DE1101427B

DE1101427B - Verfahren zur Herstellung von N-Glycosiden des 5-Fluor-cytosins

Info

Publication number: DE1101427B
Application number: DEH35873A
Authority: DE
Inventors: Jack J Fox; Robert Duschinsky
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1958-04-17
Filing date: 1959-03-14
Publication date: 1961-03-09

Description

Verfahren zur Herstellung von Ni- Glycosiden des 5-Fluor-cytosins Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Ni Glycoside von 5-Fluor-cytosin und deren Salze, insbesondere von Ni Ribosiden und Nl 2'-Desoxyribosiden von 5-Fluor-cytosin, z. B. 1-ß-D-Ribofuranosyl-5-fluor-cytosin (5-Fluor-cytidin) und 1-(ß-D-2'-Desoxyribofuranosyl)-5-fluorcytosin- (2'-Desoxy-5-fluor-cytidin).
Es ist bereits bekannt, an den Ringstickstoffatomen substituierte Uracile mit Phosphorpentasulfid in 4-Thiouracilderivate umzuwandeln. Es ist weiter bekannt, daß man 6-Oxy-9-(2',3',5'-tri-O-benzoyl-ß-D-ribofuranosyl)-purin mit Phosphorpentasulfid und nachfolgender Debenzoylierung in das entsprechende debenzoylierte 6-Mercaptoderivat überführen kann. Schließlich ist bekannt, daß 2,4-Dithio-pyrimidin durch Ammoniak in 2-Thio-4-amino-pyrimidin übergeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nunmehr dadurch gekennzeichnet, daß man einen O-Acylester von Ni Glycosiden des 5-Fluor-uracils mit einem Phosphorsulfid in basischem Medium umsetzt, den erhaltenen O-Acylester von Ni Glycosiden des 4-Thio-5-fluor-uracils mit überschüssigem Ammoniak behandelt und das Reaktionsprodukt gewünschtenfalls mit einer Säure in ein Salz überführt.
Als Acylester können z. B. Acetylester oder Benzoylester verwendet werden. Als Phosphorsulfid verwendet man mit Vorteil Phosphorpentasulfid und als basisches Medium Pyridin oder Chinolin. Die Ammoniakbehandlung wird zweckmäßig unter Erhitzen vorgenommen.
Die Ni Glycoside von 5-Fluor-cytosin sind basische Verbindungen, welche mit anorganischen oder organischen Säuren Säureadditionssalze bilden. Um Salze, wie Hydrohalogenide, z. B. Hydrochloride oder Hydrobromide und Sulfate, Nitrate oder Pikrate, zu erhalten, setzt man die Verbindungen z. B. mit etwa der äquimolaren Menge der entsprechenden starken anorganischen oder organischen Säure um.
Die Ni Glycoside von 5-Fluor-cytosin sind nützlich als Antimetaboliten, welche in den Nucleinsäuremetabolismus eingreifen, und als Bakteriostatika, z. B. gegen grampositive Bakterien, wie Staphylococcus aureus und Lactobacillus leichmannii, und gegen gramnegative Bakterien, wie Proteus vulgaris, sowie gegen Pilze, wie Paecilomyces varioti und Penicillium digitatum. Die Substanzen können in Form der Base oder ihrer medizinisch verwendbaren Säureadditionssalze verabreicht werden.

Es wurde festgestellt, daß die Verfahrensendprodukte bei der Prüfung der Hemmwirkung gegen Paecilomyces varioti, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Penicillium digitatum und Proteus vulgaris nach der von D. C. Gro ve und W. A. Randall in »Assay Methods of Antibiotics, A Laboratory Manuah, S. 7, Medical Encyclopedia, Inc., New York, 1955, beschriebenen Methode bei Verwendung von 5-Fluor-cytidin bzw. 5-Fluor-2'-desoxy-cytidin in einer Konzentration von 0,1 mg/ml eine Hemmzone von 15 bis 22 mm Durchmesser ergeben, während die entsprechenden Bromverbindungen dabei völlig inaktiv sind (Tabelle I). Die Verfahrensendprodukte weisen auch eine

Versuchsbericht I

Antimikrobielle Wirksamkeit von Derivaten

der Cytidinreihe

Tabelle I

Durchmesser

der Hemmzone in mm

in einer Konzentration

Testorganismen von 0,1 mg/ml*)

Substanz

A I B I C I D

Paecilomyces varioti ....... 0 0 22 19

23 27

Bacillus simplex ........... 0 0 16a 20

Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . 0 0 15 a 20a

Penicillium digitatum ...... 0 0 19 17

Proteus vulgaris ........... 0 0 17 15

* Die hochgestellten Zahlen geben den Durchmesser sekun-

därer, schwacher, aber bestimmter Hemmzonen an.

a Dieses Symbol bezeichnet eine klare, scharfe primäre Hemm-

zone. Andere Zonen sind bestimmt, jedoch nicht völlig klar.

