DE2835151C2

DE2835151C2 -

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Publication number: DE2835151C2
Application number: DE19782835151
Authority: DE
Inventors: Takashi Kawasaki Kanagawa Jp Utagawa; Takeshi Fijisawa Kanagawa Jp Miyoshi; Hirokazu Kawasaki Kanagawa Jp Morisawa; Akihiro Yokosuka Kanagawa Jp Yamazaki; Fumihiro Fujisawa Kanagawa Jp Yoshinaga; Koji Yokohama Kanagawa Jp Mitsugi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1977-08-10
Filing date: 1978-08-10
Publication date: 1988-07-14
Also published as: GB2006185A; FR2400033B1; DE2835151A1; GB2006185B; NL7808321A; FR2400033A1; CA1120876A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-purinen mit Hilfe eines enzymatischen Prozesses.

Purin-arabinoside (9-(β-D-Arabinofuranosyl)-purine) besitzen Anwendungsmöglichkeiten als Agrikulturchemikalien oder thera peutische Mittel. So wurde beispielsweise berichtet, daß Adenin-arabinosid, eines der Purin-arabinoside, erfolgreich zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten, die durch Herpes-Viren verursacht werden, einschließlich Windpocken und Gürtelrose (Herpes) verwendet werden.

Als Methoden zur Herstellung von Purin-arabinosiden wurden bereits verschiedene chemische synthetische Methoden ausge arbeitet, die in J. Org. Chem. 27, 3274, (1962); J. Org. Chem. 28, 3004 (1963); J. Org. Chem. 32, (1976); Tetrahedron Letters 1970, 4673; und der japanischen ausgelegten Patent anmeldung Nr. 7 271/1972 beschrieben sind. Es wurde weiter hin berichtet, daß Adenin-arabinosid gebildet wird, wenn Streptomyces antibioticus in einem üblichen Kulturmedium gezüchtet wird (ausgelegte japanische Patentanmeldung Nr. 41 558/1972).

Die Herstellung von Purinnucleosiden und Derivaten wird in der US-PS 32 69 917 beschrieben. Dabei werden unsubstituierte oder substituierte Purine in Gegenwart von Bakterien als Enzymquelle mit Ribofuranosiddonoren inkubiert und die neu gebildeten Purinnucleoside isoliert.

Es konnte nun gefunden werden, daß Purin-arabinoside in einem wässerigen Reaktionsmedium aus Arabinose-Donoren (Ara binose abgebenden Verbindungen), wie Uracil-arabinosid oder D-Arabinofuranose-1-phosphat und Purinquellen, wie Adenin, Hypoxanthin, Adenosin und Adenosin-5′-monophosphat, unter der Einwirkung eines Enzyms gebildet werden können, das durch verschiedene Bakterien erzeugt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-purinen, das dadurch gekennzeich net ist, daß man
einen Arabinose-Donor, der D-Arabinofuranose-1-phosphat oder eine Verbindung der Formel I

oder deren Phosphat darstellt, in der X für O, S oder NH steht, Y eine OH-, NH₂-, SH- oder SR-Gruppe bedeutet, wobei R eine niedere Alkylgruppe darstellt, und Z ein Wasserstoffatom, Halogenatom, eine NO₂-, CH₃- oder CH₂OH-Gruppe bedeutet, und eine Purinquelle, die ein unsubstituiertes oder 2,6- und/oder 8-substituiertes Purin oder dessen Ribofuranosid, Ribofuranotid, Desoxyribofuranosid oder Desoxyribofurano tid ist,
in einem wässerigen Medium bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 70°C in Gegenwart einer wirksamen Menge eines durch ein Bakterium erzeugten Enzyms hält, das zur Über tragung der Arabinose von dem Arabinose-Donor auf das un substituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle befähigt ist, bis der b -D-Arabinofuranosyl- Rest in 9-Stellung des unsubstituierten oder 2,6- und/oder 8-substituierten Purins gebunden ist, wobei das Enzym aus einem Bakterium der nachstehenden Gruppe stammt:

Pseudomonas stutzeri NRRL B-11346,
Flavobacterium rhenanum NRRL B-11343,
Flavobacterium acidoficum ATCC 8366,
Achromobacter lacticum NRRL B-11340,
Salmonella typhimurum NRRL B-11347,
Citrobacter freundii ATCC 6750,
Klebsiella pneumoniae ATCC 9621,
Serratia liquifaciens ATCC 14460,
Aeromonas salmonicida ATCC 14174,
Erwinia carotovora NRRL B-11342,
Erwinia amylovora NRRL B-11341,
Erwinia herbicola ATCC 14537,
Proteus vulgaris NRRL B-11345,
Proteus rettgeri NRRL B-113344,
Bacterium cadaveris IFO 3731,
Xanthomonas citri NRRL B-11348,
Escherichia coli ATCC 9637, und
Enterobacter aerogenes ATCC 13048.

