DE2360110C2

DE2360110C2 - Verfahren zur Gewinnung von 3',5'zyklischer Adenylsäure oder 3',5'-zyklischer Desoxiadenylsäure

Info

Publication number: DE2360110C2
Application number: DE2360110A
Authority: DE
Inventors: Jiro Noda Ishiyama; Motohiko Kato; Nobuyuki Noda Yamaji; Tamotsu Nagareyma Yokotsuka; Fumihiko Matsudo Yoshida
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1972-12-07
Filing date: 1973-12-03
Publication date: 1983-11-24
Also published as: GB1453063A; JPS4980095A; JPS5217040B2; FR2209759A1; DE2360110A1; US3941770A; FR2209759B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von 3',5'-zyklischer Adenylsäure odervon3',5'-zyklischer Desoxyadenylsäure aus einer durch Kultivieren eines 3',5'-zyklischer Adenylsäure oder 3',5'-zyklische Desoxyadenylsäure produzierenden Mikroorganismus in einer Nährmedium enthaltenden Lösung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels gemäß den im Patentanspruch 1 genannten Maßnahmen. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieser Maßnahmen.

3'-5'-zyklischer Adenylsäure (nachstehend als CAMP bezeichnet) ist eine Vorstufe von ADP und stellt eine wertvolle Substanz dar. Ebenso ist 3',5'-zyklische Desoxyadenylsäure (nachstehend als De-CAMP bezeichnet) ein wertvolles biochemisches Reagenz. Es besteht deshalb ein Bedürfnis, diese Verbindungen in hoher Reinheit zu gewinnen.

CAMP wird durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der zur Produktion von CAMP fähig ist, in einem Medium, d'is normale Nährmittelquellen enthält, oder in einem Medium erzeugt, das durch Zufügung von Nukleobasen, Nukleosiden, Nukleotiden und dergleichen zu einem normalen Medium (z. B. US-PS 36 30 842) hergestellt ist.

Das Verfahren gemäß US-PS 36 30 842 ist jedoch sehr aufwendig und man benötigt chromatografische Verfahren und weitere Stufen, um die Produkte in reiner Form zu gewinnen. Besonders schwierig ist die Gewinnung von CAMP und von DeCAMP aus Nährmedium enthaltenden Lösungen, in denen sie durch Mikroorganismen gebildet wurden.

Es ist ein Verfahren zur Gewinnung von CAMP¹ und DeCAMP durch Einstellung des pH-Wertes einer CAMP- oder DeCAMP-haltigen Lösung auf 1 bis 2. Zugabe eines organischen Lösungsmittels, worin CAMP oder DeCAMP unlöslich sind, wie einem Alkohol, Aceton und dergleichen, zur Abtrennung von CAMP oder DeCAMP aus der Lösung bekannt, wobei jedoch die Reinheit der erhaltenen CAMP oder DeCAMP äußerst gering ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, CAMP oder De-CAMP aus Nährmedien enthaltenden Lösungen, in denen sie durch Mikroorganismen produziert wurden, in hoher Reinheit und Ausbeuten zu gewinnen.

κι Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.

Da die Löslichkeit von DeCAMP, wenn verschiedene Arten an wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln hinzugegeben werden, in einer wäßrigen ιοί 5 sung, die DeCAMP enthält, die gleiche wie jene von CAMP ist, werden die Details des erfindungsgemäßen Verfahrens im nachstehenden insbesondere unter Verwendung von CAMP als ein anschauliches Beispiel angegeben.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Einstellung des pH-Wertes einer wäßrigen Lösung, die CAMP oder DeCAMP sowie Verunreinigungen enthält, auf einem Wert von 5 oder mehr, vorzugsweise ο bis 12, vor oder nach Zusatz eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels erforderlich. In dem pH-Bereich unter 5 kann das Ziel der Erfindung nicht erreicht werden, da CAMP oder DeCAMP in Wasser kaum löslich sind.
Geeignete Reagenzien zur Einstellung des pH-Wertes sind: Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumbicarbonat, Bariumhydroxid, Kalciumhydroxid, Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure. Zusätzlich können niedrige organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure oder Zitronensäure angewandt werden.

Die Temperatur beträgt zur Zeit der Zugabe der wasserlöslichen Lösungsmittel normalerweise 0 bis 30° C, wobei jedoch die niedrigeren Temperaturen bevorzugt sind, da eine Einsparung an Lösungsmitteln erzielt werden kann.