A 5-Brom-cytidin.

B 5-Brom-2'-desoxy-cytidin.

C 5-Fluor-cytidin.

D 5-Fluor-2'-desoxy-cytidin.

gute Hemmwirkung auf Neurospora (Wildtyp) auf, während nach Angaben in der Literatur 5-Brom- bzw. 5-Chlor-cytidin keine Wirksamkeit gegen diesen Organismus aufweisen (Tabelle II).

Versuchsbericht II

Fungizide Wirkung von 5-Fluor-cytidin

und 5-Fluor 2'-desoxy-cytidin

Tabelle II

Durchmesser der Hemmzone in mm

Test-

organismus C D

20y(ml 100 y/ml 1 20 y/ml' 5 -y/ml 11,25 y/ml

Neurospora

(VTildt 24 t 32 25 20

16

Beispiel 1 5-Fluor-cytidin Eine Mischung von 21,4g (0,037 Mol) 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-5-fluor-uridin, 28 gPhosphorpentasulfid, 350m1 Pyridin und 0,8 ml Wasser werden unter gutem Rühren und Rückfluß erhitzt. Zu der klaren, orangefarbigen Lösung wird zusätzlich tropfenweise Wasser zugegeben, bis eine trübe orangefarbige Lösung erhalten wird. Nach 61j,stündigem Erhitzen auf Rückflußtemperatur wird die Reaktionsmischung gekühlt und unter starkem Rühren in eine Mischung von Eis und Wasser eingegossen. Der sich bildende körnige Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und in 600 ml Chloroform gelöst, worauf eine geringe Menge unlösliches Material abfiltriert wird. Die Chloroformlösung wird zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und hierauf im Vakuum eingedampft. Der rohe, feste Rückstand wird aus 21 heißem Methanol umkristallisiert (Ausbeute 15,7 g = 72 °/o der Theorie. Schmelzpunkt 182 bis 184°C). Ein aliquoter Teil von rohem 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-4-thio-5-fluor-uridin wird aus Äthanol umkristallisiert; Schmelzpunkt 183,5 bis 184°C.

12 g 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-4-thio-5-fluor-uridin werden mit 200 ml äthanolischem Ammoniak (bei 0°C gesättigte Lösung) im Bombenrohr während 15 Stunden auf 85°C erhitzt, wobei allmähliche Lösung eintritt. Die grünlich gefärbte Lösung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und mit Wasser versetzt, worauf das unlösliche Material durch Filtration abgetrennt wird. Das wässerige Filtrat wird einer Wasserdampfdestillation unterworfen, um den Benzoesäureäthylester zu entfernen. Die verbleibende wässerige Lösung wird dreimal mit Chloroform extrahiert und mit Aktivkohle behandelt. Die wässerige Schicht wird hierauf im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Toluol destilliert, um die letzten Wasserspuren zu entfernen. Der so erhaltene Sirup, welcher 5-Fluor-cytidin enthält, wird mit Äthanol versetzt, und die Mischung wird unter mäßiger Kühlung mit Chlorwasserstoffgas behandelt. Zuerst bildet sich eine klare Lösung und hierauf ein feiner, weißer Niederschlag. Nach Kühlung und Filtration erhält man 5,2 g rohes 5-Fluor-cytidinhydrochlorid mit dem Schmelzpunkt 173 bis 174°C.
Ionenaustauscherchromatographie zeigt, daß das erhaltene Produkt etwa 55 °/o reines 5-Fluor-cytidin enthält. Der Rest ist Cytidin und möglicherweise eine geringe Menge 5-Äthoxy-cytidin.
0,15 g rohes 5-Fluor-cytidin-hydrochlorid, gelöst in 2 ml n-Salzsäure wird durch eine Säule von 1,1 # 17 cm des unter der Handelsbezeichnung »Dowex 50-X2« bekannten stark sauren Kationenaustauscherharzes fließen gelassen, das aus einem querverbundenen Copolymeren von Styrol mit Divinylbenzol (2 °/p des letzteren) besteht, welches als funktionelle Gruppen Sulfonsäuregruppen enthält (Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm). Man eluiert mit n-Salzsäure und bildet Fraktionen von 20 ml pro halbe Stunde.
Durch Eindampfen der dritten Fraktion erhält man einen glasigen Rückstand, welchen man aus einer Mischung von 10 ml Äthanol und 3 ml Methanol kristallisiert. Das erhaltene 5-Fluor-cytidin-hydrochlorid schmilzt bei 177 bis 179°C.
Die 5-Fluor-cytidinbase in reiner Form erhält man in folgender Weise: Das unter der Handelsbezeichnung - »Dowex 50-X2« bekannte stark saure Kationenaustauscherharz mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften (Maschenabstand 0,075 bis 0,15 nun) wird nacheinander mit Salzsäure, Wasser und wässerigem Ammoniak (30 ml konzentriertes Ammoniak in 100 ml Wasser) und hierauf abermals mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen, um die Ammoniumform des Harzes zu gewinnen.

