DE3871778T2

DE3871778T2 - Kuenstliche analogen der dns-basenpaare.

Info

Publication number: DE3871778T2
Application number: DE8888908826T
Authority: DE
Inventors: P Rappaport
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 1987-09-22
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2008-09-23
Also published as: AU2527688A; WO1989002921A1; US5126439A; ATE76876T1; DE3871778D1; EP0333832A1; CA1339352C; JPH02501354A; EP0333832B1

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Ausscheidungsanmeldung der Anmeldung mit der Serien-Nummer 099.744, eingereicht beim United States Patent and Trademark Office am 22. September 1987.

Bereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Analoga von DNA-Basenpaaren und Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Analoga.

Beschreibung des Standes der Technik

Das Aufkommen einfacher und rascher Syntheseverfahren für die Synthese von Oligodesoxynucleotiden aus geschützten Desoxynucleotiden führte zu einer großen Anzahl physikalischer und biologischer Untersuchungen an nicht zueinander passenden Basenpaaren (mismatch base pairs) (Aboul-ela, et al., Nucleic Acid Research, 14: 4811, 1985) und Untersuchungen an Basenpaaren, bei denen eine Base ein Analogon ist (Jiricny, et al., Nucleic Acid Research, 14: 6579, 1986).
Die Frage der Möglichkeit der Konstruktion eines Basenpaares, das als zusätzliches komplementäres Basenpaar im Genom der Zellen fungieren kann, war bisher nicht untersucht worden. Die für die Konstruktion komplementärer Basenpaare verwendeten Kriterien sollten die Frage der Beständigkeit der biochemischen Synthese von Desoxynucleosidtriphosphaten aus Basen und/oder Nucleosiden, die Inhibierung essentieller Stoffwechselwege durch Analoga, die Verwertung von Desoxynucleosidtriphosphaten durch DNA- und RNA-Polymerase, die Fehlerhäufigkeit der DNA-Polymerase und die Fehlerkorrektur sowie die Frage der Reparatur nicht zusammenpassender Basenpaare berühren.
Bisher liegen nur sehr wenige strukturelle bzw. quantitative Ergebnisse zur Polymerase-Fehlerfrequenz (Goodman, et al., Journal of Molecular Biology, 88:423, 1974), Polymerase- Fehlerkorrektur und zur Reparatur von nicht zueinander passenden Basenpaaren vor. Diese Fragen wurden dann von Kramer, et al., Cell, 38:879, 1984, weitgehend geklärt. Wichtig für die Konstruktion komplementärer Basenpaare ist ferner die Tatsache, daß die Abhängigkeit der endgültigen Genauigkeit der Reproduktion der genetischen Information von der Stärke der Wechselwirkung zwischen den einzelnen Basen nicht ausschließlich physikalischer Natur ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Oligodesoxynucleotidbasenpaare, die ein mit einem künstlichen Pyrimidin gepaartes künstliches Purin umfassen, wobei dieses in 2- und 6-Stellung Substituenten aufweist, die mit den Substituenten in 2- und 4-Stellung der gepaarten künstlichen Pyrimidine in Wechselwirkung treten, so daß die strukturelle Integrität des Doppelstranges aufrechterhalten wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Basenpaaren aus mit künstlichen Pyrimidinen gepaarten künstlichen Purinen, worin diese in 2- und 6-Stellung Substituenten aufweisen, ausgewählt unter H, O, S und NH&sub2;, und die komplementäre Base ein künstliches Pyrimidin mit Substituenten in 2- und 4-Stellung ist, ausgewählt unter H, O, S und NH&sub2;, so daß die 6-Stellung des künstlichen Purins mit der 4-Stellung des künstlichen Pyrimidins als erste Basenwechselwirkung in Wechselwirkung tritt und die 2-Stellung des künstlichen Purins mit der 2-Stellung des künstlichen Pyrimidins als zweite Basenwechselwirkung in Wechselwirkung tritt, und wenigstens eine der beiden Basenwechselwirkungen H-S ist, und daß, wenn die Basenpaare in einer A, T, C und G enthaltenden doppelsträngigen Gensequenz enthalten sind, die strukturelle Integrität des Doppelstranges aufrechterhalten wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Verbindungen, die als künstliche Purine und künstliche Pyrimidine für den Einbau in eine doppelsträngige Gensequenz als komplementäre Basenpaare verwendet werden können.
Durch die Erfindung werden künstliche Pyrimidine der Formel
bereitgestellt, worin R&sub1; Wasserstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Amino, R&sub2; = Wasserstoff, Schwefel oder Amino und R&sub3; Wasserstoff, Halogen, -SCH&sub3;, -OH, Hydroxymethyl, Alkoxyl, Cyano, Methylamino, Nitro oder nicht substituierte oder durch Halogen substituierte C&sub1;-C&sub3;-Kohlenwasserstoffgruppen bedeuten. Die Erfindung betrifft außerdem Azaderivate in 5 - und/oder 6-Stellung und Deazaderivate in 1-Stellung dieser Verbindungen.
Durch die Erfindung werden ferner künstliche Purine der Formel
bereitgestellt, worin R&sub1; Wasserstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Amino, R&sub2; Wasserstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Amino bedeuten. Die Erfindung stellt außerdem 3-Deaza- und 7- Deazaderivate dieser Verbindungen bereit.
Die Erfindung betrifft somit doppelsträngige Gensequenzen mit Basenpaaren aus Adenin (A) und Thymin (T), sowie Cytosin (C) und Guanin (G), sowie Basenpaare aus mit künstlichen Pyrimidinen gepaarten künstlichen Purinen, worin diese in 2 - und 6-Stellung Substituenten aufweisen, die mit den Substituenten in 2- und 4-Stellung der gepaarten künstlichen Pyrimidine in Wechselwirkung treten, ausgewählt unter einer Wasserstoffbindung und hydrophoben Wechselwirkungen, so daß die strukturelle Integrität des Doppelstranges aufrechterhalten wird. Die künstlichen erfindungsgemäßen Basenpaare weisen ebenso wie die natürlichen Basenpaare zwischen der 1- Purin- und 3-Pyrimidin-Stellung eine Wasserstoffbindung auf. Bei den erfindungsgemäßen Basenpaaren ist wenigstens ein Substituent in der 2- und 6-Purin- oder 2- und 4-Pyrimidin- Stellung Schwefel und der zum Schwefel komplementäre Substituent Wasserstoff. Die Gruppen, welche die Wechselwirkung zwischen den komplementären künstlichen Basenpaaren bewirken, sollten zweckmäßigerweise Schwefel und Wasserstoff, Sauerstoff und Wasserstoff, Sauerstoff und Amino oder Wasserstoff und Wasserstoff sein.
Die künstlichen Purine und künstlichen Pyrimidine sowie ihre Verwendung als Basenpaare stellen einen erheblichen Fortschritt in der Genetik dar. Obwohl bestimmte künstliche Purine und künstliche Pyrimidine bereits bekannt waren, wurden die bisherigen Moleküle nie zur Bildung beständiger Basenpaare verwendet. Die bekannten künstlichen Moleküle wurden zur Inhibierung der Synthese der üblichen Basen sowie zur Nucleosid- bzw. Nucleotidsynthese bzw. zur Destabilisierung der Target-DNA, wie z.B. als Antikrebsagenzien verwendet. Demgegenüber ermöglichen die erfindungsgemäßen gepaarten künstlichen Purine und künstlichen Pyrimidine nicht nur die Aufrechterhaltung eines beständigen DNA-Doppelstranges, sondern auch eine bevorzugte Wechselwirkung zwischen den künstlichen Basenpaaren, selbst in Anwesenheit natürlich vorkommender Basenpaare.
Ein gesellschaftliches Problem, das mit dem Aufkommen der Technik der DNA-Rekombination entstanden ist, sind die Gefahr des Entkommens genetisch veränderter Organismen und deren mögliche schädliche Wirkungen auf die Umwelt. Würde jedoch ein die künstlichen erfindungsgemäßen Basenpaare enthaltender rekombinanter Organismus in die Umwelt gelangen, wäre er aufgrund des Fehlens der erforderlichen künstlichen Purin- und künstlichen Pyrimidinbasen bzw. eines das künstliche Basenpaar enthaltenden Nucleosids nicht zur Replikation befähigt.
Mit den erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaaren können Organismen konstruiert werden, die, selbst wenn sie freigesetzt würden und in die Umwelt gelangten, zur Replikation nicht befähigt sind. Da die künstlichen erfindungsgemäßen Basenpaare von keinem natürlichen Organismus oder einem durch Rekombination modifizierten Wirtsorganismus synthetisiert werden können, verhindert der Einbau der erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaare in das Genom des rekombinanten Organismus die Replikation, sofern nicht die künstlichen Basen von außen, wie z.B. über das Nährmedium, zugeführt werden. Der Wirtsorganismus selbst verfügt nämlich nicht über den Biosynthesemechanismus, der erforderlich ist für die Synthese der erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaare aus anderen Substraten, wodurch der Organismus vollständig abhängig wird von einer äußeren Quelle künstlicher Basenpaare. In ähnlicher Weise kann die Replikationsgeschwindigkeit eines Organismus durch die Steuerung der Konzentration der künstlichen Basen, die im Nährmedium enthalten sind, bzw. dem Organismus zugänglich sind, gesteuert werden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaare liegt darin, daß sie zur Erzeugung rekombinanter Organismen verwendet werden können, bei denen die Replikation des Organismus von bestimmten Stellen im Chromosom des Organismus aus zeitlich abgestimmt verläuft.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1:

(A) zeigt eine schematische Darstellung des Basenpaars, bestehend aus 5-Methyl-2-pyrimidinon als linker Base und 6- Thioguanin als rechter Base. (B) zeigt ein Photo des Basenpaars 5-Methyl-2-pyrimidinon und 6-Thioguanin, abgeleitet vom Basenpaar Cytosin und Guanin. Das Basenpaar Cytosin und Guanin ist drei Basenpaare vom Ende eines Oligodesoxynucleotiddoppelstranges entfernt, was röntgenkristallographisch ermittelt wurde (Dickerson, et al., Journal of Molecular Biology, 149: 761, 1981). Die Aminogruppe des Cytosins, der linken Base, war durch Wasserstoff mit einer Bindungslänge von 1,09 A ersetzt. Die 5-Methylgruppe ist nicht dargestellt. Der Sauerstoff des Guanins, der rechten Base, war durch Schwefel mit einer Bindungslänge von 1,7 A ersetzt. Weitere Veränderungen erfolgten nicht. Die Punkte geben die Länge der Van-der-Waals-Radii für Schwefel (1,8 A) und Wasserstoff (1,2 A) an.

Detaillierte Beschreibung

Die erfindungsgemäßen Basenpaare sollten zweckmäßigerweise folgende Bedingungen erfüllen: 1. Das Basenpaar sollte zur Beständigkeit des Doppelstrangmoleküls beitragen. 2. Es sollte verglichen mit den üblichen Basenpaaren bzw. dem neuen Basenpaar eine erhebliche Diskrimination nach der freien Energie bezüglich der Basenpaarung zwischen den neuen und üblichen Basen bestehen.
Die wichtigsten chemischen und biologischen Gründe für die Wahl der Basenpaare sind: 1. Die Wasserstoffbindung zwischen dem 3-Stickstoff des Pyrimidins und dem 1-Stickstoff des Purins bleibt erhalten, so daß sich die Zahl der Wasserstoffbindungen zwischen den DNA-Molekülen und den Wassermolekülen während der Doppelstrangbildung nicht ändert.
2. Aufgrund der in der Gasphase durchgeführten Spektroskopie kann angenommen werden, daß die H-Bindungsstärkenkonstante für Schwefel nur halb so groß ist wie für Sauerstoff und daß der stabilste Winkel zwischen der X-H-Achse und der Symmetrieachse der S-Bindungen 90 Grad beträgt anstelle von 45 Grad für Sauerstoff.
Andere Substituenten können in verschiedenen Stellungen eintreten, solange diese nicht die Grundfunktion des doppelsträngigen Gensequenzmoleküls unterbrechen oder destabilisieren.
Die Wahl geeigneter künstlicher Purine und komplementärer künstlicher Pyrimidine als Basenpaare wird beeinflußt durch Bindungsfaktoren wie z.B. durch die H-Bindung und hydrophobe Wechselwirkungen sowie durch sterische Faktoren. So z.B. verwenden die erfindungsgemäßen künstlichen Pyrimidine nicht das Jodatom in 4-Stellung, da es durch dieses große Atom häufig zu Problemen mit der sterischen Stabilität kommt.
Das Verhältnis der Assoziationskonstante des Doppelstranges zum Basenpaar G/T verglichen mit A/T in Tabelle IV beträgt 1:3, ein Wert, der um den Faktor 9 über dem in 1 M NaCl von Aboul-ela, et al., (Nucleic Acid Research, 13:4811, 1985) ermittelten Wert liegt. Dieser Wert beruht auf der Interpretation der Änderungen der optischen Dichte während der Schmelze im Rahmen eines Zweizustandmodells. Markey et al. (Biopolymers, 22:1247, 1983) haben gezeigt, daß die kalorische Enthalpie mit zunehmender Ionenstärke von der Van't Hoff'schen Enthalpie abweicht. Das Ergebnis zeigt, daß das Zweizustandmodell in der Berechnung der Assoziationskonstanten zu einem starken Fehler führen kann. Eine unmittelbare NMR-Messung der Assoziationskonstanten zwischen den 7- meren, wobei G/C durch G/T ersetzt sind, bei geringer Ionenstärke und 15ºC ergaben einen Wert von 1:25 (Salisbury, et al., Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 14, 985, 1985). Das entsprechende Verhältnis aus Tabelle IV beträgt 1:42 bei 19ºC. Die überaus starke Abhängigkeit der Beständigkeit von der konkreten Sequenz in Anwesenheit von G/T-Basenpaaren belegen die Kristalle eines aus dem Oligodesoxynucleotid G-G-G-G-T-C-C-C zusammengesetzten, bei Raumtemperatur beständigen Doppelstranges (Kneale, et al., Journal of Molecular Biology, 186:805, 1985), wohingegen Kristalle aus G-G-G-G-C-T-C-C bei über 6ºC schmolzen (Hunter, et al., Journal of Molecular Biology, 190:605, 1986). Allgemein kann angenommen werden, daß die auf einem Zweizustandmodell für das Schmelzen basierenden Werte die Unterschiede in der Beständigkeit überbewerten, wohingegen eine auf der enzymatischen Ligierung von Doppelsträngen beruhende Bewertung die Unterschiede unterbewerten könnte, da Doppelstränge mit einer einzigen teilweisen Basenpaarung als Substrat fungieren können. Die Ähnlichkeit in den Ergebnissen zwischen enzymatischer Ligierung und dem NMR-Verfahren ist somit ein beruhigendes Ergebnis.
Mit Hilfe eines die Base 2-Pyrimidinon und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I enthaltenden Oligodesoxynucleotidtemplats haben Charczuk et al. (Nucleic Acid Research, 14:9530, 1986) schon früher nachgewiesen, daß kein übliches Nucleotid aus 2-Pyrimidinon aufgenommen wurde.
Mit Ausnahme des Basenpaares G/T stimmen die Ergebnisse aus Tabelle IV mit denen von Aboul-ela, et al. (ibid) überein. Beide zeigen, daß die üblichen Basenpaare eine höhere Beständigkeit verleihen als nicht zueinander passende Paare (mismatched pairs) der üblichen Basen. Das Basenpaar 6-Thioguanin und 5-Methyl-2-pyrimidinon bewirkt eine Beständigkeit, die dem üblichen Basenpaar Adenin und Thymin fast gleichkam. Das Paar aus nicht zueinander passenden Basen mit der größten Beständigkeit, und zwar Guanin und 5-Methyl-2- pyrimidinon, weist offensichtlich nicht die für eine weitgehende Polymerisation mit DNA-Polymerase I erforderliche Geometrie auf (Charlczuk, et al., ibid). Die Ergebnisse lassen erkennen, daß das Basenpar 6-Thioguanin und 5-Methyl- 2-pyrimidinon die erforderlichen physikalischen Eigenschaften aufweist, um ein geeignetes komplementäres Basenpaar abzugeben.
Versuche mit Escherichia coli C600 unter Verwendung von Tritium-markierten 6-Thioguanin oder Desoxyribosyl-5-methyl- 2-pyrimidinon ergaben, daß (Desoxy)nucleosidtriphosphate synthetisiert wurden. Äußerst geringe Mengen der einzelnen Basen wurden in die DNA aufgenommen.
Zusätzlich zu dem oben Gesagten sollten die (Desoxy)nucleosidtriphosphate Substrate sowohl für RNA- als auch für DNA- Polymerasen abgeben, und zwar mit Templaten, welche die komplementäre Base enthalten, wobei die Analoga bzw. ihre Derivate keine starken Inhibitoren für die wichtigsten Stoffwechselbahnen sein dürfen. Mischpaarungen zwischen den neuen Basen und den üblichen Basen sollten enzymatisch korrigierbar sein.
Die künstlichen Pyrimidine können außerdem 5- oder 6-Azaderivate darstellen. Steht in 5-Stellung ein C-Atom, kann dieses durch Reste wie Wasserstoff, Halogen, -SCH&sub3;, -OH, Alkoxyl, Cyano, Methylamino, Hydroxymethyl, Nitro und unsubstituierte oder halogensubstituierte C&sub1;-C&sub3;-Kohlenwasserstoffgruppen substituiert sein. Die künstlichen Purine können außerdem 3-Deaza- oder 7-Deazaderivate darstellen.
Wenigstens einer der 2, 6-Purin- oder 2, 4-Pyrimdinsubstituenten ist Schwefel. Ist eine Thioketogruppe in einer Stellung eines Gliedes des künstlichen Basenpaares vorhanden, liegt in der komplementären Stellung des jeweils anderen Gliedes des künstlichen Basenpaares ein Wasserstoffatom vor. Wünschenswert ist es, daß zusätzlich zu den komplementären S-H-Substituenten die künstlichen Basenpaare noch komplementäre O-H- oder O-Amino-Substituenten enthalten. Die 2, 6- Purinsubstituenten können dieselben sein oder andere, wie z.B. Schwefel und Sauerstoff, Schwefel und Amino oder Schwefel und Schwefel. Genauso können auch die 2, 4-Pyrimidinsubstituenten dieselben sein oder andere.