Die erfindungsgemäßen Arabinose-Donoren bzw. Arabinose ab gebenden Verbindungen sind D-Arabinofuranose-1-phosphat, die Verbindung der Formel I oder das Phosphat der Verbindung der Formel I.

Einzelne der Arabinose-Donoren sind in den nachstehend be schriebenen Beispielen dieser Anmeldung gezeigt.

Die erfindungsgemäßen Purinquellen sind unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purine und deren Ribofu ranoside, Desoxyribofuranoside oder Desoxyribofuranotide. 2,6- und/oder 8-substituierte Purine, die erfindungsgemäß als Purinquelle eingesetzt werden, können mit Hilfe der nachstehenden Methode nachgewiesen werden:
Das Ribofuranosid des 2,6- und/oder 8-substituierten Purins wird mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Enzym in einem wässerigen Medium, das 100 mmol/l/KH₂PO₄ enthält, 24 Stunden lang bei 60°C in Berührung gehalten. Wenn in dem wässerigen Me dium das 2,6- und/oder 8-substituierte Purin des ursprüng lich eingesetzten 2,6- und/oder 8-substituierten Purin-ri bofuranosids und D-Ribofuranose-1-phosphat oder D-Ribose, die sich von dem genannten Ribofuranosid ableiten, in dem wässerigen Medium gebildet werden, so kann das 2,6- und/oder 8-substituierte Purin als Purinquelle verwendet werden.

Als Substituenten der 2,6- und/oder 8-substituierten Purine liegen beispielsweise Halogenatome, Hydroxyl-, Amino-, nie dere Alkyl-, Alkoxyl-, Aryl-, Aralkyl-, Mercapto-, Alkyl amino-, Alkylmercapto-, Alkylsulfonyl-, Alkylsulfenyl-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Cyan- und Nitrogruppen vor.

Die D-Arabinofuranose des Arabinose-Donors wird enzymatisch auf die 9-Stellung des unsubstituierten oder 2,6- oder 8-substitu ierten Purins der Purinquelle übertragen und dort gebunden. Als erfindungsgemäßes Produkt wird somit das unsubstituier te oder 2,6- und/oder 8-substituierte 9-(β-D-Arabinofurano syl)-Purin gebildet.

Das bakterielle Enzym, das zur Transarabinosylierung von dem Arabinose-Donor auf das unsubstituierte oder das 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle befähigt ist, wird hauptsächlich in den Bakterienzellen gebildet und liegt in geringem Ausmaß in dem überstehenden Anteil der Kulturflüssigkeiten vor. Die zur Bildung des Enzyms befähig ten Bakterien gehören, soweit festgestellt wurde, den Ge nera Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Salmonella Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Aero monas, Serratia, Erwinia, Proteus, Xanthomonas und Bacte rium an.

Um unter Anwendung der vorstehend erwähnten Bakterien das Enzym zu bilden, werden die Bakterien in oder auf üblichen Kulturmedien gezüchtet. Die Kulturmedien enthalten gebräuch liche Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren. Zur Züchtung der Bakterien in den gebräuchlichen Medien können übliche Verfahrenswei sen angewendet werden, d. h., Bakterien werden aerob vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 und bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 40°C gezüchtet.

Als Enzymquelle werden vorzugsweise intakte Zellen oder die Zellen enthaltende Kulturflüssigkeiten verwendet. Außerdem können mit Aceton getrocknete Zellen, gefriergetrocknete Zellen, homogenisierte Zellen, mit Ultraschallwellen behan delte Zellen, mit Toluol, oberflächenaktiven Mitteln oder Lysozym behandelte Zellen eingesetzt werden, wobei wün schenswerte Ergebnisse erzielt werden. Darüber hinaus können vorteilhaft als Enzymquelle Proteinfraktionen verwendet wer den, welche die enzymatische Aktivität für die Arabinose übertragung von dem Arabinose-Donor auf das unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle haben. Es wird angenommen, daß mehr als ein Enzym an der Bildung der Purin-arabinoside teilnimmt.

Die Bildung der Purin-arabinoside kann vorgenommen werden, indem die Purinquelle und der Arabinose-Donor in den Kul turmedien der Bakterien gehalten werden. In diesem Fall wer den der Arabinose-Donor und die Purinquelle dem Kulturme dium zugesetzt, nachdem die Bakterien ausreichend gewachsen sind, und dann wird die Temperatur bei 40 bis 70°C gehal ten. Die Bildung der Purin-Arabinoside kann außerdem erfol gen, indem die Purinquelle und der Arabinose-Donor mit den Zellen oder den vorstehend erwähnten Enzymquellen in einem anderen wässerigen Reaktionsmedium als dem Kulturmedium in Berührung gehalten werden. Für die Zwecke der Erfindung soll daher unter der Bezeichnung "wässeriges Medium" das Kulturmedium oder ein Reaktionsmedium (Reaktionsgemisch) verstanden werden. Die Reaktionsmedien werden bei einer Temperatur von 40 bis 70°C und vorzugsweise einem pH-Wert von 4 bis 10 während 5 bis 100 Stunden gehalten.