Eine Lösung von 3,03 g rohem 5-Fluor-cytidin-hydrochlorid in 12 ml Wasser wird durch eine 2,2 . 40-cm-Säule des vorstehend beschriebenen Harzes fließen gelassen. Das am Harz adsorbierte Material wird mit destilliertem Wasser eluiert, wobei halbstündlich Fraktionen von etwa 20 ml gesammelt werden. Die einzelnen Fraktionen werden in 0,1 n-Salzsäure bei Wellenlängen von 280. und 300 p. auf Ultraviolettabsorption untersucht. Die Werte in der folgenden Tabelle III stellen die Totalabsorption der einzelnen Fraktionen dar (erhalten durch Multiplikation des Extinktionswertes x der verdünnten Probe mit dem Volumen der Probe). Die Eluierung mit Wasser liefert in Fraktion 142 kein Material mehr, welches Ultraviolettabsorption zeigt. Die Eluierung wird daher mit 0,02 n-Ammoniak weitergeführt.

Tabelle III

I II III IV V

A 115000 67000 0,592

1 bis 3 - - - B

4 990 1120 1,13

5 97 117 1,2

6 bis 9 - - -

10 bis 55 45000 43800 0,973

56 bis 90 7520 7320 0,986 C

91 bis 142 3480 3330 0,96

143 bis 185 5860 2190 0,373

186 740 200 0,27

187 bis 202 37700 8285 0,22 D

I = Fraktionen.

II = Totalabsorption bei- 280 m#t.

III = Totalabsorption bei 300 m#t.

IV = Durchschnittsverhältnis 300: 280 mg,.

V = Identifizierung.

A = Ausgangsmaterial.

B = NH4C1.

C = 5,66 MAlimol 5-Fluor-cytidin (= 1,48 g, berechnet als

Base, oder 1,69 g, berechnet als Hydrochlorid).

D = 2,81 Millimol Cytidin (= 0,572 g, berechnet als Base, oder

0,786 g, berechnet als Hydrochlorid).

Die Fraktionen 10 bis 90 werden vereinigt und im Vakuum Zur Trockene eingedampft. Der glasähnliche Rückstand wird mit 37 ml heißem Äthanol extrahiert und die erhaltene Lösung durch Filtration von etwas

unlöslichem bräunlichem Material befreit. Nach Kühlung

scheiden sich Kristalle ab, welche abfiltriert und mit

Äthanol und Äther gewaschen werden; Ausbeute 0,89 g.

Das erhaltene 5-Fluor-cytidin beginnt bei etwa 190'C

zu schmelzen, verfestigt sich wieder und schmilzt aber-

mals bei 199 bis 200'C. Eine aus Äthanol umkristalli-

sierte Probe zeigt ähnliche Schmelzpunktseigenschaften.