Geeignete künstliche Basenpaare sind:
4-Thioketo-pyrimidin und 2-Thioketo-purin
2-Amino-4-thioketo-pyrimidi- und 2-Keto-purin
2-Thioketo-pyrimidin und 6-Thioketo-purin
2-Thioketo-4-amino-pyrimidin und 6-Keto-purin
2-Keto-4-thioketo-pyrimidin und 2-Amino-purin
2-Thioketo-4-thioketo-pyrimidin und Purin
2-Keto-pyrimidin und 2-Amino-6-thioketo-purin
4-Thioketo-pyrimidin und 2-Keto-purin
4-Keto-pyrimidin und 2-Thioketo-purin
2-Keto-pyrimidin und 6-Thioketo-purin.
Weitere geeignete künstliche Basenpaare, worin die Pyrimidine auch die 1-Deazaderivate (Pyridinderivate) sein können, die Purine jedoch keine 3-Deazaderivate sein dürfen, sind:
2-Amino-pyrimidin und 2-Keto-6-thioketo-purin
Pyrimidin und 2-Thioketo-6-thioketo-purin
4-Amino-pyrimidin und 2-Thioketo-6-keto-purin.
Die in den Basenpaaren verwendeten künstlichen Purine und Pyrimidine können unter Verwendung der dem Durchschnittsfachmann bekannten Techniken synthetisiert werden (s. Nucleic Acid Chemistry, Townsend, et al., Eds., Teil 1 (1978), 2 (1978) und 3 (1986); Zorbach, et al., in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Vol. 1 (1965). Das geeignete Desoxynucleosid einer bestimmten Base kann aus 2-Desoxy- 3, 5-di-O-p-toluoyl-D-erythro-pentosylchlorid synthetisiert werden (Bhat, in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Zorbach, et al., Eds., Vol. 1, S. 521, 1968) und die ensprechend geschützte Base durch: 1. die Silyl-Quecksilber- Methode in Lösung (Birkofer, et al., Angew. Chem., 77:414, 1965) oder durch Verschmelzung (Kotick, et al., Journal of Organic Chemistry, 34:3806, 1969) oder 2. die stereospezifische Na-Salz-Methode (Kazimierczuk, et al., Journal of The American Chemical Society, 106:6379, 1984).
Die Synthese der 3- und 7-Deazapurindesoxynucleoside kann nach der Na-Salz-Methode (Kazimierczuk, et al., ibid) und mit Hilfe geeigneter Derivate (Girgis, et al., Nucleic Acid Research, 15:1217, 1987) durchgeführt werden. Die Synthese der Pyrimidin-c-desoxynucleoside kann mit Methoden analog denen, wie sie von Sato, et al. (in Nucleic Acid Chemistry, Townsend, et al., Eds., Part 3, p. 81, 1978) beschrieben werden, unter Verwendung von Nucleosiden durchgeführt werden.
Die Synthese der 1-Deazapyrimidinderivate (Pyridinderivate) kann mit in der organischen Chemie üblichen Methoden durchgeführt werden. Die Pyridinderivate reagieren mit 2-Desoxy- 3,5-di-O-p-toluoyl-D-erythro-pentosylchlorid in Anwesenheit einer Lewissäure, AlCl&sub3; oder BF&sub3; oder Silberperchlorat, was zu einer elektrophilen Substitution in 3-Stellung des Pyridinderivats führt.
Unter diesen Umständen werden sowohl die α- als auch die β- Anomeren der künstlichen Desoxynucleoside erzeugt. Diese können mit den üblichen Methoden, wie z.B. durch Differentialkristallisation (s. Nucleic Acid Chemistry, Townsend, et al., Eds., Part 2, 1978) oder durch Säulenchromatographie (Lee, et al., J. Org. Chem., 37:2923, 1972) voneinander getrennt werden.
Die Transformation der Wirtsorganismen durch Einbau der erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaare kann durch Aufnahme von DNA in Form linearer Segmente als Teil eines Plasmids oder eines Phagen erfolgen, die zum Einbau seiner Nucleinsäure in das Wirtsgenom befähigt sind. Die Techniken für die Transformation der Wirtszellen sind dem Fachmann allgemein bekannt und werden hier nicht näher beschrieben.
Vorzugsweise enthält die DNA eine Vielzahl künstlicher komplementärer Basenpaare. Außerdem wird die die künstlichen Basenpaare enthaltende DNA-Sequenz vorzugsweise an einer Stelle in einen Bereich des Wirtszellgenoms eingebaut, wie z.B. in ein Intron, bei dem eine signifikante Unterbrechung der genetischen Expression bzw. Wachstumsfähigkeit des Wirtes keine so große Rolle spielt.
Als Wirte für die Transformation mit den erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaaren kommen sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Organismen in Frage, und Aerober gleichermaßen wie Anaerober. Die transformierten Organismen können in wässerigen Medien in geeigneten Fermentern gezüchtet werden. Gewöhnlich werden die wässerigen Medien z.B. bei ca. 37ºC und bei fast neutralem pH gehalten. Sie enthalten die entsprechenden Nährstoffe, wie z.B. Kohlenwasserstoffe oder Glycerin als C-Quelle, N-Quellen wie z.B. Ammoniumsulfat, K-Quellen wie Kaliumphosphat, Spurenelemente, Magnesiumsulfat usw. Kulturmedien und -bedingungen hängen vom jeweiligen Wirtsorganismus ab, sind jedoch allgemein bekannt.
Nach der Konstruktion eines Wirtsorganismus, der die erfindungsgemäßen synthetischen Basenpaare enthält, ist es möglich, die Replikation der Wirtszelle durch Steuerung der Konzentration der künstlichen Basenpaare in den Kulturmedien zu regulieren. Die entsprechende Konzentration an Basenpaaren hängt ab vom jeweiligen Organismus und der Zahl der Basenpaare im Wirtsgenom. Die optimale Konzentration an synthetischen Basenpaaren im Kulturmedium ist von einem Fachmann leicht zu ermitteln.
Die erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaare ermöglichen außerdem die Produktion von rekombinanten Organismen, bei denen die Replikation des Organismus synchron verläuft. Diese Technik kann mit den üblichen Methoden unter Verwendung von Restriktionsenzymen und durch Ligierung zur Einführung einer Sequenz von künstlichen Basenpaaren wie z.B. des Mu-Phagenmutante Mud I (lac, ap) (Casadaban, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 76:4530, 1979) durchgeführt werden. Das Mud-Genom wird fast überall in das E. coli-Chromosom eingebaut und es können Klone selektiert werden, die in einer bestimmten Region eingebautes Mud I enthalten (Casadeban, et al., ibid). In Abwesenheit einer äußeren, die künstlichen Basen enthaltenden Quelle kommt die Replikation zum Stillstand, sobald der Replikationskomplex das künstliche Basenpaar im Chromosom erreicht. Gegebenenfalls gelangen sämtliche Zellen in den Kulturen zur Replikation und bringen diese zum Stillstand an diesem einzigen Site im Chromosom. Die Zufuhr der künstlichen Basen bewirkt andererseits den Start der Replikation sämtlicher Zellen zur selben Zeit und an derselben Stelle. Außerdem ist diese Methode geeignet für sämtliche Prokaryoten, die einen geeigneten Vektor aufweisen, der in das Wirtschromosom eingebaut wird. Da das Eukaryotenchromosom eine Vielzahl einzelner Sites für die Initiierung der Replikation aufweist, ermöglicht in analoger Weise die Verwendung eines einbaufähigen, die erfindungsgemäßen künstlichen Basenpaare aufweisenden Vektors die Steuerung der Synthese der restringierten Bereiche des Eukaryotenchromosoms auf dieselbe Weise, wie oben für die Prokaryoten beschrieben.
Die Erfindung wurde bisher ganz allgemein beschrieben. Für ein umfassenderes Verständnis der Erfindung sorgen die nachfolgenden Ausführungsbeispiele, die lediglich der Illustration dienen und nicht auf eine Einschränkung des Erfindungsumfanges abzielen.