Die erfindungsgemäße Reaktionstemperatur (40 bis 70°C) ist insofern spezifisch, als diese Temperatur höher als die üb liche Temperatur für enzymatische Reaktionen ist, und ist kritisch.

Die in den Kulturmedien oder den Reaktionsmedien gebildeten Purin-arabinoside können in üblicher Weise gewonnen werden, wie durch Ionenaustausch-Methoden oder Kristallisationsme thoden.

Beispiel 1

Ein wässeriges Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,2 wurde hergestellt, welches pro dl 0,5 g Hefeextrakt, 1,0 g Pepton, 0,5 g Bouillon und 0,5 g NaCl enthielt. 5-ml-Anteile dieses wässerigen Kulturmediums wurden in Reagenzgläser gegeben und zur Sterilisation erhitzt. Je eine Platinöse voll einer Impfkultur der in Tabelle 1 aufgeführten Bakterien wurde in jeden Anteil des wässerigen Kulturmediums eingebracht. Die Züchtung erfolgte bei 30°C während 36 Stunden unter Schütteln. Die in der Kulturflüssigkeit gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die so erhaltenen Zellen (50 mg der feuchten Zellen/ml) wurden in Proben einer 50 mmol/l Phos phatpufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und 0,5 ml der Zellsuspension wurde mit 0,5 ml eines Reaktionsgemisches mit einem pH-Wert von 7,5 vermischt, welches 0,5 g/dl Ura cil-arabinosid, 0,2 g/dl Hypoxanthin und 50 mg/dl KH₂PO₄ enthielt. Jedes Gemisch wurde 15 Stunden bei 60°C gehalten und danach 5 Minuten lang auf 100°C erhitzt.

Jedes Produkt in dem Reaktionsgemisch wurde durch Hochge schwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie als 9-β-D-Ara binofuranosylhypoxanthin (Hypoxanthin-arabinosid) identi fiziert, und die Mengen des Hypoxanthin-arabinosids in dem Reaktionsgemisch wurden ebenfalls mit Hilfe der Hochge schwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Verwendeter MikroorganismusAngereichertes Hypoxanthin-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 3,7 ATCC 8366 6,6 NRRL B-11340 5,7 NRRL B-11347 7,5 ATCC 6750 13,2 ATCC 9637 10,5 ATCC 9621126,0 ATCC 14460 17,0 ATCC 14174 36,0 NRRL B-11342 14,0 NRRL B-11341 18,0 ATCC 14537 21,0 NRRL B-11345 9,6 NRRL B-11344 2,4 NRRL B-11348 11,0 IFO 3731 12,0 NRRL B-11346 7,5 ATCC 13048 55,7

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde nach gearbeitet, mit der Abänderung, daß Adenin anstelle von Hypoxanthin verwendet wurde. Die in dem Reaktionsgemisch gebildeten Mengen an Adenin-arabinosid sind in Tabelle 2 gezeigt.

Beispiel 3

Es wurde die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise an gewendet, wobei Uracil-arabinosid durch Cytosin-arabinosid ersetzt wurde. Die in dem Reaktionsgemisch gebildeten An teile an Hypoxanthin-arabinosid sind in Tabelle 3 gezeigt.

Beispiel 4

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde mit der Abänderung durchgeführt, daß Adenin-ribosid-5′-mono phosphat anstelle von Hypoxanthin verwendet wurde. Dabei reicherte sich in dem Reaktionsgemisch die in Tabelle 4 ge zeigte Menge an Adenin-arabinosid an.
Verwendeter MikroorganismusAngereichertes Adenin-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 4,5 ATCC 8366 8,2 NRRL B-11340 6,5 NRRL B-11347 8,6 ATCC 6750 15,0 ATCC 9637 10,6 ATCC 9621132,0 ATCC 14460 26,0 ATCC 14174 41,0 NRRL B-11342 20,5 NRRL B-11341 22,5 ATCC 14537 31,5 NRRL B-11345 26,3 NRRL B-11344 28,6 NRRL B-11348 13,5 IFO 3731 21,2 NRRL B-113446 8,6 ATCC 13048 71,8 Verwendeter MikroorganismusAngereichertes Hypoxanthin-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 4,2 ATCC 8366 5,5 NRRL B-11340 2,6 NRRL B-11347 4,8 ATCC 675010,3 ATCC 9637 6,3 ATCC 962182,1 ATCC 1446015,0 ATCC 1417420,5 NRRL B-11342 2,6 NRRL B-11341 8,7 ATCC 1453715,0 NRRL B-11345 8,1 NRRL B-11344 0,5 NRRL B-11348 0,8 IFO 373110,6 NRRL B-11346 3,2 ATCC 1304840,2 Verwendeter MikroorganismusAngereichertes Adenin-arabinosid mg/dl