Zur Gewinnung von CAMP oder DeCAMP aus der Lösung in Kristallform wird der pH der Lösung auf 3 oder weniger eingestellt und die Lösung dann bei 0 bis 25° C während 6 bis 25 Stunden stehen gelassen. Selbst wenn noch äußerst geringe Mengen an Nukleosiden oder Nukleobasen enthalten sind, scheiden sich diese Substanzen nicht zusammen mit CAMP oder DeCAMP wegen deren Eigenschaften

so aus (sie sind basisch oder amphoter). Daher können CAMP oder DeCAMP mit äußerst hoher Reinheit erhalten werden.

Beispiel 1

Eine CAMP-enthaltende Kulturbrühe, die durch Kultivierung eines CAMP-erzeugenden Mikroorganismus, Mikrobakterium ATCC 21376, in einem aus 5% Glukose, 0,5% Harnstoff, 0,5% Ammoniumsulfat, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 1% MgSO₄-7H₂O und 0,5% 5'-Inosinsäure bestehenden Medium vom pH-Wert 7,5 (eingestellt mit 3n-KOH) bei 30° C während 40 Stunden unter Schüttlung erzeugt war, wurde auf pH 9,5 eingestellt und die gebildeten anorganischen Nieder-

('5 schlage (Magnesiumphosphat und dergleichen) wurden durch Zentrifugieren unter Erhalt der wäßrigen Lösung entfernt, die 12mgCAMP/ml, I,3mg5'-Inosinsäure/ml, 1,4 mg Inosin/ml, 1,1mg Hypoxan-

thin/ml, gefärbte Substanz (E₄₀₀ = 0,74) und 2,3 mg Proteine/ml enthielt.

Nachfolgend wurden zu jeweils 50 ml der wäßrigen Lösung 250 ml (5faches Volumen) verschiedener Arten von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln hinzugegeben. Die jeweils resultierenden Gemische wurden bei 20° C für 16 Stunden gehalten und sodann die gebildeten Sedimente (ölige Materialien) durch Filtration unter Erhalt der CAMP-haltigen Lösungen entfernt.

Tabelle 1

10 Jeweils 60 ml der CAMP-haltigen Lösungen wurden herausgenommen und unter verringertem Druck jeweils zur Entfernung der organischen Lösungsmittel konzentriert. Die Gehalte an CAMP, 5'-Inosinsäure, Inosin, Hypoxanthin, gefärbten Substanzen und Proteinen wurden in gleicher Weise, wie es im Versuchsbeispiel 2 beschrieben ist, unter Verwendung von jeweils 10 ml der somit konzentrierten Lösungen bestimmt. Die erhaltenden Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

wasserlösliches organisches	CAMP (mg/ml)	5'-Inosinsäure	Inosin (mg/ml)	Hypoxanthin	gefärbte	Proteine	Spur
Lösungsmittel		(mg/ml)		(mg/ml)	Substanzen (E₄₀₀) (mg/ml)	Spur
Äthylalkohol	12	Spur	0,6	0,4	0,42	Spur
n-Propylalkoho!	12	Spur	0,7	0,5	0,28	Spur
Isopropylalkohol	12	Spur	0,7	0,5	0,35	Spur
tert-Butylalkohol	12	Spur	0,6	0,4	0,30	Spur
Aceton	12	Spur	0,5	0,3	0,21
Dioxan	12	Spur	0,6	0,4	0,42

Jede CAMP enthaltende Lösung, aus der wie vorstehend erwähnt, Sedimente entfernt worden waren, wurde auf pH 1,5 und 5 η wäßriger HCL-Lösung eingestellt. Die resultierenden Lösungen wurden bei 5° C während 40 Stunden zur Kristallisation der CAMP-Kristalle gehalten. Die gebildeten Kristalle wurden gesammelt und in vakuo getrocknet. Deren Ausbeuten und Reinheiten wurden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Die Reinheit der CAMP-Kristalle wurde durch Bestimmung der Absorption bei 260 μχη unter Verwendung des Spektrophotometers ermittelt [v. g. Journal of the American Chemical Society 83, 698 (1961)].