Die Mutterlauge wird zur Trockene eingedampft und

der Rückstand in ähnlicher Weise auf kristallisiertes

Material verarbeitet, wobei 0,12 g identisches Material

erhalten werden. Die Fraktionen 91 bis 142 ergeben

nach einer ähnlichen Behandlung eine zusätzliche Aus-

beute von 20 mg 5-Fluor-cytidin, so daß eine Gesamt-

ausbeute von 1,03 g kristallisierter Base (33 °/o der

Theorie auf Basis von 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-4-thio-

5-fluor-uridin) erhalten wird.

Die Fraktionen 187 bis 202 ergeben nach Verdampfung

und Kristallisation aus 100 ml Methanol und 100 ml

Petroläther 0,42 g verwachsene Nadeln, welche bei 214

bis 215°C schmelzen. Ein Vergleich des Ultraviolett-

Spektrums und eine Mischschmelzpunktsbestimmung mit

authentischem Material zeigt, daß das bei 214 bis 215'C

schmelzende Material mit Cvtidin identisch ist.

Das als Ausgangsverbindung verwendete 2',3',5'-Tri-

0-berizoyl-5-fluor-uridin kann in der folgenden Weise

erhalten werden:

Zu einer Lösung von 65 g (0,5 2:Iol) 5-Fluor-uracil in

2350 ml Natronlauge (enthaltend 8 g L0,2 Molj Natrium-

hy droxyd) gibt man eine Lösung von 136 g (0,5 Mol)

Quecksilber(II)-chlorid in 452 ml Äthanol. Durch Zugabe ;

von 450 ml n-Natronlauge wird der pH-Wert der Mischung

auf 5,1 gebracht, worauf Quecksilber-di-(5-fluor-uracil)

ausfällt. Die Mischung wird über Nacht auf einer Tempe-

ratur von 4'C gehalten, worauf der kristallisierte Nieder-

schlag abfiltriert, mit Wasser chlorionenfrei gewaschen

und hierauf mit Äthanol und schließlich mit Diäthy i-

äther nachgewaschen wird; Ausbeute 98,3 g entsprechend

85,7 °/° der Theorie.

750 m1 wasserfreier Äther werden auf O' C abgekühlt

und mit trockenem Chlorwasserstoff gesättigt, wobei ,

etwa 275 g Chlorwasserstoff aufgenommen werden.

35,3 g (0,07 Mol) 1-0-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-j3-D-ri-

bose (hergestellt nach der von Kissman und anderen

modifizierten Fletcher-Synthese [vgl. »Journal of the

American Chemical Society<c, Bd. 77 (1955), S.21, und

Bd. 76 (1954), S. 7631), welche vorhergehend im Vakuum

bei 50°C getrocknet werden, löst man in der kalten

Chlorwasserstoff-Äther-Lösung. Nach Zugabe von 28 ml

Acetylchlorid wird die Mischung während 8 Tagen bei

0' C stehengelassen. Während dieses Zeitraumes wird ;

nach 3 Tagen die kalte Lösung zusätzlich mit Chlor-

wasserstoff gesättigt, wovon etwa 15 g aufgenommen

werden.

Die Lösung wird hierauf unter 50°C im Vakuum ein-

gedampft, bis ein Sirup entsteht. Der Rückstand wird ;

dreimal mit trockenem Benzol in Mengen von je 125 ml

extrahiert, wobei jeweils das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt wird. Der Sirupöse Rückstand wird schließlich

in 190 ml trockenem Toluol gelöst und langsam einer

trockenen Suspension von Quecksilber-di-(5-fluor-uracil) i

zugesetzt, welche wie folgt erhalten wird: 16 g (0,035Mo1)

Quecksilber-di-(5-fluor-uracil) werden unter Rühren in

255 ml Toluol suspendiert, worauf 100 ml Toluol bei

Atmosphärendruck abdestilliert werden. Die Mischung

läßt man etwas abkühlen und setzt 100 ml wasserfreies i

Toluol zu, worauf abermals 85 nil Toluol unter Atmo-

sphärendruck abdestilliert werden. Zu dieser Queck-

silber-di-(5-fluor-uracil)-suspension wird die Toluollösung

von 1-0 "4cetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-ß-D-ribose langsam

bei etwa 100'C zugesetzt.

Die erhaltene -Mischung wird bei 108'C während

13/4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Reaktions-

mischung wird bei Siedetemperatur filtriert und das

Filtrat während 2 Tagen im Eisschrank gekühlt. Es

fällt rohes 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-5-fluor-uridin aus, wel-

ches abfiltriert und im Vakuum zur Trockene gebracht

wird; Ausbeute 18 g entsprechend 52°/o der Theorie.