NRRL B-11343 3,8 ATCC 8366 5,6 NRRL B-11340 3,5 NRRL B-11347 8,3 ATCC 6750 8,6 ATCC 9637 5,5 ATCC 962182,3 ATCC 1446013,5 ATCC 1417425,5 NRRL B-1134215,5 NRRL B-1134111,5 ATCC 1453718,3 NRRL B-1134512,6 NRRL B-1134415,8 NRRL B-11348 8,3 IFO 373114,5 NRRL B-11346 8,5 ATCC 1304849,6

Beispiel 5

100-ml-Anteile des in Beispiel 1 gezeigten wässerigen Kul turmediums wurden in 500-ml-Schüttelkolben gegeben und durch Erhitzen sterilisiert. In das wässerige Kulturmedium wurde Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 eingeimpft und dann unter Schütteln 36 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. Die in der erhaltenen Kulturflüssigkeit gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und 30 g (im feuchten Zustand) der Zellen wurden in 1 l eines Reaktionsgemisches vom pH 7,0 gegeben, daß 1,5 g 2-Methylhypoxanthin, 7,3 g Uracil-arabi nosid und 3,4 g KH₂PO₄ enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 36 Stunden lang bei 60°C gehalten.

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus dem Reaktionsge misch entfernt, die überstehende Flüssigkeit wurde durch ein Kationenaustauscherharz (Amberlite® CG-120) geleitet und das Harz wurde mit 0,1 mol/l Ammoniumacetat (pH 6,8) gewaschen. Nach der Elution mit 0,1 mol/l Ammoniumhydroxid wurde das Eluat eingedampft und abgekühlt, wobei 710 mg einer kristallinen Substanz erhalten wurden.

Das kristalline Produkt wurde durch das NMR-Spektrum, UV- Spektrum, IR-Spektrum und durch Elementaranalyse als 9-(β- D-Arabinofuranosyl)-2-methylhypoxanthin (2-Methylhypoxan thin-arabinosid) identifiziert.
Elementaranalyse:

berechnet:C 46,8%; H 5,0%; N 19,8% gefunden:C 46,5%; H 5,1%; N 19,5%

NMR-Spektrum:in Fig. 1 gezeigt UV-Spektrum:in Fig. 2 gezeigt IR-Spektrum:in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 6

30 g der in Beispiel 4 erhaltenen Zellen wurden in 1 l eines Reaktionsgemisches gegeben, das 1,7 g 2-Chlor-hypoxanthin, 7,3 g Uracil-arabinosid und 3,4 g KH₂PO₄ enthielt und das Reaktionsgemisch wurde 36 Stunden bei 60°C gehalten. Nach dem Entfernen der Zellen aus dem Reaktionsgemisch wurde die überstehende Flüssigkeit durch ein Anionenaustauscherharz (Dowex® IX4) geleitet und das Harz wurde mit 0,1 mol/l Ammonium acetat vom pH 6,8 gewaschen. Nach der Elution mit 0,1 mol/l Am moniumacetat vom pH 4,0 wurde das Eluat eingedampft und auf Sephadex G-10 aufgegeben und mit Wasser entwickelt. Die An teile des Eluats, die das erste der beiden UV-Absorptions maxima zeigten, wurden gewonnen, eingedampft und abgekühlt. Dabei wurden 326 mg einer kristallinen Substanz erhalten.

Das kristalline Produkt wurde durch das NMR-Spektrum, UV- Spektrum, IR-Spektrum, durch Elementaranalyse und den Beil stein-Test als 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-2-chlorhypoxanthin (2-Chlorhypoxanthin-arabinosid) identifiziert.
Elementaranalyse:

berechnet:C 39,68; H 3,66; N 18,51 gefunden:C 39,42; H 3,72; N 18,25

NMR-Spektrum:in Fig. 4 gezeigt UV-Spektrum:in Fig. 5 gezeigt IR-Spektrumin Fig. 6 gezeigt Beilstein-Test:positiv (grün).

Beispiel 7

Die Verfahrensweise des Beispiels 1 wurde durchgeführt, wo bei aber Hypoxanthin durch 2-Methylhypoxanthin oder 2-Chlor hypoxanthin ersetzt wurde. Die dabei geschilderten Mengen an 2-Methylhypoxanthin-arabinosid bzw. 2-Chlorhypoxanthin-ara binosid, die in dem Reaktionsgemisch angereichert wurden, sind in Tabelle 5 gezeigt.