Beispiel 1

Synthese des Basenpaares 6-Thioguanin/5-Methyl-2-pyrimidinon

A. Chemische Stoffe

Die verwendeten chemischen Stoffe und ihre Quellen sind: β- Desoxynucleoside (Fa. Sigma), Benzolthiol (Fa. Eastman), Cetyltrimethylammoniumbromid (Fa. Aldrich), 2-Chlorphenyldichlorphosphat (Fa. Aldrich), 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (Fa. Aldrich), durch langkettiges Alkylamin gesteuertes Porenglas (Fa. Pierce), 1-(Mesity-lene-2-sulfonyl)-3-nitro- 1,2,4-triazole (Fa. Aldrich), Hg-(II)-cyanid (Aldrich), 1-Methylimidazol (Fa. Aldrich), 2-Nitrobenzaldoxim (Fa. Aldrich); p-Nitrophenylacetat (Fa. Sigma), Silbercarbonat (Fa. Aldrich), Kieselerde Woelm TSC (Fa. INC Nutritional Biochemical). Alle Lösungsmittel wurden redestilliert und unter geeigneten wasserfreien Bedingungen gelagert (Sproat, et al., in Gait. M.J. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984).
Die verwendeten Enzyme und ihre Quellen waren: Polynucleotidkinase (Bethesda Research Labs), Schlangengift-Phosphodiesterase (Fa. Sigma), T4-DNA-Ligase (Bethesda Research Labs), Sal I (New England Biolabs.).

B. Synthese von Desoxynucleosiden

1. 2-Amino-9-(2-desoxy-beta-D-ribofuranosyl)-9H-purin-6- thiol (Beta-desoxy-6-thioguanosin).

Das β-Anomer von 2-Acetamid-6-chlor-9H-(2-desoxy-3, 5-di-o-p- toluoyl-D-ribofuranosyl)purin wurde hergestellt nach einem bekannten Verfahren (Roark, et al., Townsend, L.B. and Tipson R.S. (Eds.), Nucleic Acid Chemistry, John Wiley and Sons, Teil 2, 583, 1978). Vom geschützten β-Anomer des 6- Chlorderivats wurde der Schutz entfernt, wonach es gemäß Acton, et al. (in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, Zorback, et al., Eds., Vol 1, 272, 1968) einer Umwandlung in eine Thiaverbindung unterworfen wurde. Der erhaltene Stoff zeigte nach Kristallisation aus heißem Wasser das erwartete UV-Spektrum (Tong, et al., Journal of Organic Chemistry, 32:859, 1967).

2. 1-(2-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-5-methyl-2-pyrimidinon (β-Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon)