In einem mit einem Rückflußkühler und einem Hahn

am Boden versehenen Dreihalskolben wird eine Lösung

von 10 g rohem 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-5-fluor-uridin in

350 ml Chloroform unter Rühren auf 50` C erhitzt. Die

erhaltene klare Lösung wird tropfenweise mit 100 ml

30°/oigem Kaliumjodid unter Rühren versetzt. Nach

Rühren während 15 =ainuten läßt man die beiden Phasen

sich trennen, wobei die Terperatur von etwa 45 bis

50'C aufrechterhalten -:rird. Die schwerere Chloroform-

schicht wird abgetrennt und die wässerige Phase ab-

dekaiitiert. Die Chl_oroformpiiase wird z:i-eimal mit je

150 rrl V; asser bei 50'C ewasch#2_i und im noch warmen

Zustand mit Yiatriumsulfat behandelt, bis sich die

_Jischung l@lärt, :vorauf nitriert wird. Das Filtrat wird

im s`al@uuni auf etwa 100ein-edampft und der

Rückstand über <acht ii-n L' issc.ira.nk gekühlt. Das

gereimte wird

mit .,-erdig #-iskalterz Chloroform gewaschen,

abgenatscht uni. im V alan-m getrocknet; Ausbeute

6,5 g entsprechend 65 °;° d,2r Theorie; Schmelzpunkt

215 bis 217= C.

5-Fluor-cyti:lin und dessen -medizinisch verwendbaren

Salze sind bakterizid und Fungizid wirksam, z. B. gegen

Paeciloin-"-c@s varioti, Bacillus simplex, Sarcina lutea,

Bacil:us sabstilis, Penicilliuin digitatum, Staphylococcus

auretis und Lactoüaciii-as leichmannii.

Beispiel 2

2'-Desoxy-5-:iuor-cy tidin

Eine Mischung von 3,6 g (0,05 Mol) rohem 2'-Desoxy-

5-fluor-uridin (etwa 90°Joige Reinheit), 100 ml wasser-

freiem Pyridin und 4,2 g (0,03 ::Toi) Benzoylchlorid wird

während 60 Stunden auf 55 bis 60- C erhitzt. Die ent-

stehende gelbliche Lösung wird gekühlt und in einem

dünnen Strahl in eine stark gerührte Mischung von Eis

und Wasser gegossen. Es bildet sich sofort ein weißer,

feiner Niederschlag. Die Mischung wird während 1 Stunde

gerührt und hierauf filtriert. Der erhaltene Niederschlag

wird wiederholt mit kaltem Wasser, kaltem Alkohol

und schließlich finit Äther gewaschen. Das auf diese

Weise erhaltene rohe 3',5'-Di-O-benzoyl-2'-desoxy-5-fluor-

uridin (6 g) schmilzt bei 235 bis 236,5°C. Nach Um-

kristallisierung aus Essigsäureäthylester und in der

Folge aus Methanol erhält man kristallisiertes 3',5'-Di-

0-benzoyl-2'-desoxy-5-fluor-uridin vom Schmelzpunkt

236,5 bis 237,5'- C.

Eine :Mischung von 5,5 g (0,012 Mol) 3',5'-Di-O-ben-

zoyl-2'-desoxy-5-fluor-uridin, 10,4 g (0,047 Mol) Phos-

phorpentasulfid und 150 ml Pyridin wird unter lebhaftem

Rühren auf Rückflußtemperatur erhitzt, wobei eine

klare, orangefarbige Lösung gebildet wird. Hierauf wird

tropfenweise 0,5 ml Wasser zugesetzt, bis eine bleibende

Trübung entsteht. Es wird weitere 5 Stunden unter

Rückfluß erhitzt. Die bräunliche, trübe Lösung wird

auf etwa 70'C abgekühlt und die Hälfte des Pyridins

durch Destillation im Vakuum abgetrieben. Der Sirupöse

Rückstand wird in dünnem Strahl in eine Mischung

von Eis und Wasser gegossen und während i/2 Stunde

gerührt, wobei Granulation eintritt. Nach Filtration

wird der Rückstand mit einer großen Menge Methylen-

chlorid aufgenommen, mit Wasser gewaschen und über

Natriumsulfat getrocknet. Die Methylenchloridlösung

wird eingedampft, wobei 3',5'-Di-O-benzoyl-4-thio-2'-desoxy-5-fluor-uridin als leichtgelbgefärbter Niederschlag erhalten wird. Nach Umkristallisierung aus absolutem Äthanol schmilzt die Verbindung bei 210 bis 211'C.