Beispiel 8

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde durch geführt, wobei anstelle der 0,2 g/dl Hypoxanthin 0,4 g/dl Inosin verwendet wurden. Die in dem Reaktionsgemisch gebil deten Mengen an Hypoxanthin-arabinosid sind in Tabelle 6 gezeigt.

Beispiel 9

100 ml des in Beispiel 1 beschriebenen wässerigen Kultur mediums wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben gegeben, durch Erhitzen sterilisiert und dann mit Aeromonas salmonicida ATCC 14174 beimpft. Die Züchtung erfolgte 36 Stunden lang unter Schütteln bei 30°C.

Die in der erhaltenen Kulturflüssigkeit gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und 2,0 g (Naßgewicht) der Zellen wurden in 100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5 gegeben, das 100 mg Hypoxanthin, 300 mg Uracil-ara binosid und 50 mg KH₂PO₄ enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Stunden lang bei 60°C gehalten.

Aus dem Reaktionsgemisch wurden 25 mg kristallines Hypo xanthin-arabinosid erhalten.

Tabelle 5

Verwendeter MikroorganismusAngereichertes Hypoxanthin-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 2,8 ATCC 8366 3,6 NRRL B-11340 4,3 NRRL B-11347 6,2 ATCC 6750 7,4 ATCC 9637 1,6 ATCC 962183,3 ATCC 14460 6,2 ATCC 1417416,8 NRRL B-11342 6,8 NRRL B-1134110,2 ATCC 14537 8,9 NRRL B-11345 8,5 NRRL B-11344 0,8 NRRL B-11348 7,2 IFO 3731 5,8 NRRL B-11346 3,3 ATCC 1304840,4

Beispiel 10

Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurde in der in Beispiel 9 beschriebenen Weise gezüchtet. Die Zellen in der resultie renden Kulturflüssigkeit wurden durch Zentrifugieren gewon nen und 2 g (Naßgewicht) der Zellen wurden in 100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5 suspendiert, das 100 mg Hypo xanthin, 300 mg Cytosin-arabinosid, 50 mg KH₂PO₄ enthielt und das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Stunden lang bei 60°C gehalten.

Die Zellen in dem Reaktionsgemisch wurden durch Zentrifu gieren entfernt und ein Konzentrat der überstehenden Flüs sigkeit wurde durch ein Anionenaustauscherharz geleitet (Dosex®-1, OH-Form, pH 6,8). Nach der Elution mit 0,1 mol/l Amei sensäure vom pH 4,0 wurde das erhaltene Eluat durch Sephadex® G-10, geleitet. Das durch Elution mit Wasser erhaltene Eluat (250 ml) wurde konzentriert und dem Konzentrat wurde Methanol zugesetzt und durch Kühlung wurden daraus Kristalle des gewünschten Produkts erhalten. Nach der Umkristallisa tion aus Wasser wurden 35 mg der gereinigten Kristalle er halten.

Das kristalline Produkt wurde durch Vergleich mit authenti schem Hypoxanthin-arabinosid mit Hilfe des NMR-Spektrums, IR-Spektrums und UV-Spektrums identifiziert.

Beispiel 11

Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 gezüchtet und die Zellen wurden durch Zentri fugieren gewonnen.

In dem Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 9 wurde Hypoxanthin durch Adenin ersetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stun den lang bei 60°C gehalten. Die überstehende Flüssigkeit des Reaktionsgemisches wurde auf 20 ml konzentriert. Nach dem Abkühlen des Konzentrats wurden 80 mg der kristallinen Substanz erhalten.

Das kristalline Produkt wurde im Vergleich mit authenti schem Adenin-arabinosid durch das NMR-Spektrum, IR-Spektrum und UV-Spektrum identifiziert.

Beispiel 12

Erwinia hervicola ATCC 14537 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 gezüchtet und die gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen.

Die in einer Menge von 2 g/dl (Naßgewicht) erhaltenen Zel len wurden in 100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5 suspendiert, das 100 ml/dl Adenin, 300 mg/dl Cytosin-arabi nosid und 50 mg KH₂PO₄ enthielt, und das Gemisch wurde 15 Stunden bei 60°C gehalten.

Nach dem Entfernen der Zellen aus dem Reaktionsgemisch wur de dieses auf 20 ml konzentriert und abgekühlt. Die dabei erhaltenen Kristalle wurden aus Wasser umkristallisiert, wobei 55 mg gereinigte Kristalle erhalten wurden. Das kri stalline Produkt wurde im Vergleich mit Adenin-arabinosid durch das NMR-Spektrum, IR-Spektrum und UV-Spektrum identi fiziert.

Beispiel 13

5 g (Naßgewicht)/dl Zellen von Aeromonas salmonicida ATCC 14174 wurden in 100-ml-Anteilen eines Reaktionsgemisches suspendiert, das 30 mmol/l Cytosin-arabinosid, 25 mmol/l KH₂PO₄ und 10 mmol/l eines der in Tabelle 7 gezeigten Purine enthielt. Die Reaktionsgemische wurden in Reagenzgläser gegeben und 15 Stunden bei 60°C gehalten.

