DE1795480C3

DE1795480C3 - Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden

Info

Publication number: DE1795480C3
Application number: DE19641795480
Authority: DE
Inventors: Akira Nishinomiya; Igarasi Seizi Ashiya; Imada (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1963-03-18
Filing date: 1964-03-17
Publication date: 1977-01-13

Description

R,

IO

¹ R₃ - ' -^J

in der^^J^jdie^Hyikoxyl- oder Aminognjppe^Ri ein Wasserstoff-oder euTrHaTogenatom.eine'Mercäpto-, Amino-, Niederalkylamino-, Furfurylamino- oder Niederacylaminogruppe und R3 den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest bedeutet und hierbei der Niederalkylrest bis zu 6 Kohlenstoffatome und der Niederacylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Purinbase der allgemeinen Formel II

20

N V-N^

CH

in der Ri und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, mit Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin oder den entsprechenden 2'-, 3'-, £'-, 2'3'- oder 3',5'-Ribonucleotiden oder Adenindesoxyribosid, Hypoxanthindesoxyribosid, Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxyribosid, Thymindesoxyribosid oder den entsprechenden 3'-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribonucleotiden oder Gemischen derselben in einem wäßrigen Medium vom pH-Wert 4 bis 10 bei Temperaturen zwischen 20 und 50° C in Gegenwart eines Phosphats und eines den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest Obertragenden Enzymsystems der folgenden aeroben Bakterienstämme:

Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck,

ATCC-9621,

Aeromonas hydrophila (Chester), Stanier,

NRRL.B-909,

Bacillus brevis Migula emend. Ford, ATCC-

9999,

Bacillus sphaericus Neide. USDA- 344, Bacterium cadaveris Gale et Epps, ATCC-9760, Corynebacterium sapedonicum (Spiek. et Kott), Skaptason et Burkholder, ATCC-15391, Erwinia aroideae (Townsend), Holland, ATCC-

15390,

Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer), Long et Hammer, ATCC-8071, '

Vibrio percolans Mudd et Warren, NRRL, S-31 umsetzt.

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden der allgemeinen in der Ri eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, R₂ Vm ,Wasserstoffatom, ein Halogenatmm, eine Mercapto-, ' Aminoveine Niederalkylamino-, eine Furfurylamino- oder Niederacylaminogruppe und R₃ den Ribosyl- oder

pesqxyribpsylrest-bedeutet,,wobeii der.Niederalkylrest ^bis-zu 6 Kohlenstdffatome und der Niederacylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält Purinnucleoside, die gemäß der Erfindung hergestellt werden können, sind beispielsweise 2-Aminopurinribosid, 2,6· Diaminopurinribosid. Isoguaninribosid und die entsprechenden Desoxy riboside. Diese Purinnucleoside sind bisher in der Natur nicht oder nur in sehr geringen Mengen gefunden worden.

Die vorstehend genannten Purinnucleoside sind bekanntlich nützliche und wertvolle chemische bzw. biochemische Agenzien in enzymatischen und biochemischen Untersuchungen. Während Purinnucleoside wie Adenosin, Guanosin, Xanthosin und Inosin sich leicht herstellen lassen, z.B. durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren unter Bildung eines Gemisches von Nudeosiden und Abtrennung der einzelnen Nucleoside mit oder ohne Desaminierung oder durch Dephosphorylierung der Nucleotide mit Hilfe von Phosphatase, können die obengenannten Purinnucleoside nicht aus Nucleinsäuren hergestellt werden, vielmehr sind zu ihrer Herstellung chemische Synthesen erforderlich, die viele Reaktionsstufen und genaue Einhaltung der Reaktions bedingungen erfordern. Bei allen bisher bekannten chemischen Verfahren, die von der Base und Ribose oder Desoxyribose ausgehen, ist es schwierig, die Reaktion so zu führen, daß sie an den gewünschten Stellungen der Base und der Ribose oder Desoxyribose stattfindet Ferner ist die Handhabung der labilen Ribose oder der noch labileren Desoxyribose schwierig.

Speziell zur Großherstellung von Purindesoxynucleosiden ist ein zufriedenstellendes Syntheseverfahren bisher nicht bekanntgeworden.