Eine Lösung von 1 g rohem 3',5'-Di-O benzoyl-4-thio-2'-desoxy-5-fluor-uridin in 20 ml flüssigem Ammoniak wird unter Stickstoff in einem mit Glas ausgekleideten Autoklav während 6 Stunden auf 70 bis 80°C erhitzt (man verwendet flüssiges Ammoniak an Stelle von alkoholischem Ammoniak, um eine Einführung der Alkoxygruppe zu vermeiden). Nach Verdampfung des Ammoniaks im Vakuum bei 60°C wird ein braungefärbter fester Rückstand von rohem 2'-Desoxy-5-fluorcytidin erhalten, welcher mit 15 ml Wasser aufgenommen wird. Man filtriert von etwas unlöslichem Material ab und extrahiert die wässerige Lösung dreimal mit j e 20 ml Äther. Die wässerige Schicht wird durch teilweise Verdampfung im Vakuum vom Äther befreit und mit 1,3 ml n-Salzsäure kongorotsauer gestellt.
Diese Lösung, welche rohes 2'-Desoxy-5-fluor-cytidinhydrochlorid enthält, läßt man durch eine Säule von 2,5 -35 cm des im Beispiel 1 beschriebenen Ionenaustauscherharzes in der Ammoniumform fließen und chromatographiert mit Wasser bei einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Fraktion und pro halbe Stunde. Die Fraktionen 6 bis 11 (130 ml) werden vereinigt und geben eine Gesamtabsorption im Ultraviolett von 6090 bei 280 m#L (in 0,1 n-Salzsäure) und ein Verhältnis Bei der Papierchromatographie mit Isopropanol-Salzsäure wird nur ein einziger Fleck erhalten. Durch Verdampfung der Fraktionen 6 bis 11 im Vakuum erhält man 305 mg eines glasigen Rückstandes, welcher in 20 ml heißem Methanol gelöst wird. Nach Filtrieren wird die Lösung gekühlt und mit 25 ml Petroläther versetzt. Man läßt über Nacht stehen, wobei sich Kristalle abscheiden, welche abfiltriert, mit einer Mischung von Äthanol-Petroläther (1:2) und schließlich mit Petroläther gewaschen werden; Ausbeute 77 mg 1-(ß-D-2'-Desoxy-ribofuranosyl)-5-fluor-cytosin (2'-Desoxy-5-fluor-cytidin); Schmelzpunkt 180 bis 182°C. Aus der Mutterlauge erhält man nach Zusatz von 95 ml Petroläther eine zweite Ausbeute von 50 mg, so daß die Gesamtausbeute 127 mg beträgt (24,3 °/o der Theorie).
Das als Ausgangsverbindung verwendete 2'-Desoxy-5-fluor-uridin kann auf folgende Weise erhalten werden Zellen von Streptococcus fecalis (ATCC 8043) werden auf einem AOAC-Folsäure-Nährbodengezüchtet (Lepper, Official and Tentative Methods of the Association of Official Agricultural Chemists, Washington, D. C., 7. Auflage [1950], S. 784), dem 2 mg pro Liter Thymin zugesetzt werden (Prusoff, »Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine«, Bd. 85 [1954], S.564).
Nach 20stündigem Brüten bei 37°C werden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen. Die erhaltenen Zellen werden dreimal mit 4 Volumen einer Kaliumphosphatpufferlösung gewaschen (M/15 wässerige Monokaliumorthophosphatlösung, die durch Zugabe von 2 n-Kalilauge auf pu 8,0 gebracht wurde), worauf die nassen Zellen gewogen werden. Die Zellen werden schließlich. in der obigen Kaliumphosphatpufferlösung suspendiert und in einem Glashömogenisator verrieben.
Ein Enzympräparat, welches 4,06 g nassen Zellen entspricht, wird mit der vorstehend beschriebenen Kaliumphosphatpufferlösung auf 105 ml gebracht. 200mg (1,54 Millimol) 5-Fluor-uracil und 1,50 g (6,16 Millimol) Thymidin werden in 15 ml vorstehend beschriebener Kaliumphosphatpufferlösung gelöst. Die beiden Lösungen werden vermischt, wobei ein Gesamtvolumen von 120 ml entsteht. Die Mischung wird während 18 Stunden bei 37°C bebrütet, worauf die Enzymwirkung durch Zusatz von 4 Volumen Aceton und 1 Volumen peroxydfreiem Diäthyläther gehemmt wird. Die ausgefallenen festen Teile werden abfiltriert, und das Filtrat wird unter Stickstoff und vermindertem Druck eingedampft, bis die flüchtigen organischen Lösungsmittel im wesentlichen entfernt sind. Es verbleiben ungefähr 20 ml einer wässerigen Lösung, welche in 100 ml destilliertem Wasser aufgenommen wird.
Die Lösung wird neuerlich im Vakuum auf 5 ml eingedampft und durch Zusatz von 20 ml n-Natronlauge alkalisch gestellt, wobei eine Mischung von Natriumsalzen folgender Substanzen erhalten wird: N-Desoxyriboside von 5-Fluor-uracü, Thymin, Thymidin und 5-Fluor-uracil. Diese Mischung wird durch Adsorption an einem Ionenaustauscherharz und nachfolgender Eluierung mit einer Pufferlösung von allmählich steigendem Säuregrad gereinigt, wobei die Pyrimidinkomponenten der Mischung in der folgenden Reihenfolge eluiert werden: Thymidin, Thymin, 5-Fluor-uracil und 2'-Desoxy-5-fluor-uridin. Zur Reinigung läßt man die vorstehend angeführte alkalische Mischung durch eine Säule von 2,2 -27 cm des unter der Handelsbezeichnung »Dowex 1-X4« bekannten Anionenaustauscherharzes fließen, das aus einem querverbundenen Copolymeren von Styrol mit Divinylbenzol - (40/, des letzteren) besteht, welches als funktionelle Gruppen quaternäre Ammoniumgruppen enthält (Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm) und zuerst in die Formiatform übergeführt und neutral gewaschen wurde. Die Säule wird dann mit 280 ml einer wässerigen Ammoniumformiatpufferlösung (pH 9,8) eluiert, welche eine Normalität von 0;1, bezogen auf Formiationen, aufweist. Die Eluate enthalten keine Substanz, die das ultraviolette Licht absorbiert. Die Säule wird weiter mit einer wässerigen Ammoniumformiatpufferlösung (pg 7,4) eluiert, welche eine Normalität von 0,1, bezogen auf Formiationen, aufweist. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 46 ml in der Stunde. Die Eluierung wird weiter fortgesetzt mit einer wässerigen Ammoniumformiatpufferlösung (pH 6,5), welche eine Normalität von 0,1, bezogen auf Formiationen, aufweist, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 60 ml pro Stunde. Die Fraktionen werden in Abständen von 30 Minuten gesammelt und einzeln auf Ultraviolettabsorption bei Wellenlängen von 260 und 280 mta. geprüft (pH 14).

