'C unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden 59,3 Gewichtsteile Produkt
erhalten.
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Auf Grund der quantitativen Analyse, die durch Elektrophorese bei
hoher Spannung und auf enzymatischem Wege durchgeführt wurde, bestand das Gemisch
aus 46,0 Gewichtsteilen der Dinatriumsalze von 5'=Purinnucleotiden und 1,5 Gewichtsteilen
der Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden.
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Beispiel 2 a) In der gleichen Weise wie im Beispiel l wurde Ribonucleinsäure-Hefeextrakt
mit einem Enzymsystem behandelt, das durch Streptomyces aureus (K r a i n s k y
emend. W a k s m a n et a1.) Waksman et a1. gebildet worden war, wobei ein Gemisch
von 5'-Mononucleotiden gebildet wurde. Das Gemisch wurde teilweise gereinigt, wobei
eine Lösung erhalten wurde, die 5'-Purinnucleotide und 5'-Pyrimidinnucleotide enthielt.
Die Lösung wurde mit Natronlauge neutralisiert, wodurch die 5'-Mononucleotide in
die entsprechenden Dinatriumsalze umgewandelt wurden, und dann auf 400 Volumteile
eingeengt, die die Dinatriumsalze von 5'-Pudnnucleotiden und 5'-Pyrimidinnucleotiden
in Mengen von je etwa 50 Gewichtsteilen enthielten.
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b) Dem Konzentrat wurden 400 Volumteile Methanol zugegeben. Die Mischung
wurde erwärmt, um die ausgefällten Kristalle zu lösen, worauf sie langsam abkühlen
gelassen wurden. Nach einer Kühlzeit von 24 Stunden wurde die Mischung filtriert,
wobei die ausgefällten weißen Kristalle abgetrennt wurden. Die Kristalle wurden
bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden 71,8 Gewichtsteile Produkt
erhalten.
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Das Produkt enthielt laut quantitativer Analyse 47,5 Gewichtsteile
Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und 10,0 Gewichtsteile Dinatriumsalze von
5'-Pyridinnucleotiden.
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Beispiel 3 Zu 500 Volumteilen einer wäßrigen Lösung, die je 50 Gewichtsteile
der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielt,
wurden 500 Volumteile Methanol gegeben. Die Mischung wurde erwärmt, um die kristallisierten
Substanzen zu lösen. Nach Abkühlen wurden 500 Volumteile Methanol langsam zugesetzt.
Die Mischung wurde filtriert, um die ausgeschiedenen farblosen Kristalle abzutrennen,
die aus 48,0 Gewichtsteilen Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden und 25,0 Gewichtsteilen
Dinutriumsalzen von 5'-Pyrimidinnucleotiden bestanden.
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Beispiel 4 Durch eine Kolonne, die mit 4250 Volumteilen eines porösen,
stark basischen quaternären Ammonium-Anionen-Austauschharzes gefüllt war, wurden
100000 Volumteile eines Ribonucleiusäurehydrolysats fließen gelassen, das 56,6 Gewichtsteile
5'-Inosinsäure, 49,0 Gewichtsteile 5'-Guanylsäure, 57,3 Gewichtsteile 5'-Uridylsäure
und 45,3 Gewichtsteile 5'-Cytidylsäure enthielt. Hierbei wurden die 5'-Mononucleotide
am Harz adsorbiert. Das Harz wurde dann mit 0,2 n-Salzsäure eluiert. Das Eluat wurde
mit 850 Gewichtsteilen Aktivkohle in Berührung gebracht, die anschließend mit einer
1,5°/oigen wäßrigen Ammoniaklösung eluiert wurde, wobei eine gereinigte wäßrige
Lösung von 5'-Mononucleotiden erhalten wurde. Zur Lösung wurde eine 10 n-Natronlauge
gegeben, wodurch die 5'-Mononucleotide in die entsprechenden Dinatriumsalze umgewandelt
wurden. Die Lösung wurde auf 660 Volumteile eingeengt. Das Konzentrat enthielt 45,1
Gewichtsteile Dinatrium-5'-inosinat, 38,2 Gewichtsteile Dinatrium-5'-guanylat, 45,1
Gewichtsteile Dinatrium-5'-uridylat und 36,5 Gewichtsteile Dinatrium-5'-cytidylat.