Als zum Stand der Technik gehörende Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden sind zu nennen: das Verfahren, bei welchem Purinnucleoside aus einem Purin und Ribose- oder Desoxyriboseazetat durch »Schmelzen« in Gegenwart eines Katalysators gebildet werden (Chem. Abstracts, 56 [1962], Spalte 4751 a bis 4751 c, 57 [19621 Spalte 15 216 b bis 15 216 e, 57 [1962], Spalte 16 726 i bis 16 7271); die Herstellung von 6-Chlorpurinribosid aus Inosin (IJS-PS 30 74 929); die Herstellung von 6-Mercaptopuriiiiiribosid aus Inosin (]. American Chem. Soc„ 80 [1958], S. 1669 bis 1675, bes. S. 1673); die Herstellung von 6-Methylaminopurinribosid

und -desoxyribosid (J. American Chem. Soc, 85 [1963], S. 193 bis 201); die Herstellung von S-Furfurylaminopurinribosid(US-PS28 81 164).

Es ist aus der deutschen Auslegeschrift 10 72 249 bereits bekannt, die Desoxyriboeylgruppe von einem 2-Desoxyribosid enzymatisch stuf 5-Fluor-uraciI zu übertragen, wobei ein Enzymsystem von Streptococcus faecalis (ATCC 8043) verwendet wird. Eine enzymatische Übertragung einer Pentosyllgruppe unter Bildung

17

-von EujTiuiHcleosiden der Formel I war jedochgMcht bekannt Es wurde gefunden, daß die im Anspruch angegebenen aeroben Bakterienstämme Eteymsysteme bilden, die in der Lage smd, eine ΐφα^ Mer Desoxyribosylgruppe eines Nucleosids in die 9-Stellung etaer Pürinbase unter Bildung eines Purinmicleosids zu Oberführen. Es wurde ferner gefunden, daß die zur Oberführung der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe fähigen Enzymsysteme wenigstens eine Art von phosphorylase enthalten und daß die Anwesenheit eines Phosphats für die Wirkung der Enzymsysteme notwendig ist

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert Purinnucleoside in überraschend hoher Ausbeute, die der Ausbeute bei bekannten Putinnucleosidsynthesen nicht nachsteht ι s und die Ausbeute des enzymatischen Verfahrens der deutschen Patentschrift 10 72 249 weit übertrifft

Erfindungsgemäß werden die folgenden aeroben Bakterienstämme verwendet:

Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck, ATCC-9621,

Aeromonas hydrophila (Chester), Stanier, NRRL, B-909,

Bacillus brevis Migula emend. Ford, ATCC-9999,
Bacillus sphaericus Neide, USDA-344, Bacterium cadaveris GaIe et Epps, ATCC-9760,
Corynebacterium sapedonicum (Spiek. et Kott), Skaptason et Burkholder, ATCC-15391,
Erwinia aroideae (Townsend), Holland. ATCC-15390,

Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer), Long et Hammer, ATCC-8071,
Vibrio percolans Mudd et Warren, NRRL, S-31.
Gemäß der Erfindung werden reichlich und billig erhältliche Nucleoside oder Nucleotide als Lieferant der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe für die Systhetisierung der gewünschten wertvollen Nucleoside eingesetzt werden. Die Erfindung ermöglicht unter milden enzymatischen Bedingungen auch die Großherstellung von Purindesoxyribonucleoside, die nach den bisher bekannten Verfahren schwierig im technischen Maßstab herzustellen waren.