Die Prüfung der Ultraviolettabsorptionsspektren und die Papierchromatographie der einzelnen Fraktionen ergibt, daß die Fraktionen 6 bis 17 nur Thymin und Thymidin, die Fraktionen 34 bis 48 dagegen die Fluorverbindungen enthalten. Die Fraktionen 34 bis 48 werden daher vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 30 ml der oberen Schicht einer Zweiphasenmischung gelöst, welche durch Mischung von 60 Volumteilen Essigsäureäthylester, 35 Volumteilen Wasser und 5 Volumteilen Ameisensäure erhalten wird. Man erstellt dann eine Kolonne von 4,4 - 49 cm durch Anfeuchten von 285 g Cellulosepulver (aschefrei, Standardqualität), mit der oberen Phase des vorstehend genannten Essigsäureäthylester-Wasser-Ameisensäure-Gemisches und Einstampfen der nassen Cellulose in die Absorptionsröhre mit Hilfe eines Stabes. Man läßt hierauf die 30 ml der Lösung durch die Säule fließen. Man eluiert mit der oberen Schicht des obigen Essigsäureäthylester-Wasser-Ameisensäure-Gemisches mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 40 ml- pro Stunde und sammelt die Fraktionen in halbstündigen Intervallen. Die einzelnen Fraktionen werden auf Ultraviolettabsorption bei Wellenlängen von 260 und 280 m#t (p$14) untersucht:

Tabelle IV

I II III IV V ( VI

1 bis 56 0 0 - - -

57 bis 93 1405 3725 2,61 0,57 0,01

94 0 0 - - -

95 bis 96 118 124 1,05 unbe- 0,02

deutend

97 bis 104 2075 1905 0,92 - 0,38a)

I = Fraktionen.