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b) Zur konzentrierten Lösung wurden 660 Volumteile Methanol gegeben,
wodurch Kristalle ausgeschieden wurden, die laut Analyse durch Elektrophorese bei
hoher Spannung und auf enzymatischem Wege aus 36,0 Teilen Dinatrium-5'-inosinat,
33,2 Teilen Dinatrium-5'-guanylat, 6,4 Teilen Dinatrium-5'-uridylat und 7,3 Teilen
Dinatrium-5'-cytidylat bestanden.
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Das Kristallgemisch wurde in 350 Volumteilen Wasser gelöst. Zur Lösung
wurden 350 Volumteile Methanol gegeben, wobei Kristalle ausgeschieden wurden, die
aus 25,3 Gewichtsteilen Dinatrium-5'-inosinat und 23,9 Gewichtsteilen Dinatrium-5'-guanylat
bestanden. Beispiel s Zu 50 Volumteilen einer durch Hydrolyse von Nucleinsäuren
gewonnenen wäßrigen Lösung, die 3,10 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden
und 3,00 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielten, wurden
50 Volumteile Methanol gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 25°C stehengelassen,
wobei sich Kristalle abschieden, Diese wurden abfiltriert und getrocknet, wobei
2,75 Gewichtsteile Mischkristalle erhalten wurden, die laut Analyse aus 2,06 Gewichtsteilen
der Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden, einer kaum feststellbaren Menge der
Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden und etwa 0,6 Gewichtsteilen Wasser bestanden.
Die Ausbeute an Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden betrug 66,60/,.
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Beispiel 6 Zu 50 Volumteilen einer durch Hydrolyse von Nucleinsäuren
gewonnenen wäßrigen Lösung, die 3,10 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden
und 3,00 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielten, wurden
33 Volumteile Äthanol gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 25°C stehengelassen,
wobei sich Kristalle abschieden. Diese wurden durch Filtration abgetrennt und unter
vermindertem Druck getrocknet, wobei 2,45 Gewichtsteile Mischkristalle erhalten
wurden, die laut Analyse durch Elektrophorese aus 2,02 Gewichtsteilen der Dinatriumsalze
von 5'-Purinnucleotiden, einer kaum feststellbaren Menge der Dinatriumsalze von
5'-Pyrimidinnucleotiden und etwa 0,4 Gewichtsteilen
Wasser bestanden.
Die Ausbeute an Dinatriumsalzen von 5'-Purinnucleotiden betrug 65,5°/o. Beispiel
? Zu 50 Volumteilen einer durch Hydrolyse von Nucleinsäuren gewonnenen wäßrigen
Lösung, die 3,10 Gewichtsteile Dinatriumsalze von 5'-Purinnucleotiden und 3,00 Gewichtsteile
Dinatriumsalze von 5'-Pyrimidinnucleotiden enthielt, wurden 30 Volumteile Aceton
gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 25°C stehengelassen, wobei sich Kristalle
abschieden. Diese wurden durch Filtration abgetrennt und unter vermindertem Druck
getrocknet, wobei 1,65 Gewichtsteile eines kristallinen Pulvers erhalten wurden,
das laut Analyse durch Elektrophorese zu 1,36 Gewichtsteilen aus den Dinatriumsalzen
von 5'-Purinnucleotiden, einer kaum feststellbaren Menge der Dinatriumsalze von
5'-Pyrimidinnucleotiden und zu etwa 0,25 Gewichtsteilen aus Wasser bestand. Die
Ausbeute an 5'-Purinnucleotidsalzen betrug 44,0 °/o.