Die in Nucleinsäuren enthaltenden Nucleoside oder Nucleotide lassen sich leicht durch Hydrolyse derselben herstellen. Einige so erhältliche Purin-5-nucleotide werden beispielsweise als Würzen verwendet, während die Pyrimidinnucleotide bei weitem nicht das Interesse gefunden haben wie die wertvollen Purinnucleotide. Diese weniger wertvollen Pyrimidinnucleotide eignen sich gut als Ausgangsmaterial für das Verfahren gemäß der Erfindung, d.h. als Lieferant der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe. Als Lieferant der Ribosylgruppe kommen die Ribonucleoside, Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin und Cytidin und die diesen Ribonucleosiden entsprechenden 2'-, 3'-, 5'·, 2'3'- oder 3',5'-RIbOnUcIeOtI-de in Frage, während als Lieferanten einer Desoxyribosylgruppe die Desoxyribonucleoside Adenindesoxyribosid, Hypoxanthindesoxyribosid, Güanindesöxyribösid, Cytosindesoxyribosid und Thymiridesoxyribosid und die diesen Desoxyribonucleosiden entsprechenden 3'-, 5'- oder S'.S'-Desoxyribonucleötide geeignet sind. Diese Nucleoside und/oder Nucleotide können natürlich auch als Gemisch eingesetzt werden und brauchen nicht rein zu sein.

Das andere Ausgangsrtiaterial ist die Pürinbase, die der Basenkomponente des gewünschten Purinnucleoside entspricht, und auf die eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe übertragen wird. Diese Pürinbase hat die allgemeine Formel

N i—l

/
R₁

^CH

(H)

in der Ri und R2 die gleiche Bedeutung wie in der Formel (I) haben. Geeignete Purinbasen sind beispielsweise 2,6-Diaminopurin, 2-Amfeopurin, 2-Amino-6-äcetylaminopurinundlsoguanin. -

^: Beim {.-Verfahren gemäß der Erfindung kann die Kulturbrühe der Bakterien unmittelbar aJs EnzymqueJle gebraucht werden, oder die Zellen können in Form einer Suspension in Wasser, einer Pufferlösung oder einer Salzlösung verwendet werden. Die abgetrennten Zellen können ferner vor der Reaktion einer Vorbehandlung unterworfen werden, z.B. einer Zerstörung durch Beschallen, Mahlen mit Glaskugeln, Behandlung mit einem die Zellen zerstörenden Mittel wie Phenol oder Natriumcesoxycholat oder Waschen mit einem organischen lösungsmittel wie Aceton oder Äthylacetat Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch so durchgeführt werden, daß man die genannten aeroben Bakterien unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium züchtet, das beide Ausgangsmaterialien enthält

Die Kultivierung der Bakterien erfolgt in einem geeigneten Kulturmedium unter aeroben Bedingungen. Das Kulturmedium muß assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen für die verwendeten Bakterien enthalten. Zweckmäßig ist der Zusatz von anorganischen Salzen und Spurenelementen. Als Nährstoffe für die Kultivierung kommen die allgemein zu diesem Zweck verwendeten Stoffe in Frage. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose und Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt Hefoextrakte, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Gluten, Natriumglutamat. Harnstoff, Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat Ammoniumnitrat und Ammoniumlactat und Nitrate, wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat Weitere geeignete anorganische Salze sind beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Calciumchlorid. Als Spurenelemente können Borsäure, Kupfersulfat Eisen(III)-chlorid, Mangansulfat Natriummolybdat und Zinksulfat verwendet werden.

Die Bedingungen, unter denen die aeroben Bakterien bebrütet werden, werden vorteilhaft auf den verwendeten Bakterienstamm und/oder das Kulturmedium abgestimmt Gewöhnlich wird die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C für eine Dauer von 1 bis 6 Tagen durchgeführt.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden die gewünschte Pürinbase der allgemeinen Formel (II) einerseits und ein oder mehrere Nucleoside und/oder Nucleotide als Lieferant einer Ribosyl- bzw. Desoxyribosylgruppe andererseits mit den Bakterienzellen oder dem durch die Bakterien gebildeten Enzymsystem zusammengeführt Bei dieser Reaktion wird der pH-Wert des Mediums zwischen etwa 4 und 10 gehalten, jedoch kann in einigen Fällen ein pH-Wert

von 5,0 bis 8$ erforderlich sein. Die Temperaturen liegen im Bereich von etwa 20 bis 50⁰C