Tabelle 2

40

45

Zum Vergleich wurde die CAMP-haltige Lösung auf pH 1,5 mit 5n wäßriger HCL-Lösung eingestellt und sodann das 5fache Volumen der in Tabelle 2 angeführten wasserlöslichen organischen Lösungsmittel zur Ausfällung von CAMP hinzugefügt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

wasserlösliches organisches	Ausbeute an	Reinheit
Lösungsmittel	kristallinem	(%)
	CAMP (%)
Äthylalkohol	70	99
n-Propylaikohol	76	98
Isopropylalkohol	80	98
tert-Butylalkohol	80	97
Aceton	80	97
Dioxan	74	98

Beispiel 2

Eine CAMP-haltige Kulturbrühe, die durch Kultivierung eines CAMP-erzeugenden Mikroorganismus, Mikrobakterium ATCC 21376, in dem gleichen Medium, das in Beispiel 1 verwendet wurde, bei 28° C während 50 Stunden unter Schüttelung erzeugt worden war, wurde mit Aktivkohle zur Adsorption von CAMP hieran behandelt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte CAMP mit 50%iger Äthylalkohollösung, die 1,4% NH₄OH enthielt, eluiert und das Eluat wurde unter verringertem Druck unter Erhalt einer wäßrigen Lösung konzentriert, die 100,5 mg CAMP/ml, 28 mg Inosinsäure/ml, 25 mg Hypoxanthin/ml, 21mg Inosin/ml und gefärbte Substanz (E₄₀₀ = 8,40) enthielt.

Zu 50 ml dieser Lösung (pH 7,5) wurden 150 ml Äthylalkohol (3faches Volumen) hinzugegeben und die resultierende Lösung bei 20° C während 20 Stunden zur Bildung von Niederschlägen gehalten. Die gebildeten Niederschläge wurden durch Zentrifugieren unter Erhalt einer CAMP-haltigen Lösung entfernt.

60 ml dieser Lösung wurden herangezogen u id unter verringerten Druck zur Entfernung von Amylalkohol konzentriert. Die Gehalte an CAMP, 5'-Inosinsäure, Inosin, Hypoxanthin und gefärbte SuDstanz wurden in gleicher Weise, wie es in Versuchsbeispiel 2 beschrieben ist, unter Verwendung von jeweils 10 ml der konzentrierten Lösungen bestimmt. Die e-haltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 3

wasserlösliches organisches
Lösungsmittel

Ausbeute an
kristallinem
CAMP (%)

Äthylalkohol 90

n-Propylalkohol 120

Isopropylalkohol 110

tert-Butylalkohol 130

Aceton 150

Dioxan 80

Reinheit

51
50
55
40
40
55

Tabelle 4

60

65 CAMP

(mg/ml)

5'-Inosinsäure
(mg/ml)

Inosin
(mg/ml)

Hypoxanlhin
(mg/ml)

Protein

(E400)

50,5 Spur

0,6

0,5

0,74

Die hierdurch erhaltene Lösung, aus der die Niederschläge entfernt worden waren, wurde auf pH 2,0 mit 5 η wäßriger HCL-Lösung eingestellt und die resultierende Lösung bei 5° C während 40 Stunden zur Kristallisation von CAMP-Kristallen gehalten. Die

rdurch gebildeten Kristalle wurden in gleicher :ise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, unter Ert von CAMP-Kristallen einer Reinheit von 99% in er Ausbeute von 90% behandelt.
Ium Vergleich wurde diese CAMP-haltige Lösung auf pH 2,0 mit 5η wäßriger HCL-Lösung eingestellt und das 3fache Volumen an Äthylalkohol zur Kristallisation von CAMP-Kristallen hinzugegeben. Hierdurch wurden CAMP-Kristalle einer Reinheit von 60% in einer Ausbeute von 98% erhalten.

Claims

Patentanspruch:

1. Verfahren zui Gewinnung von 3\5'-zyklischer Adenylsäure oder 3',5'-zyklischer Desoxyadenylsäure aus einer durch Kultivieren eines 3',5'-zyklische Adenylsäure oder 3',5-zyklische Desoxyadenylsäure produzierenden Mikroorganismus in einer Nährmedium enthaltenden Lösung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung vor oder nach der Zugabe eines wasserlöslichen, organischen Lösungsmittels in einer Menge, die zur Abscheidung oder Ausfällung der Verunreinigungen ausreicht, auf einen pH-Wert von 5 oder mehr einstellt, die gebildeten, abgeschiedenen Materialien oder Niederschläge entfernt, die so erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von 3 oder weniger einstellt und bei 0 bis 25° C während 6 bis 24 Stunden die 3',5'-zyklische Adenylsäure oder 3',5'-zyklische Desoxyadenylsäure kristallisiert und gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf 6 bis 12 eingestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur von 0 bis 30° C durchgeführt wird.