Das in dem erhaltenen Reaktionsgemisch neu gebildete Pro dukt, das UV-Absorption zeigte, wurde durch Flüssigphasen chromatographie abgetrennt. Das bei der Chromatographie er haltene Eluat wurde konzentriert und mit Ethanol versetzt, wodurch in dem Eluat Kristalle ausgebildet wurden.

Die erhaltenen gereinigten kristallinen Produkte wurden durch ihre NMR-Spektren und UV-Spektren als Arabinoside der jeweiligen als Ausgangsmaterialien verwendeten Purine iden tifiziert.

Die Umwandlungsrate, in der die Purin-arabinoside aus der entsprechenden Purinquelle erhalten wurden, wurde durch Mes sung des molekularen Extinktionskoeffizienten bestimmt. Die se Werte sind in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Beispiel 14

5 g (Naßgewicht)/dl Zellen von Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurden in 100-ml-Anteilen eines in Reagenzgläsern be findlichen Reaktionsgemisches suspendiert, das 30 mmol/l Uracil- arabinosid, 25 mmol/l KH₂PO₄ und eine der in Tabelle 8 angegebe nen Purinquellen (10 mmol/l) enthielt, und das Gemisch wurde 15 Stunden lang bei 60°C gehalten.

Das in dem resultierenden Reaktionsgemisch neu gebildete Produkt, das UV-Absorption zeigte, wurde durch Flüssigkeits chromatographie abgetrennt. Das bei der Chromatographie er haltene Eluat wurde konzentriert und mit Ethanol versetzt, wobei in dem Eluat Kristalle ausgebildet wurden.

Durch die NMR-Spektren der gereinigten kristallinen Produk te wurden die Produkte als Arabinoside der jeweiligen, als Ausgangsmaterialien verwendeten Purinquellen identifiziert.

Die Umwandlungsrate, in der die Purin-arabinoside aus den verwendeten Purinquellen erhalten wurden, wurde durch Mes sung der molekularen Extinktionskoeffizienten bestimmt. Sie sind in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 8

Beispiel 15

Bei der in Beispiel 5 beschriebenen Methode wurde 2-Methyl hypoxanthin durch 2-Ethylhypoxanthin ersetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde in Silicagel der Dünnschichtchroma tographie unterworfen und das Chromatogramm wurde mit was sergesättigtem Butanol entwickelt. Der Teil mit einem Rf- Wert von 0,4 im Dünnschichtchromatogramm, der eine Absorp tion bei 260 nm zeigte, wurde gewonnen und in 0,1 mol/l HCl suspendiert und das Silicagel wurde aus der Suspension ent fernt.

Die überstehende Flüssigkeit der Suspension wurde mit HCl auf 6 n eingestellt und 10 Minuten gekocht. Die gekochte Suspension zeigte eine positive Orcin-Ferrichlorid-Reaktion und 2-Ethylhypoxanthin wurde in der gekochten Suspension durch Papierchromatographie nachgewiesen. Somit zeigte sich, daß in dem Reaktionsgemisch 2-Ethylhypoxanthin-arabinosid gebildet worden war.

Beispiel 16

Zellen von Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurden in glei cher Weise wie in Beispiel 9 erhalten, in 0,5 mmol/l Phosphat puffer vom pH 7,5 suspendiert, so daß eine Suspension von 100 g (Naßgewicht)/l erhalten wurde, die dann mit Ultra schallwellen behandelt wurde.

100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5, das 50 ml/dl der vorstehend erhaltenen überstehenden Flüssigkeit, 500 mg/ dl Uracil-arabinosid-5-monophosphat, 100 mg/dl Hypoxanthin und 30 mg/dl KH₂PO₄ enthielt, wurde 15 Stunden bei 60°C ge halten. Dann wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen, und die überstehende Flüs sigkeit wurde durch ein Kationenaustauscherharz (Chromo bad C-2) geleitet.

Die Elution erfolgte mit 0,3 mol/l Ameisensäure und das Eluat wurde auf ein Anionenaustauscherharz (Dowex® 1 × 4) aufgege ben.

Hypoxanthin-arabinosid wurde durch Gradientenelution mit Ammoniumformiat vom pH-Wert 9 bis 3 eluiert, wonach aus dem Eluat 8 mg der kristallinen Substanz erhalten wurden.

Beispiel 17

1 ml eines Reaktionsgemisches, welches pro ml 0,2 ml der in Beispiel 16 beschriebenen überstehenden Flüssigkeit, 10 mg Uracil-arabinosid, 2 mg KH₂PO₄, 2 mg einer der nachstehenden Purinquellen enthielt, wurde 15 Stunden lang bei 60°C in einem Reagenzglas gehalten und 5 Minuten auf 100°C erhitzt.