Es ist zu betonen, daß für die Übertragungsreaktion die Anwesenheit eines Phosphats erforderlich ist In . einigen Fällen, iio denen beispielsweise die Enzymquelle mit dem Phosphat verunreinigt ist oder in denen Nucleotide zusammen mit Phosphomonoesterase oder Pyrophosphatase verwendet werden, ist jedoch der Phosphatzusatz unnötig. Die Phosphatkonzentration im Reaktionsgemisch betragt 0,i bis 100 mMol/L jedoch kann sich eic zu hoher Phosphatüberschuß nachteilig auf die- Bildung- der gewünschten Purinnucleoside auswirken. > - , - '■■'

Die im Reaktionsmedium angereicherten gewünschten Purinnucleoside werden nach bekannten Methoden isoliert Beispielsweise=-, kann die Abtrennung, durch Ausnutzung des Unterschiedes in der Löslichkeit in den verschiedenen Lösungsmitteln zwischen der gewünschten Verbindung und den Verunreinigungen, des Unterschiedes in den Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Lösungsmittelschichten, des Unterschiedes in der Adsorbierbarkeit an Adsorptionsmitteln wie Aktivkohle oder Ionenaustauschharzen, des Unterschiedes in der Dialysierbarkeit durch eine haibdurchlässige Membran oder des Unterschiedes in der Kristallisierbarkeit aus einem Lösungsmittel sowie durch Filtration oder Zentrifugieren des Reaktionsgemisches mit oder ohne Zusatz von Filterhilfsstoffen erfolgen. In der Praxis werden diese Methoden zur Trennung oder Isolierung je nach der gewünschten Reinheit und dem Zustand der Produkte in Kombination oder wiederholt durchgeführt

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf das Gewicht Sämtliche Ausbeuten an Purinnucleosiden werden als molare Ausbeuten, bezogen auf die Menge der eingesetzten Base, in Molprozent angegeben. Die verwendeten Stämme von aeroben Bakterien sind bei der American-Type Culture Collection (ATCC), Washington, D. C, USA, beim Northern Utilization Research Branch, U. S. Dept of Agriculture (NRRL), Peoria, (IL, USA, und beim U. S. Department of Agriculture (USDA) hinterlegt und tragen die Hinterlegungsnummern, die aus den obengenannten Abkürzungen mit einer Zahl bestehen.

wäßrigen O.OlOmolaren Lösung von 5'-Thymidylsäure, 0,1 ml einer l.Omolarjen Acetatpufferlösung vom pH 5^75,0,05 mlder in der beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle und 0,15 ml Wasser wurde 6.0 bzw. 120 Minuten bei l37⁹C gehalten, worauf die Ausbeute an Desoxyribosiden ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 genannt

Tabelle 1

Base

Ausbeute (Molprozent) 60 Minuten 120 Minuten

2,6-Diaminopurin
2-Aminopurin

68,2
,68,9

Beispiel 2

74,2 76,0

45

Beispiel 1

Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck, ATCC-9621 wurde über Nacht bei 28°C auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur kultiviert, die 1% Glucose enthielt. Fünfundzwanzig 200-ml-Kolben, die je 40 ml eines wäßrigen Kulturmediums enthielten, wurden mit den Zellen beimpft wobei jeweils eine Übertragung mit einer Öse vorgenommen wurde. Das Medium bestand aus Dextrin (20,Oi g), Polypepton (10,0 g), Fleischextrakt (10,0 g), Dikaliuihhydrogenphosphat (1,0 g), Natriumchlorid (5,0 g) und sterilisiertem Leitungswasser (1 Liter) und war auf pH 7,2 eingestellt Das beimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet Nach der Bebrütung wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert Die Zellen wurden mit 0,8%iger wäßriger Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert.

Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 1 genannten Base, 0,5 ml Vibrio percolans, Mudd et Warren, NRRL, S-31 wurde über Nacht bei 28°C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert der 1% Glucose enthielt. Mit den Bakterienzellen wurde 1 Liter eines Kulturmediums geimpft das die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel 1 verwendete Medium hatte. Anschließend wurde 2 Tage bei 28° C unter Schütteln kultiviert. Danach wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert Die Zellen wurden mit einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert um die Enzymquelle herzustellen.