Das 4-Thiothymidin wurde hergestellt nach einem bekannten Verfahren (Wempen, et al., in Grossmen, L., and Moldare, K. (Eds.), Methods in Enzymology, Academic Press, XII, Part A, 75, 1967). Das Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon wurde hergestellt aus 4-Thiothymidin durch Reduktion mit Raney- Nickel. 5,9 g (22 mMol) 4-Thiothymidin wurden 180 ml destilliertem Wasser und 60 ml Ethylalkohol in einem Kolben mit Rückflußkühler zugesetzt. Danach wurden 24 g Raney-Nickel zugegeben, wonach die Lösung bis auf Rückflußtemperatur erwärmt wurde. Für die höchsten Ausbeuten wurde eine 4- Thiothymidinlösung jeweils mit einem Raney-Nickel-Präparat tritiert, wonach die optische Dichte einer Probe in 0,1 N HCl bei 260, 322 und 334 Nanometer ermittelt wurde. Die optische Dichte nahm bei allen drei Wellenlängen ab. Die Reaktion war beendet, wenn die optische Dichte bei 322 nm der optischen Dichte bei 334 nm entsprach oder darüber lag. Die Abnahme der optischen Dichte bei 334 nm, ausgehend von der Ausgangslösung, entsprach etwa einem Faktor 6 für die maximale Ausbeute. Auf die Reaktion folgte eine Kieselsäuregel-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Isopropanol. Es zeigte sich ein für die Verbindung kennzeichnender blauer fluoreszierender Fleck mit einem Rf-Wert von 0,35. Die anfänglich grünliche Lösung wurde am Ende der Reaktion schwach gelblich. Da sich auch andere Produkte bildeten, wurde die Reaktion nicht bis zum Verbrauch des gesamten 4-Thiothymidins durchgeführt. Die Suspension wurde heiß filtriert, wonach Raney-Nickel mit 150 ml Wasser gekocht wurde. Die Lösung wurde dann heiß filtriert. Die vereinigten Filtrate wurden dann eingedampft. Das Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon wurde durch trockene Säulenchromatographie mit Woelm-Kieselsäure III gereinigt. Danach wurden dem nach der Reduktion mit Raney-Nickel erhaltenen Feststoff 10 ml Methanol zugesetzt. 3,7 ml der klaren Lösung wurden dann 3,7 g Woelm-Kieselsäure III zugesetzt und an der Luft getrocknet. Die getrocknete Kieselsäure mit dem Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon wurde dann auf eine Säule aus trockener Woelm-Kieselsäure mit einer Länge von 50,80 cm (20 inches) und einem Durchmesser von 2,54 cm (1 inch), die in einem Nylonrohr enthalten war, aufgegeben. Als Lösungsmittel diente Isopropanol. Man ließ die Lösungsmittelfront den Boden der Kieselsäuresäule erreichen, bevor man den Chromatographen abschaltete. Das Nylonrohr wurde dann in Querschnitte zu jeweils 2,54 cm (1 inch) zerschnitten, wonach die Kieselerde in jedem Abschnitt mit 10 ml Methanol extrahiert wurde. Proben aus jedem Abschnitt wurden dann dünnschichtchromatographisch mit einer Kieselsäuresäule mit Hilfe von Isopropanol behandelt. Die Methanolextrakte aus den einzelnen Abschnitten wurden gesammelt. Sie zeigten lediglich den fluoreszierenden Fleck bei einem Rf-Wert von 0,35. Die aus den entsprechenden Abschnitten gesammelte Kieselsäure wurde erneut mit Methanol extrahiert und mit der ersten Extraktion vereinigt. Nach der Filtration wurde das Methanol bis zu einem geringen Volumen eingeengt, wonach die restlichen feinen Kieselsäureteilchen durch Zentrifugieren entfernt wurden. Das restliche Methanol wurde eingedampft, wonach der Rückstand in 10 ml heißem Ethylalkohol gelöst wurde. Die Lösung wurde dann einer Temperatur von -20ºC ausgesetzt. Über Nacht bildeten sich dann Kristalle. Der gelbe Überstand wurde abdekantiert und die gebildeten Kristalle wurden in kaltem Ethanol gewaschen. Das Waschvolumen wurde auf 4 ml eingeengt und dann einer Temperatur von -20ºC ausgesetzt. Es bildeten sich mehr Kristalle. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Kieselsäuregel ergab eine Verunreinigung von weniger als 5 %. Das UV-Spektrum der Lösung der Kristalle entsprach der Literatur (Laland, et al., Biochemical journal, 90:76, 1964). Die Gesamtausbeute, ausgehend von 4-Thiothymidin bis zum Endprodukt betrug ca. 25 %.

C. Synthese geschützter Desoxynucleoside

5'-O-4,4'-Dimethoxytritylthymidin, N-Benzoyl-5'-O-4,4'- dimethoxytrityldesoxycytidin, N-Benzoyl-5'-O-4,4'-dimethoxytrityldesoxyadenosin und N-Isobutyryl-5'-O-4,4'-dimethoxyltrityldesoxy-guanosin wurden nach den üblichen Methoden synthetisiert (Narang, et al., in Methods in Enzymology, Wu, Ed., Vol. 68, 90, 1979).

1. N-Benzoyl-desoxy-6-thioguanosin

Vorversuche haben ergeben, daß die N-Isobutyryl- und N- Acetyl-Derivate während der Alkalihydrolyse zu unbeständig waren, um eine erhebliche Ausbeute an N-geschützten Nucleosiden zu ergeben. 0,5 g (1,7 mMol) Desoxy-6-thioguanosin, das mehrmals durch Eindampfen mit wasserfreiem Pyridin getrocknet worden war, wurden mit 3,3 ml wasserfreiem Pyridin und 6,6 ml redestilliertem Chloroform versetzt. Bei 4ºC wurden dann 4,7 ml redestilliertes Chloroform, das 1,35 ml (12 mMol) Benzoylchlorid enthielt, unter Rühren in einem Kolben mit einem CaCl&sub2;-Trockenrohr zugetropft. Nach Zugabe des Benzoylchlorids ging das gesamte Desoxy-6-thioguanosin in Lösung. Die Lösung verfärbte sich gelb. Danach ließ man sich diese auf Raumtemperatur erwärmen und rührte während 3 Stunden. Die Kieselsäuregel-TLC einer Probe des Reaktionsgemisches mit Methanol/Chloroform (0,5:9,5 V/V) ergab bei UV-Absorption einen Fleck, der sich bei Säurebehandlung und Erwärmung braun verfärbte. Der Fleck befand sich an der Lösungsmittelfront. Die Reaktionslösung wurde dann in 60 ml Eis gegossen. Nach dem Schmelzen wurden 10 ml Chloroform mit der wässerigen Emulsion durchgeschüttelt. Nach Trennung der Phasen enthielt die organische Phase die gesamte gelbe Farbe. Die organische Phase wurde dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die organische Lösung wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet und zu einer öligen Substanz eingedampft.
Dem Öl wurden 19 ml Pyridin zugegeben. Man erhielt eine klare Lösung. Danach wurden 1,8 ml Wasser zugegeben und danach noch 19 ml Methanol. Die Lösung wurde dann bei 4ºC stehengelassen, wobei man bis zur Erreichung eines pH's von 12,4 bis 12,5 langsam 2 N NaOH zusetzte. Durch Zugabe von 2 N NaOH wurde der pH bei einem Wert von ca. 12,4 gehalten. Auf die Hydrolyse folgte dann die Kieselsäuregel-TLC mit Methanol/Chloroform (1,5:8,5 V/V). Der Großteil des UV- absorbierenden Materials war dann in einem Fleck bei einem Rf-Wert von 0,3 enthalten. Der Rf-Wert von Desoxy-6-thioguanosin betrug 0,19. Danach wurde vorsichtig NaOH zugesetzt und darauf geachtet, daß eine erhebliche Produktion an Desoxy-6-thioguanosin vermieden wurde. Die Reaktion wurde dann durch Verminderung des pH auf einen Wert von 7,8 mit 20 % Essigsäure beendet. Wurde ein Ionenaustauscherharz für die Neutralisierung verwendet, kam es zu einem erheblichen Verlust. Die Lösung wurde dann bis zur Erzielung einer öligen Substanz eingedampft.
Pilotversuche ergaben, daß der Unterschied in der Löslichkeit zwischen dem N-Benzoylderivat und dem Di-, Tri- und Tetra-benzoylderivaten in heißem Wasser ein günstiges Reinigungsverfahren ermöglichen. Dem Öl wurden 600 ml Wasser zugesetzt, wonach man unter Rühren auf 70ºC erwärmte. Danach wurde die Flüssigkeit vom unlöslichen Stoff abdekantiert und einer Temperatur von 4ºC ausgesetzt. Es bildete sich ein Niederschlag, der durch Filtration abgetrennt wurde. Die wässerige Lösung wurde dann bis zu einem Volumen von 250 ml eingedampft, wonach man einen zweiten Niederschlag abfiltrierte. Der Kieselsäuregel-TLC der vereinigten Niederschläge ergab, daß mehr als 90 % auf das N-Benzoylderivat entfielen.
Die Auftrennung erfolgte durch Lösung des Öls in 20 ml Chloroform und wiederholte Extraktion des Chloroforms mit einer schwachbasischen Lösung von NH&sub4;OH, pH 10.
Die Identifizierung des Flecks mit einem Rf-Wert von 0,3 mit N-Benzoyl-desoxy-6-thioguanosin beruhte auf einer quantitativen Bestimmung der Menge an Benzoesäure, die man nach vollständiger Alkalihydrolyse erhielt, und auf der kennzeichnenden Verschiebung des Absorptionspeaks von ca. 340 nm zu 320 nm, wenn sich der pH von 5 zu einem Wert von 12 änderte. Liegt ein Thioester vor, kommt es nicht zu dieser Verschiebung.