Nach dem Entfernen des Niederschlags aus dem Reaktionsge misch wurde dieses der Papierchromatographie unterworfen und der Flecken, der UV-Absorption zeigte und dessen Rf-Wert verschieden von dem der als Ausgangsmaterialien verwendeten Purinquellen war, wurde herausgeschnitten und in 0,1 mol/l HCl gegeben.

Nach dem Entfernen des Filterpapiers wurde dann die 0,1 mol/l HCl-Lösung durch Zugabe von konzentrierter HCl 6 mol/l gemacht und 10 Minuten gekocht, wonach Arabinose mit Hilfe der Orcin- Ferrichlorid-Reaktion in der gekochten 6 mol/l HCl-Lösung nach gewiesen wurde. Es wird daraus gefolgert, daß in den Reak tionsgemischen die Arabinoside der folgenden als Ausgangs materialien verwendeten Purinquellen gebildet worden sind:

6-Chlorpurin
2-Chlorhypoxanthin
2-Aminopurin
2-Methylthiohypoxanthin
8-Chloradenin
6-Mercaptopurin
6-Methylthiopurin
2-Amino-6-mercaptopurin
6-Carboxypurin
8-Bromadenin

Beispiel 18

Bei der in Beispiel 16 beschriebenen Verfahrensweise wurde Uracil-arabinosid-5′-monophosphat durch Cytosin-arabinosid- 5′-monophosphat ersetzt. In dem gebildeten Reaktionsgemisch wurde Hypoxanthin-arabinosid aufgefunden.
Verwendeter MikroorganismusAngereichertes Hypoxanthin-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 2,8 ATCC 8366 5,5 NRRL B-11340 6,0 NRRL B-11347 5,2 ATCC 6750 10,6 ATCC 9637 8,5 ATCC 9621103,6 ATCC 14460 12,5 ATCC 14174 29,3 NRRL B-11342 15,2 NRRL B-11341 17,6 ATCC 14537 22,3 NRRL B-11345 15,6 NRRL B-11344 3,2 NRRL B-11348 10,6 IFO 3731 18,3 NRRL B-11346 8,2 ATCC 13048 48,5

Beispiel 19

Bei der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise wurde Uracil-arabinosid durch D-Arabinofuranose-1-phosphat er setzt und dabei wurde Hypoxanthin-arabinosid in Mengen in dem Reaktionsgemisch angereichert, die in Tabelle 9 aufge führt sind.

Beispiel 20

Das Verfahren wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 19 durchgeführt, wobei anstelle von Hypoxanthin jeweils eine der in Tabelle 10 angegebenen Purinquellen verwendet wurde. Die neu gebildeten Produkte in dem resultierenden Reaktions gemisch, die UV-Absorption zeigten, wurden durch präparati ve Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie abge trennt. Das bei der Chromatographie erhaltene Eluat wurde konzentriert und mit Äthanol versetzt, wobei in dem Eluat Kristalle ausgebildet wurden. Durch die NMR-Spektren und UV-Spektren der erhaltenen kristallinen Produkte wurden diese Produkte als Arabinoside der jeweiligen Purinquellen identifiziert, die als Ausgangsmaterialien verwendet worden waren.

Die Umwandlungsrate der verwendeten Purinquellen zu den Pu rin-arabinosiden wurde durch Messung des molekularen Extink tionskoeffizienten bestimmt und die entsprechenden Werte sind in Tabelle 10 gezeigt.

Tabelle 10

Beispiel 21

Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 gezüchtet und die gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen.

20 mg der erhaltenen Zellen wurden in 1 ml eines Reaktions gemisches vom pH 7,0 suspendiert, das 1,5 mg Adenin, 10 mg eines der in Tabelle 11 aufgeführten Pyrimidin-arabinoside und 3,4 mg KH₂PO₄ enthielt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60°C gehalten.

Die Zellen wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Zentrifu gieren entfernt. Das angereicherte Adenin-arabinosid wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie iden tifiziert.

Tabelle 11

Arabinose-Donor

4-Thiouracil-arabinofuranosid
4-(S-Methyl-)thiouracil-arabinofuranosid
2-Thiouracil-arabinofuranosid
5-Nitrouracil-arabinofuranosid
5-Hydroxymethyluracil-arabinofuranosid
Isocytosin-arabinofuranosid
5-Fluoruracil-arabinofuranosid
5-Bromuracil-arabinofuranosid
5-Joduracil-arabinofuranosid
Thymin-arabinofuranosid

Beispiel 22

Bei der in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrensweise wurde das Adenin in dem Reaktionsgemisch durch 200 mg Adenylsäure ersetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60°C gehalten. Die überstehende Flüssigkeit des Reaktions gemisches wurde auf 30 ml konzentriert. Nach dem Abkühlen des Konzentrats wurden 48 mg einer kristallinen Substanz erhalten. Das kristalline Produkt wurde im Vergleich mit authentischem Adenin-arabinosid durch das NMR-Spektrum, IR- Spektrum und UV-Spektrum identifiziert.