Ein Gemisch von 10 ml einer wäßrigen 0,02molaren Lösung von 2-Aminopurin bzw. 2,6-Diaminopurin, 10 ml einer wäßrigen 0,05molaren Lösung von Thymidin, 2 m! einer wäßrigen 0,5molaren Lösung von Dikaliumhydrogenphosphat 8 ml einer 0,5molaren tris-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 und 10 ml der obengenannten Enzymquelle wurde 2 Stunden bei 37° C gehalten, wobei 90% des 2-Aminopurins bzw. 82% des 2,6-Diaminopurins in die entsprechenden Desoxyribonucleoside umgewandelt wurden.

Beispiel 3

Erwinia aeroidae (Townsend). Holland, ATCC-15390 wurde 2 Tage bei 28°C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert der 1% Glucose enthielt.

Ein Kulturmedium (250 ml) in einem 1-Liter-Kolben wurde mit den Zellen geimpft (7 Ösen). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel 1 verwendete Medium. Anschließend wurde 4 Tage bei 28°C unter Schütteln bebrütet Danach wurden 200 ml der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert Die Zellen wurden mit einer 0,8%igen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 2 genannten Basen, 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Inosin, 0,1 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung von pH-Wert 5,75 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 120 Minuten bzw. 60 Minuten bei 37°C gehalten, worauf die Ausbeute an den Basen entsprechenden Ribosiden ermittelt wurde. Die in Tabelle 2 genannten Ergebnisse wurden erhalten.

Tabelle 2

' Ausbeute (Molprozent)
60 Minuten 120 Minuten

2,6-Diaminopurin
2*Aminopurin

62
49

Beispiel 4

90
54

Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Enzymquelle aus Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck, ATCC-9621 hergestellt.

Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 3 genannten Basen, 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Guanosin, 0,2 ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,9 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,1 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 80 Minuten bei 37° C gehalten, worauf die Ausbeute an den Basen entsprechenden Ribosiden bestimmt wurde. Dje Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 genannt

Tabelle 3

Base

Ausbeute
(Molprozent) wobei 54% des 2-Aminopurins in 2-Aminopurinribosid umgewandelt wurden.

Beispiel 7

Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck, ATCC-9621 wurde über Nacht bei 28°C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt Ein Kulturmedium (100 ml) in einem 500-ml-Kolben wurde mit den Zellen geimpft (1 öse). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das im . Beispiel 1 verwendete Medium. Die Zellen wurden 2 Tage bei 28° C unter Schütteln bebrütet Die Zellen wurden abgetrennt, mit einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser suspendiert (80 ml).

Ein Gemisch aus 0,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Uridin, 0,2 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von 2,6-Diaminopurin, 0,1ml einer 1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,75 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 120 Minuten bei 37° C gehalten, worauf 87% des 2,6-Diaminopurins in 2,6-Diaminopurinribonucleosid umgewandelt wurden.

Beispiel 8

2,6-Diaminopurin 76

2-Aminopurin 62

Beispiel 5

Erwinia aroideae (Townsend), Holland, ATCC-15390, wurde über Nacht bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt Ein Kulturmedium (250 ml) in einem 1-Liter-Kolben wurde mit den Zellen (1 öse) geimpft Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel 1 verwendete Medium. Die Kultivierung wurde 4 Tage bei 28° C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt Dann wurden 200 ml der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert Die Zellen wurden nut einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung einer Enzymquelle in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert

Ein Gemisch aus 50 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von 2j6-Diaminopurm, 10 ml einer wäßrigen 0,01molaren Lösung von 5'-Cytidylsäure, 10 ml einer wäßrigen 0,01 molaren Lösung von 5'-Uridylsäure, tOO ml einer O^molaren Trismaleat-Pufferlösung vom pH-Wert 5,6 und 50 ml der obengenannten Enzymquelle wurden 15 Minuten bei 37°C gehalten, wobei 383% des 2£-Diaminopurms in 2,6-Diammopurmra>onudeosid umgewandelt wurden.

Beispiel 6

Die gemäß Beispiel 5 hergestellte EnzymqueUe wurde verwendet Ein Gemisch ans 05ml einer wäßrigen 0,05molaren Lösung von Uridin, W ml einer wißngen OjOOSmolaren Lösung von 2-Aminopurm, 0,1 ml einer lmolaren Acetatpnffertösang vom pH-Wert 575 (die 10 mMol iCalimrialhydrogeophosphat enthielt) und 02 ml der EnzymqueBe wurde 120 Minuten bei 37°C gehalten.