2. N-Benzoyl-5'-O-4,4'-dimethoxytrityl-desoxy-6-thioguanosin

125 mg (0,32 mMol) N-Benzoyl-desoxy-6-thioguanosin wurden durch wiederholtes Eindampfen aus wasserfreiem Pyridin getrocknet. Danach wurden 1,25 ml wasserfreies Pyridin und anschließend bei Raumtemperatur 172 mg (0,5 mMol) 4,4'- Dimethoxytritylchlorid zugesetzt. Nach 2 Stunden Kieselsäure-TLC mit Chloroform wurde festgestellt, daß kein N- Benzoyl-desoxy-6-thioguanosin vorhanden war. Dann wurden 3 ml Methanol zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde der Lösung 6 ml kaltes Wasser zugesetzt. Dann wurde die wässerige Lösung mit 5 ml Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde mit 5 ml Wasser gewaschen und die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde bis 2,5 ml eingeengt, wonach mit der Chloroformlösung 4 präparative Platten aus Kieselsäuregel (1000 u, 20 x 20 cm) mit einem Fluoreszenzindikator bestrichen wurden. Als Lösungsmittel wurde dabei ein Gemisch aus Methanol und Chloroform (1:9 V/V) verwendet. Das Dimethoxyltritylderivat wurde durch TLC ermittelt, wobei man feststellte, welcher UV-absorbierende Fleck sich bei Besprühen mit einer Säure orange verfärbt. Die N-Benzoyl-5'-O- 4,4'-dimethoxytrityl-desoxy-6-thioguanosin enthaltenden Kieselsäurezonen wurden abgekratzt und mit Methanol eluiert.
Die Kieselsäureteilchen wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die methanolischen Lösungen wurden vereinigt und bis zur Trockene eingedampft.

3. 5'-O-4-4-Dimethoxytrityl-desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon

0,639 g (2,5 mMol) β-Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon wurden durch wiederholtes Eindampfen aus wasserfreiem Pyridin getrocknet. Danach wurden 8 ml wasserfreies Pyridin und 1,1 g (3,2 mMol) 4,4-Dimethoxytritylchlorid unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach 30 Minuten war das gesamte Material in Lösung. Nach 45 Minuten wurde eine Probe durch Kieselsäuregel-TLC mit Methanol/Chloroform (1:9 V/V) analysiert, was die Vollständigkeit der Reaktion ergab. Das Derivat zeigte einen Rf-Wert von 0,37. Methanol (1,2 ml) wurde dazugegeben und 15 Minuten lang gerührt. Die Lösung wurde dann in 20 ml Eiswasser gegossen. Nach Stehen über Nacht bei 4ºC wurde die wässerige Phase von der hellgelben harzartigen Substanz abdekantiert. Diese wurde dann in 10 ml Ethylacetat gelöst. Die wäßrige Phase wurde mit 8 ml Ethylacetat extrahiert und mit der ersten Ethylacetatlösung vereinigt. Die Ethylacetatlösung wurde mit 7 ml jeweils NaHC&sub3;, Wasser, 1 M NaCl gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde mit Natriumsulfat getrocknet, dekantiert und bis zum Erhalt einer harzartigen Substanz eingedampft. Diese wurde dann in 4 ml Chloroform gelöst und dann auf eine kurze Kieselsäuresäule (20 x 75 mm) aufgegeben. Eine Lösung von 0,5 % Triethylamin in Chloroform wurde auf die Säule aufgegeben, bis eine gelbe Flüssigkeit auszutreten begann. Das Lösungsmittel wurde dann durch ein Gemisch aus Methanol und Chloroform (0,2:10 V/V) ersetzt, wonach 10 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Diese wurden bei 329 nm auf Desoxyribosyl- 5-methyl-2-pyrimidinonderivat geprüft. Proben der Fraktionen wurden mittels Kieselsäuregel-TLC mit Methanol/Chloroform (1:9 V/V) analysiert. Die Fraktionen, die sich als rein erwiesen, wurden gesammelt und unter Vakuum eingedampft.

4. Triethylammonium (5'-O-4,4'-dimethoxytrityl-geschütztes Desoxynucleosid-3'-O-(2-chlorophenylphosphat))

Sämtliche Verbindungen wurden nach üblichen Verfahren hergestellt (Narang, et al., in Wu, R. Ed., Methods in Enzymology, 68:90, 1979). Bei der Durchführung der Verfahren mit Desoxy-6-thioguanosin war es wichtig, sämtliche empfindlichen Lösungsmittel auf Peroxide zu prüfen.

D. Synthese der Oligodesoxynucleotide

Die Phosphortriestermethode (Sproat, et al., ibid) wurde mit festen Trägern aus Polystyrol oder gesteuertem Porenglas durchgeführt. Bei der abschließenden Synthese der 6-Thioguanin und 5-Methyl-2-pyrimidinon enthaltenden Oligodesoxynucleotide wurde ein Glasträger verwendet.
Für die Synthese der einzelnen 6-Thioguanin und 5-Methyl-2- pyrimidinon enthaltenden Oligodesoxynucleotide wurden 16 mg eines gesteuerten Porenglases aus langkettigem Alkylamin zusammen mit 0,38 M angelagertem 5'-O-4,4'-Dimethoxytrityl- 2'-desoxyguanosin-3'-O-succinat verwendet. Die Reaktionslösungen wurden hergestellt durch Zugabe von 80 ul wasserfreiem Pyridin zu 10 uMol trockenem geschütztem Nucleotid. Die Pyridinlösung wurde dann 13 mg 1-(Mesitylen-2-sulfonyl)- 3-nitro-1,2,4-triazol zugesetzt, wonach nach 1 min 8 ul 1-Methyl-imidazol zugegeben wurden. Die Lösung wurde dem festen Träger unter Stickstoff bei Raumtemperatur zugegeben. Die Reaktion wurde nach 30 min durch Waschen des festen Trägers mit wasserfreiem Pyridin und Dichlormethan beendet. Die Dimethyloxytritylgruppe wurde mit 2 % Trichloressigsäure in Dichlormethan entfernt. Der Träger wurde mit Dichlormethan und dann mit wasserfreiem Pyridin gewaschen. Danach begann man mit dem nächsten Zyklus der Nucleotidzugabe.

