DE1420112B2 - Verfahren zur Herstellung von 5' Nucleotiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 5' NucleotidenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden (Adenosin-5'-monophosphat,
Guanosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-monophosphat, Inosin-5'-monophosphat)
aus Ribonucleinsäure (RNS) durch mikrobielle Wirkung einer 5'-Phosphodiesterase. 5'-Nucleotide
waren bisher nur schwer z. B. durch organische Synthese oder durch Extraktion von Geweben
verschiedener Organismen wie Säugetiermuskeln zu erhalten. Aufgabe der Erfindung ist ihre wirtschaftliche
Gewinnung in guter Ausbeute aus Ribonucleinsäure unter Verwendung der Enzyme von Mikroorganismen.
Ein chemischer Abbau von RNS führt zur Bildung von 3'- und 2'-Nucleotiden und nicht zu 5'-Nucleotiden.
Darüber hinaus bauen gewöhnliche Ribonucleodepolymerasen ohne Berücksichtigung der Ursprungsart die RNS zu 3'- (oder 2'-)Nucleotiden, jedoch nicht
zu 5'-Nucleotiden ab. Nur die Phosphodiesterasen, die z. B. aus einer Giftschlange oder der Darmschleimhaut
isoliert werden können, bauen RNS zu 5'-Nucleotiden ab. Jedoch ist es sehr schwierig, große Mengen dieser
Enzyme zu erhalten.
Es konnte nun festgestellt werden, daß die Stämme von Penicillium citrinum 5'-Phosphodiesterasen enthalten,
die in spezieller Weise die Phosphodiesterbindungen (C3 ·— O-— P — O — C5) in Ribonucleinsäure
hydrolysieren und die 5'-Nucleotide Adenosin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-monophosphat
und Uridin-5'-monophosphat erzeugen.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden durch
enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäure mit Hilfe von in Kulturmedien von Mikroorganismen enthaltenen
Enzymen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Kulturmedien von Stämmen der Art Penicillium
citrinum einsetzt und die enzymatische Reaktion unter Bedingungen durchführt, unter denen die
Aktivität der darin enthaltenen Phosphatase gehemmt wird. So kann beispielsweise bei einer Temperatur von
60 bis 650C und einem pH-Wert von 5 bis 5,3 gearbeitet
werden. Unter den Bedingungen dieser Verfahrensvariante wird die in dem Kulturmedium enthaltene
Adenylsäuredeaminase inaktiviert und keine 5'-Inosinsäure gebildet. Es kann aber auch in an sich
bekannter Weise bei 30° C in Gegenwart von 0,01 n-Natriumfluorid gearbeitet werden, wobei 5'-AdenyIsäure
teilweise in 5'-Inosinsäure umgewandelt wird.
Ribonucleinsäure wird zu 5'-Nucleotiden durch 5'-Phosphodiesterase abgebaut, die in lebenden Zellen,
trockenen Zellen, Kulturfiltraten oder Zellextrakten der oben beschriebenen Mikroorganismen enthalten
ist. Die 5'-Phosphodiesterase enthaltenden Mikroorganismen sind in der Lage, auf festen oder flüssigen
Medien zu wachsen. Für die wirtschaftliche Massenerzeugung sind die flüssigen Medien geeigneter. Als
Nährstoffe der Kulturmedien können in wirksamer
ίο Weise die üblichen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff
und verschiedene anorganische Salze verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt ein ein-
und zweistufiges Verfahren. Bei dem einstufigen Verfahren wird das Züchten der Mikroorganismen und
der enzymatische Abbau der RNS gleichzeitig ausgeführt, wobei ein Nährmedium angewendet wird, das
RNS enthält. Beim zweistufigen Verfahren wird das Züchten der Mikroorganismen und der enzymatische
Abbau der RNS getrennt durchgeführt.
Erfindungsgemäß ist es nicht notwendig, die Ribonucleinsäure vor ihrem enzymatischen Abbau zu
reinigen. Als geeignetes Ausgangsmaterial können rohe Lösungen, die RNS enthalten, z. B. Hefeextrakte,
verwendet werden. Darüber hinaus können in wirksamer Weise mikrobielle Zellen, die zur Erzeugung
von 5'-Phosphodiesterase gezüchtet werden, zusätzlich als Quelle für die Ribonucleinsäure verwendet werden.
Freie 5'-Nucleotide oder ihre Alkalisalze, insbesondere Inosin-5'-monophosphat und Guanosin-5'-monophosphat,
verstärken oder erhöhen in hier nicht beanspruchter Weise den Wohlgeschmack von Nahrungsmitteln,
Getränken und Würzen, wenn sie ihnen zugemischt werden.