Die in Tabelle 4 genannten Mikroorganismen wurden über Nacht bei 28° C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt Mit den Zellen (1 öse) wurde ein Kulturmedium (40 ml) geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel 1 verwendete Kulturmedium hatte. Die Kultivierung wurde 2 Tage bei 28° C unter Schütteln durchgeführt Die Zellen wurden abgetrennt und mit einer 0,8%igen wäßrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert

Ein Gemisch aus 1,0 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung der in Tabelle 4 genannten Purinbasen, 2,5 ml einer wäßrigen 0,005molaren Lösung von Cytidindesoxyribosid, 1,0 ml einer 0,5molaren Tris-Pufferlösung vom pH-Wert 7,5 (die 10 mMol Phosphatpufferiösung enthielt) und 0,5 ml der obengenannten Enzymquelle wurde 60 Minuten bei 37°Cgehaiten.

Nach der Reaktion wurde der pH-Wert des Gemisches mit Essigsäure unter Kühlung mit Eis auf 5,C eingestellt Die gebildete Fällung wurde durch Zentrifu gieren entfernt Zur oben stehenden Flüssigkeit (2 ml wurde Aktivkohle (300 mg) gegeben. Das Gemisd

wurde 1 Stunde mit Eis gekohlt Die Aktivkohle wurd durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewä sehen und mit einer 5%igen wäßrigen Perchlorsäurelc sung (3 ml) zusammengegeben. Das Gemisch wurde 6 Minuten gekocht und dann zentrifugiert, wobei die obe

to stehende Flüssigkeit abgetrennt wurde. Die erhalten Fällung wurde mh einer 5%igen wäßrigen Perchlorsäi relösung gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde m der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen od< stehenden Flüssigkeit vereinigt Der Umsatz jedi Purinbase in das entsprechende Desoxypurinnudeos wurde durch Umsetzung mit Diphenylamin ui anschließende Kolorimetrie bestimmt Die erhalten« Ausbeuten sind in Molprozent in Tabelle 4 angegebea

609 682/1

Tabelle 4

ίο

Mikroorganismen

Ausbeute (Molprozent), ausgehend von
2-Aminopurin 2,6-Diiiminopurin Isoguanin

Aerobacter aerogenes (Kruse), Beijerinck,

ATCC-9621. A

Erwinia aeroideae (Townsend), Holland,

ATCC-15390.B

Pseudomonas putrefaciens (D. et H. Long et Hammer), ATCC-8071, C

Aeromonas hydrophile (Chester), Stanier, NRRL, B-909. D

Bacillus brevis Migula emend. Ford,

ATCC-9999, E

Bacillus sphaericus, Neide, USDA-344, F Bacterium cadaveris, A^TX:C-9760, G Corynebacterium sepedonicum (Sp. et K.), Skaptason et Burkholder, ATCC-15 391, H

Das Zeichen »—« bedeutet, daß die Verbindung nicht getestet wurde.

—	—	27,5
—	—	55
—	—	29,5
68	59	—
42	42	—
71 68 46	70 62 47	—

ίο Beispiel 9

Auf die im Beispiel 8 beschriebene Weise wurden verschiedene Purinbasen mit Uridin an Stelle von Cytidindesoxynbosid umgesetzt wobei die in Tabelle 5 _genannten Ergebnisse erhaltein wurden. Mit den Buchstaben sind die gleichen Mikroorganismen wie in Tabelle 4 bezeichnet

TabeUe 5

Ausbeute (Molprozent), Mikroorganismus ausgehend von AB

Isoguanin

2-Aminopurin

2,6-Diaminopurin

28

52

87	55	77	62	48
78	49	72	59	45

Das Zeichen »—« bedeutet, daß die Verbindung nicht getestet wurde.

Claims

Formel

Patentanspruch: J^

"\,_»Verfahren zuV Herstellung von Purinnucleosiden \" -j ,der allgemeinen Formel I ·■" . _; s

R*

^CH