E. Spaltung, Abspaltung der Schutzgruppe und Regeneration

Die Alkaliempfindlichkeit von 6-Thioguanin und 5-Methyl-2- pyrimidinon verhindert die Verwendung der üblichen wässerigen Spaltungsverfahren, ausgehend von einem festen Träger und die Abspaltung der Schutzgruppe der Oligodesoxynucleotide. Modellversuche haben ergeben, daß NH&sub4;OH-Lösungen das Desoxy-6-thioguanosin in Desoxyguanosin und einige kleinere Komponenten innerhalb mehrerer Stunden bei einer Temperatur von 50ºC umwandeln. Das Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon wurde innerhalb einiger Minuten in eine andere Komponente umgewandelt, wenn es stark alkalischen Bedingungen bei Raumtemperatur ausgesetzt war, und diese Verbindung wiederum verwandelte sich über längere Zeit in einige andere Komponenten. Modellversuche haben ergeben, daß die Desoxy-3'-O- succinatbindung und die o-Chlorphenylphosphatbindung langsam mit syn-2-Nitro-benzaldoximat in wasserfreiem Pyridin gespalten werden. Die Isobutyryl- und Benzoylgruppen wurden durch Ammonolyse in wasserfreiem Methanol entfernt.
Modellversuche mit Desoxy-6-thioguanosin haben ergeben, daß 1-(Mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol rasch mit der 6-Thiogruppe unter den Reaktionsbedingungen reagierte, wodurch das geschützte Nucleotid an das Oligodesoxynucleotid addiert wurde. Das Desoxy-6-thioguanosin wurde aus dem Mesitylensulfonyladdukt durch Benzolthiol in Pyridin vollständig regeneriert. Wie zu erwarten war, verlief die Reaktion mit Mercaptoethanol sehr langsam und ergab mehr als ein Produkt.
Der Glasträger mit dem Oligodesoxynucleotid wurde im Vakuum über P&sub2;O&sub5; und KOH getrocknet. 0,45 ml wasserfreies Pyridin mit 55 ul Benzolthiol (1 M) wurden dem Glas in trockener Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgefäß war dicht verschlossen und wurde bei Raumtemperatur während 8 Stunden stehengelassen. Die Lösung wurde dann entfernt und der Glasträger viermal mit 1 ml Dichlormethan gewaschen. Das restliche Dichlormethan wurde unter Vakuum entfernt und der Glasträger über P&sub2;O&sub5; und KOH getrocknet.
16,6 mg (100 uMol) syn-2-Nitrobenzaldoxim wurden durch wiederholtes Eindampfen mit wasserfreiem Pyridin getrocknet. 200 ul wasserfreies Pyridin wurden in Stickstoffatmosphäre trockenem Nitrobenzaldoxim zugesetzt und danach 36 ul trockenes Tetramethylguanidin. Die Lösung und der Glasträger wurden dann in einem Gefäß unter Stickstoff dicht verschlossen und während 5 Tagen bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Grad der Freisetzung des Oligodesoxynucleotids in die Lösung wurde dadurch verfolgt, daß man 1 ul der Lösung auf die Dimethoxytritylgruppe testete. Der Nitrobenzaldoximatlösung wurden unter Stickstoff 27 mg p-Nitrophenylacetat zugesetzt, um die restlichen Oximationen zu verwerten. Drei Stunden danach wurde 1 ml 10 ul 20%ige Essigsäure enthaltendes Pyridin zugesetzt. Der pH, der sich zwischen 7 und 8 bewegen sollte, wurde mit pH-Papier gemessen. Die Lösung wurde dann vom Glasträger entfernt, wonach 1 ml 50%iges wässeriges Pyridin zugesetzt wurde. Dann wurde die Suspension 30 Minuten lang geschüttelt. Die Lösung wurde dann entfernt und mit der Ausgangspyridinlösung vereinigt. Die Lösung wurde schließlich bis zur Trockene eingedampft.
Dem getrockneten N-geschützten Oligodesoxynucleotid wurde dann 1 ml trockenes 9 mg (25 mMol) Cetyltrimethylammoniumbromid enthaltendes Methanol zugesetzt. Die Lösung wurde mit NH&sub3;-Gas bei 4ºC gesättigt. Danach wurde das Proberöhrchen luftdicht verschlossen und bei Raumtemperatur in der Dunkelheit stehengelassen. 7 Tage danach wurde das Proberöhrchen bei 4ºC geöffnet, wonach die Lösung bei Raumtemperatur unter trockenem Stickstoff eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in 1 ml 80%iger Essigsäure gelöst, um die Dimethoxytritylgruppe freizusetzen. Nach 20 Minuten wurde 1 ml Wasser zugesetzt, wonach die wässerige Lösung fünfmal mit 2 ml mit Wasser gesättigtem Diethylether extrahiert wurde. Die wässerige Phase wurde dann bis auf 200 ul eingedampft. Die erhaltene Lösung war gelb. Diese wurde dann auf eine Dowex AG- 50Wx2-Säule (1,5 x 3 cm) aufgegeben, die dann zuerst mit 1 Mol NH&sub4;HCO&sub3; und dann mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser eluiert und es wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt. Diese wurden bei 260 nm auf Oligodesoxynucleotid untersucht, wonach die entsprechenden Fraktionen gesammelt wurden. Diese wurden dann bis zur Trockene eingedampft und bei -20ºC gelagert.

F. Auslöschungskoeffizienten

Die Auslöschungskoeffizienten bei 260 nm der Oligodesoxynucleotide sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Sie wurden wie folgt errechnet:
1. Ein Auslöschungskoeffizient von 10 x 10&sup4;M&supmin;¹ cm für A-T wurde errechnet aus den Daten, angegeben von Soher (CRC Handbook of Biochemistry, 2nd Ed., Sober, H.A. (Ed.), The Chemical Rubber Company, Cleveland, OH).
2. Der Auslöschungskoeffizient für das Oligodesoxynucleotid GS-T wurde mit 10 x 10&sup4; M&supmin;¹ cm angenommen, da das Nucleosid des 6-Thioguanins einen Auslöschungskoeffizienten bei 260 nm von 8 x 10³M&supmin;¹ cm aufwies, der im wesentlichen pH-unabhängig war.
3. Der Auslöschungskoeffizient des 5-Methyl-2-Pyrimidinon enthaltenden Oligodesoxynucleotids wurde mit 9,2 x 10&sup4;M&supmin;¹ cm angenommen, da das Desoxynucleotid des 5-Methyl-2-pyrimidinons bei 260 nm im wesentlichen keine Absorption aufwies (Laland, et al., ibid).

G. Ligierungsversuch

Die markierten Oligodesoxynucleotidkonzentrationen schwankten zwischen 0,1 und 0,01 uM. Der Oligodesoxynucleotidträger war T-C-G-A-C-C-C-G-G-G und seine Konzentration betrug 1 bis 2 uM. Die übrigen Komponenten waren 0,06 M Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 0,5 mM ATP und 0,06 bis 0,005 Weiss-Einheiten T4-Ligase pro ul. Die Temperatur betrug 19ºC. Der Puffer MgCl&sub2;, Dithiothreit und die Oligodesoxynucleotide wurden miteinander vereinigt und folgendem Temperaturzyklus unterworfen: 5 Minuten bei 60 bis 65ºC, 15 Minuten bei Raumtemperatur und 15 Minuten auf Eis. Die 0,5 ml-Proberöhrchen aus Polypropylen wurden zentrifugiert, um vor der Zugabe der ATP und der Ligase das gesamte Wasser am Boden zu sammeln.

H. Gel-Elektrophorese

Für die präparative Elektrophorese wurden 25 % Acrylamid- Gele, 0,2 x 13 x 29 cm, (Gough, et al., Nucleic Acid Research, 6:1557, 1979) verwendet. Vor der Aufgabe der Proben wurde die Elektrophorese durchgeführt mit 10&supmin;³M Glutathion im oberen Puffer, um die Peroxide und freien Radikale zu entfernen. In der Probenlösung waren 10&supmin;³ M Glutathion enthalten. Nach Eintritt der Proben in das Gel wurde die Stromstärke auf 4 mA vermindert. Die Elektrophorese wurde eingestellt, wenn der Farbstoff Cyanolxylol nach 18 bis 24 Stunden ca. 9 cm durchsetzt hatte. Die UV-Absorptionsbanden der Oligodesoxynucleotide wurden herausgeschnitten, zerkleinert und mehrmals während mehrerer Tage mit 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; extrahiert.

I. HPLC-Analyse

Die Nucleotide wurden an einem schwachen Anionenaustauschharz, und zwar an Syn Chropak AX100, 250 x 4,6 mm, SynChrom Inc., Linden, IN., mit einer mobilen Phase von 0,05 F KH&sub2;PO&sub4;, pH 4,5, analysiert. Danach wurden die Nucleoside an einer Octadecyl-Kieselsäuresäule, 250 x 4,6 mm, mit einer mobilen Phase von 2,5 % Methanol und 0,02 F KH&sub2;PO&sub4;, pH 5,5 analysiert. Anstelle von Desoxyadenosin wurde 10%iges Methanol verwendet. Mit dieser Technik konnte die Anwesenheit der neuen Nucleotidbasen in den Oligonucleotiden nachgewiesen werden.