50 ml einer wäßrigen Kultur, die 5 % Glucose, 0,5% Polypepton, 0,05% einbasisches Kaliumphosphat,
0,05% zweibasisches Kaliumphosphat, 0,04% Magnesiumsulfat und 0,04 % Calciumchlorid enthielt,
wurde sterilisiert und mit einer reinen Kultur von Penicillium citrinum beimpft. Nach einer 5 Tage
dauernden Oberflächenbebrütung bei 3O0C wurde das Mycel von der Kulturbrühe getrennt und mit sterilisiertem
Wasser gewaschen. Das gewaschene Mycel wurde mit 50 ml einer 0,5%igen Hefe-Ribonucleinsäure-Lösung,
die 0,01 n-Natriumfluorid enthielt, bei 30° C bebrütet. Nach 22,5 Stunden wurde das Mycel
entfernt. In der erhaltenen Reaktionsmischung wurden 70 bis 80 mg Mononucleotide, 80 bis 90 mg Nucleoside
und 70 bis 80 mg Polynucleotide gefunden. Die in der obigen Mischung enthaltenen Mononucleotide wurden
als Cytidin-5'-monophosphat, Adenosin-5'-monophosphat, Inosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat
und Guanosin-5'-monophosphat identifiziert. Die Identifizierung wurde wie folgt ausgeführt:
23 ml der Reaktionsmischung wurden mittels einer starken Natriumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt.
2,5 ml einer 20%igen Bariumacetatlösung wurden hinzugegeben. Der sich bildende Niederschlag von
Bariumphosphat wurde entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mittels einer kleinen Menge Essigsäure
auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. 1 ml Quecksilberacetatlösung (20% in 2%iger Essigsäure)
wurde hinzugefügt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, gewaschen und in Wasser suspendiert. Um die
Nucleotide abzutrennen, wurde in die Suspension Schwefelwasserstoffgas eingeleitet. Die Mischung wurde
filtriert und der Niederschlag mit heißem Wasser gewaschen. Die beim Waschen erhaltene Lösung wurde
mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt und ein Teil der vereinigten Lösung wurde auf pH 8,5 eingestellt
und in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,0 und 23 cm Höhe, beschickt mit einem Anionenaustauschharz,
gebracht und mit 0,003 n- und 0,010 n-Salzsäure eluiert. Je 80 Tropfen des Eluates wurden
in ein Versuchsröhrchen gesammelt, bei einer optischen Dichte von 260 ιτιμ wurde jedes Eluat gemessen.
Es wurden fünf ultraviolett absorbierende Fraktionen A, B, D, C und E erhalten. Die Eigenschaften dieser
Fraktionen werden in den folgenden Tabellen aufgezeigt.
Tabelle I Erhaltene Nucleotid-Fraktionen
max. (ΐημ)*)
°/0 Farbentwicklung (Pentose-Orcinol-Reaktion)**)
7 Minuten
15 Minuten
25 Minuten
35 Minuten
45 Minuten
Carbazolreaktion
Wanderungsabstand von Anfang zur Anodenseite durch Elektrophorese (cm)***)
NaIO4-Rosanilin-Reaktion
| A | B | Fraktionen C |
D |
| 275 | 258 | 249 | 262 |
| 78,7 94,2 100,0 96,0 93,9 |
82,2 98,9 100,0 96,8 92,6 |
||
| blau | blau | ||
| 4,9 | 4,9 | 12,5 | 14,7 |
252
81,6 97,2 100,0 96,3 92,8
blau
Tabelle II Standard-Substanzen
| Cytidin- 3'-mono- phosphat |
Adenosin- 3'-mono- phosphat |
Adenosin- 5'-mono- phosphat |
Inosin- 5'-mono- phosphat |
Uridin- 3'-mono- phosphat |
Guanosin- 3'-mono- phosphat |
| 278 | 257 | 257 | 250 | 262 | 257 |
| 80,4 95,7 100,0 95,4 92,1 |
42,5 80,2 98,3 100,0 99,1 |
||||
| purpur | blau | blau | purpur | ||
| 4,9 | 5,0 | 4,5 | 12,5 | 15,0 | 8,8 |
Mischung
von
3'-nucleo-
3'-nucleo-
tide
max. (ΐϊΐμ)*)
°/o Farbentwicklung (Pentose-Orcinol-Reaktion)
7 Minuten
15 Minuten
25 Minuten
35 Minuten
45 Minuten
Carbazolreaktion
Wanderungsabstand von Anfang zur Anodenseite
durch Elektrophorese (cm)***)
NalOi-Rosanilin-Reaktion
258
39,6 72,8 94,7 99,0 100,0
purpur
14,8 8,7 4,7
*) Die Ultraviolettadsorptionsspektren der Standardsubstanzen wurden in 0,In-HCl gemessen.