Beispiel 23

Bei der in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrensweise wurde das Adenin in dem Reaktionsgemisch durch 150 mg Guanosin ersetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60°C gehalten.

Aus der überstehenden Flüssigkeit des resultierenden Reak tionsgemisches wurden 28 mg kristallines 2-(β-D-Arabinofura nosyl)-guanin (Guanin-arabinosid) erhalten.

Beispiel 24

Bei der in Beispiel 13 beschriebenen Verfahrensweise wurden als Purinquellen Adenosin, Desoxy adenosin, Desoxyadenylsäure, Guanylsäure, Desoxyguanylsäure, Xanthosin, Desoxycanthosin, Desoxyinosin oder Desoxyinosin säure verwendet. Aus der vorstehend genannten Adeninquelle wurde in dem Reaktionsgemisch Adenin-arabinosid gebildet, welches in üblicher Weise abgetrennt wurde. Aus der genann ten Guaninquelle wurde Guanin-arabinosid gebildet. Aus der genannten Xanthinquelle wurde Xanthin-arabinosid gebildet. Aus der Hypoxanthinquelle wurde Hypoxanthin-arabinosid ge bildet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-purinen, da durch gekennzeichnet, daß man einen Arabinose-Donor, der D-Arabinofuranose-1- phosphat oder eine Verbindung der Formel I oder deren Phosphat ist in derXfür O, S oder NH steht, Yeine OH-, NH₂-, SH-, SR-Gruppe ist, worin Reine niedere Alkylgruppe ist, darstellt und Zein H- oder Halogenatom, eine NO₂-, CH₃- oder CH₂OH-Gruppe bedeutet undeine Purinquelle, die ein substituiertes oder 2,6- und/oder 8-substituiertes Purin oder dessen Ribofuranosid, Ribofuranotid, Desoxyribofuranosid, Desoxyribofuranotid ist,
in einem wässerigen Medium bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 70°C in Gegenwart einer wirksamen Menge eines durch ein Bakterium erzeugten Enzyms hält, welches zur Arabinose-Übertragung von dem Arabinose-Donor auf das unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle befähigt ist, bis der β -D-Arabinofuranosyl rest in der 9-Stellung des unsubstituierten oder 2,6- und/oder 8-substituierten Purins gebunden ist, wobei das Enzym aus einem Bakterium der nachstehenden Gruppe stammt:Pseudomonas stutzeri NRRL B-11346,
Flavobacterium rhenanum NRRL B-11343,
Flavobacterium acidoficum ATCC 8366,
Achromobacter lacticum NRRL B-11340,
Salmonella typhimurum NRRL B-11347,
Citrobacter freundii ATCC 6750,
Klebsiella pneumoniae ATCC 9621,
Serratia liquifaciens ATCC 14460,
Aeromonas salmonicida ATCC 14174,
Erwinia carotovora NRRL B-11342,
Erwinia amylovora NRRL B-11341,
Erwinia herbicola ATCC 14537,
Proteus vulgaris NRRL B-11345,
Proteus rettgeri NRRL B-11344,
Bacterium cadaveris IFO 3731,
Xanthomonas citri NRRL B-11348,
Escherichia coli ATCC 9637, und
Enterobacter aerogenes ATCC 13048.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß als Substituenten in dem 2,6- und/oder 8-substituierten Purin Halogenatome, Hydroxyl-, Amino-, niedere Alkyl-, Alkoxy-, Aryl-, Aralkyl-, Mercapto-, Alkylamino-, Alkylmercapto-, Alkylsulfonyl-, Alkylsulfenyl-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Nitro- und/oder Cyan-Gruppen vorliegen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß als Substituenten in dem 2,6- und/oder 8-substituierten Purin Amino-, Hydroxyl- und/ oder Mercaptogruppen vorliegen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da durch gekennzeichnet, daß als Purin quelle Adenin, Desoxyadenosin, Desoxyadenylsäure, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Desoxyinosin, Desoxyino sinsäure, Inosinsäure, Guanin, Guanosin, Desoxyguanosin, Desoxyguanlysäure, Guanylsäure, Xanthin, Xanthosin, Desoxy xanthosin oder Xanthylsäure verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da durch gekennzeichnet, daß als Ara binose-Donor 1-β-D-Arabinofuranosyl-cytosin oder 1-β-D- Arabinofuranosyl-uracil verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des wässerigen Mediums bei einem Wert von 4 bis 10 hält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, da durch gekennzeichnet, daß man als Enzym quelle die Zellen des Bakteriums verwendet.