II = Totalabsorption (pg 14) bei 260 m[,.

III = Totalabsorption (pg 14) bei 280 mI..

IV = Durchschnittsverhältnis 280: 260 ml,.

V = 5-Fluor-uracil (in Millimol).

VI = 2'-Desoxy-5-fluor-uridin (in Millimol).

a) = 0,39 Millimol Desoxyribose (gemäß der Prüfung nach Stumpf, J. Biol. Chem. 169 [1947]. S. 367).

Die Fraktionen 97 bis 104 werden vereinigt und im Vakuum bei 45°C zur Trockene eingedampft. Man erhält 2'-Desoxy-5-fluor-uridin als eine farblose glasige Substanz. Diese wird dreimal mit Äthanol aufgenommen und zur Trockene eingedampft, bis ein kristallisierter Rückstand vorliegt, welcher aus Essigsäurebutylester umkristallisiert wird; Schmelzpunkt 152 bis 153°C. 2'-Desoxy-5-fluor-cytidin und dessen medizinisch verwendbaren Salze sind bakterizid und fungizid wirksam, z. B. gegen Paecilomyces varioti, Bacillus simplex, Corynebacterium simplex, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, Penicillium digitatum, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Lactobacillus leichmannii.

Tabelle V

Spektrophotometrische Werte

Substanz Medium Maximum Minimum 280 300

7 (mg.) I 810-3

7 (m@.) i 610-3

260

280

I ..... 0,1 n-HCl 284 bis 285 11,2 244 1,69 2,45 0,595

0,1 n-NaOH 275 bis 276 7,80 256 bis 257 5,84 1,22 0,265

II ..... 0,1 n-HCl 290 11,7 248 bis 249 1,77 3,04 0,973

0,1 n-Na O H 281 8,15 260 bis 261 5,79 1,39 0,447

III..... 1 n-HCl 290 I 11,8 247 1,42 3,05 0,877

IV .. ... 0,1 n-HCl 289 11,4 250 ( 1,70 3,03 0,963

I - 5-Fluor-cytidin-hydrochlorid (roh).

II = 5-Fluor-cytidin (rein).

III - 5-Fluor-cytidin-hydrochlorid (rein).

IV = 5-Fluor-2'-desoxycytidin.

Für die Verfahren zur Herstellung der als Ausgangssubstanzen verwendeten Verbindungen wird im Rahmen vorliegender Erfindung ein Schutz nicht begehrt.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von N,-Glycosiden des 5-Fluor-cytosins und dessen Salzen mit medizinisch verwendbaren Säuren, dadurch gekennzeichnet, daß ein O-Acylester von Ni Glycosiden des 5-Fluor-uracils in einem basischen Medium mit einem Phosphorsulfid umgesetzt wird, der erhaltene O-Acylester von Ni Glycosiden des 4-Thio-5-fluoruracils mit überschüssigem Ammoniak behandelt und erwünschtenfalls das Reaktionsprodukt mit einer Säure in ein Salz übergeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-5-fluor-uridin mit Phosphorpentasulfid in einem basischen Mittel umgesetzt und das entstehende 2',3',5'-Tri-O-benzoyl-4-thio-5-fluor-uridin mit überschüssigem Ammoniak behandelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 3',5'-Di-O-benzoyl-2'-desoxy-5-fluoruridin mit Phosphorpentasulfid in einem basischen Medium umgesetzt und das erhaltene 3',5'-Di-O-benzoyl-4-thio-2'-desoxy-5-fluor-uridin mit überschüssigem Ammoniak behandelt wird. In Betracht gezogene Druckschriften: njournal of the American Chemical Soclety«, Bd.69 (1947), S.2138 2139; Bd.71 (1949), S.2279 bis 2282; Bd. 77 (1956), S.2395, und Bd.80 (1958) S. 1675.