*♦) Die angewandte Technik entsprach im wesentlichen der von A 1 b a u m und U m b r e i t (J. Biol. Chem., 167, S. 369 [1947]).
***) Die Ausgangslinie lag 5 cm vom Ende der Kathodenseite und 26 cm vom Ende der Anodenseite.
Aus den in den Tabellen gezeigten Ergebnissen ist zu entnehmen, daß die ultraviolett absorbierenden
Substanzen, die in den Fraktionen A, B, C, D und E enthalten sind, Cytidin-S'-monophosphat, Adenosin-5'-monophosphat,
Inosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat und Guanosin-5'-monophosphat sind. Wahrscheinlich wurde das in diesem Beispiel
festgestellte Inosin-5'-monophosphat sekundär aus dem Adenosin-5'-monophosphat durch die Wirkung
einer in Penicillium citrinum enthaltenen Deaminase gebildet. Die Bildung von Xanthosin-5'-monophosphat
wurde nicht beobachtet.
Für die Bildung von 5'-Phosphodiesterase ist eine Schüttelkultur wirksamer als eine Oberflächenkultur.
Das im Beispiel 1 verwendete Kulturmedium wurde mit Penicillium citrinum beimpft. Das beimpfte Wachstumsmedium
wurde auf einer Umkehr-Schüttelmaschine bei 300C geschüttelt. Nach 7 Tagen wurden die
Kulturnitrate im Vakuum konzentriert und dann gegen fließendes Wasser über Nacht dialysiert. Zu der dialysierten
Lösung wurden 4 Volumteile Äthanol gegeben. Der entstandene Niederschlag, welcher eine
hohe 5'-Phosphodiesterase-Wirksamkeit aufwies, wurde in einem Trockengefäß getrocknet und als Enzympräparat
verwendet. Aus 1 Liter Kulturfiltrat wurde etwa 1 g des Präparates erhalten. 1 mg dieses Präparates
wurde mit 200 ml einer 5°/oigen RNS-Lösung bei 650C und einem pH von 5,0 angesetzt. Unter diesen
Bedingungen sind Phosphomonoesterase und Adenyldeaminasc inaktiv, während 5'-Phosphodiesterase ihre
starke Wirksamkeit behält. Die Reaktion nahm folgenden Verlauf:
5'-Nucleotidbildung
aus Ribonucleinsäure, °/0
aus Ribonucleinsäure, °/0
Anorganische Phosphatbildung aus
5'-Nucleotiden, °/0
5'-Nucleotiden, °/0
Inkubationszeit (Minuten)
0 I 10 I 30 I 60 I 90
0 I 10 I 30 I 60 I 90
3,0
68
3,5
96
4,5
Es konnte festgestellt werden, daß sich in der Reaktionsmischung Adenosin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat,
Cytidin-5'-monophosphat und Uridin-5'-monophosphat ansammelten. Die angesammelten
5'-Nucleotide wurden durch übliche Mittel gereinigt. Die Ausbeute jeder der 5'-Nucleotide beträgt
1,3 bis 2,0 g in freier Form.
5
5
~Beispiel3
10 Liter eines wäßrigen Kulturmediums, das 550 g süßer Kartoffelstärke, 160 ml Fischextrakt (Gesamtstickstoff
4,4%), 5 g einbasisches Kaliumphosphat, 5 g zweibasisches Kaliumphosphat und 4 g Magnesiumsulfat
enthielt, wurden auf pH 5,6 eingestellt und mit Penicillium citrinum Thorn 1131 beimpft. Das beimpfte
Medium wurde in einer Flaschenfermentationsvorrichtung bei 300C belüftet. Nach 72 Stunden wurden
die Zellen von der Kulturflüssigkeit getrennt. Die Kulturflüssigkeit wurde mit 3 Volumteilen Futterhefeextrakt,
der 0,5 % Ribonucleinsäure enthielt, bei 60 bis 65°C und pH 5,3 für 3 Stunden angesetzt. Während
der Umsetzung wurde die in dem Hefeextrakt vorhandene Ribonucleinsäure vollständig zu Adenosin-5'-monophosphat,
Guanosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat und Cytidin-5'-monophosphat abgebaut.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden durch enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäure
mit Hilfe von in Kulturmedien von Mikroorganismen enthaltenen Enzymen, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Kulturmedien von Stämmen der Art Penicillium citrinum einsetzt
und die enzymatische Reaktion unter Bedingungen durchführt, unter denen die Aktivität der darin
enthaltenen Phosphatase gehemmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur von 60 bis 650C
und einem pH-Wert von 5 bis 5,3 oder bei 30°C in
Gegenwart von 0,01 n-Natriumfluorid gearbeitet wird.
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