Beispiel 2

Physikalische Merkmale der synthetischen Oligodesoxynucleotide

Tabelle 1 enthält die Oligodesoxynucleotide, die nach der Festphasen-Phosphotriester-Methode synthetisiert wurden. Die Oligodesoxynucleotide wurden durch präparative Elektrophorese in 25 % Acrylamidgel isoliert. Die elektrophoretische Reinheit der Oligodesoxynucleotide wurde durch Markieren des 5'-Endes mit P32-Phosphat überprüft, wonach eine elektrophoretische Analyse in 20 bis 25 % Acrylamidgel durchgeführt wurde. Die mit P32 markierte Hauptkomponente vereinigte über 90 % der Radioaktivität in sich, und auf keine einzige andere Komponente entfielen mehr als 2% der Gesamtradioaktivität. Tabelle I Synthetisierte Oligodesoxynucleotide Bezeichnunga Sequenz a) Die Basen 6-Thioguanin und 5-Methyl-2-pyrimidinon werden mit 6TG oder Gs und MPO oder TH bezeichnet.
Die Zahl der Nucleotidreste im Oligodesoxynucleotid wurde durch Markieren des 5'-Endes mit P32-Phosphat und nachfolgenden Abbau des Polymers mit Schlangengiftphosphordiesterase festgestellt. Die Zahl der zu verschiedenen Zeitpunkten der Hydrolyse des Oligodesoxynucleotids erhaltenen Produkte wurde durch Elektrophorese in 20 bis 25 % Acrylamidgelen bei 50ºC und Autoradiographie ermittelt.
Die im UV-Licht sichtbaren Absorptionsspektra der 6-Thioguanin und/oder 5-Methyl-2-pyrimidinon enthaltenden Oligodesoxynucleotide zeigten eine starke Absorption bei neutralem pH in einem Bereich von 310 bis 350 nm im Absorptionsspektrum des Oligodesoxynucleotids mit Adenin und Thymin in den Positionen X und Y. 6-Thioguanin weist Absorptionspeaks bei 265 und 340 nm bei neutralem pH auf. Das β-Desoxyribosyl-5- methyl-2-pyrimidinon hat einen Absorptionspeak bei 314 nm. Außerdem ist β-Desoxyribosyl-5-methyl-2-pyrimidinon in UV- Licht fluoreszierend. Die 5-Methyl-2-pyrimidinon enthaltenden Oligodesoxynucleotide waren unter UV-Licht fluoreszierend.

Die relative Beständigkeit der Basenpaare

Die übliche Methode zur Ermittlung der Assoziationskonstanten der komplementären Oligodesoxynucleotide bestand in der Ermittlung der optischen Dichte bei 260 nm als Funktion der Temperatur. Leider kann diese Technik auch zu irrigen Interpretationen führen. Bei Oligodesoxynucleotiden mit kurzen Serien ("short runs") komplementärer Sequenzen (unter ca. 16) ist der Übergangsbereich für die optische Dichte ziemlich breit und selbst wenn man annimmt, daß das Zweizustandmodell geeignet ist, erfordert die Lokalisierung der Mittelpunkttemperatur für den Übergang sehr zuverlässige Daten. Bei beschränkten Mengen an synthetisiertem Oligodesoxynucleotid ist bei diesen Ausgangsuntersuchungen und bei Anwesenheit eines Drittels der Oligodesoxynucleotidsequenz als einsträngige Bereiche in den Doppelstrangstrukturen die Ermittlung der Assoziationskonstanten durch die Analyse der optischen Dichte bzw. der Temperaturkurven nicht durchführbar. Anstelle der Schmelztemperaturkurven wurde für die Ermittlung der relativen Assoziationskonstanten ein enzymatisches Ligierungsverfahren entwickelt.
Die Grundidee dieses Verfahrens besteht in der Messung der Konzentration der Duplexstruktur eines Oligodesoxynucleotidpaars durch Ermittlung der Menge für die Ligierung des Duplex mit einem Trägerduplex, der anfänglich in einer weit höheren Konzentration als der des interessierenden Duplex vorhanden war. Der Grund für die Ligierung des Duplex mit einem Trägermolekül anstelle Autoligierung des Duplex lag in der Einfachheit des mathematischen Modells. Die Autoligierung ist nämlich nur unter sehr eingeschränkten Bedingungen mathematisch einfach. Die Menge des mit dem Träger ligierten Duplexes wurde durch Markieren eines der Oligodesoxynucleotide des Duplex mit P32 in Form von 5'-Phosphat festgestellt. Der Träger wurde mit kaltem Phosphat phosphoryliert. Sowohl der Trägerduplex als auch der interessierende Duplex zeigten 5'-überstehende einzelsträngige Bereiche (T-C-G-A), die komplementär waren. Da die Möglichkeit bestand, daß einzelsträngige Oligodesoxynucleotide mit dem Trägerduplex ligiert werden könnten, war es notwendig, das Ausmaß dieser Reaktion zu ermitteln.
Bei der Realisierung der im nachfolgenden Absatz angeführten Bedingungen ist die Konzentration des Oligodesoxynucleotids 1 als Funktion der Zeit wie folgt
I. 1n/C(1,t)/C(1,0)/ = -/Ks(1)+ Kd(1,2)Ca(2)/F(t),
worin C(1,0) die Konzentration an Oligodesoxynucleotid 1 zum Zeitpunkt 0 ist, C(1,t) die Konzentration zum Zeitpunkt t ist, Kd(1,2) die Assoziationskonstante zwischen den Oligodesoxynucleotiden 1 und 2 ist, Ks(1) den Ausdruck bedeutet, der die Geschwindigkeit der Ligierung des einsträngigen Oligodesoxynucleotids 1 mit den Trägermolekülen verglichen mit dem Duplex kennzeichnet, Ca(2) ein Durchschnittswert der Konzentration des Oligodesoxynucleotids 2 während der Reaktionsdauer darstellt, 1 ist, wenn die Komponenten 1 und 2 unterschiedliche Oligodesoxynucleotide darstellen und 2 ist, wenn die Oligodesoxynucleotide identisch sind, und F(t) eine Funktion der Zeit ist, die von den Mengen an Enzym und Trägermolekül abhängt, jedoch nicht von den Mengen an den Oligodesoxynucleotiden 1 und 2.
Die für die Gleichung I erforderlichen Versuchsbedingungen sind, damit diese anwendbar ist, folgende: 1. Die Trägerkonzentration ist ausreichend hoch, so daß der zeitliche Verlauf der Autoligierung der Trägermoleküle durch die Menge des aufzunehmenden Duplexes nicht erheblich gestört wird. 2. Die Konzentration des Duplexmoleküls ist gering, so daß die Ligierungsgeschwindigkeit proportional der Duplexkonzentration ist. 3. Die Duplexkonzentration ist so niedrig, daß die Autoligierung verglichen mit der Ligierung mit dem Trägermolekül unbedeutend ist. 4. Die Geschwindigkeiten der Assoziation der Oligodesoxynucleotide und der Dissoziation des Duplexes sind so hoch, daß während der gesamten Reaktionsdauer ein Gleichgewicht aufrechterhalten wird. 5. Die Km-Werte der Duplexe sind bei ihrem Vergleich dieselben, d.h. signifikantes Merkmal ist der 5'-Überlappungsbereich zwischen dem Duplex und dem Trägermolekül und nicht die Sequenz des Restes des Duplexmoleküls im einzelnen.
Die Ergebnisse der Ligierung des autokomplementären Oligodesoxynucleotids Nr. 25 (Tabelle I) mit dem Trägermolekül sind in Tabelle II zusammengefaßt. Die Daten aus Tabelle II zeigen deutlich, daß die einzelsträngige Ligierung im eingesetzten Konzentrationsbereich vorherrschte. Die Duplexbildung wird bei einer Konzentration des Oligodesoxynucleotids von über 10&supmin;&sup7; M nachweisbar. Außerdem zeigen die Ergebnisse die wichtige Eigenschaft, daß die Menge an markiertem, mit dem Träger ligiertem Oligodesoxynucleotid proportional ist der vorliegenden Menge, was für die Gültigkeit der Gleichung I eine notwendige Voraussetzung ist.
Tabelle III enthält illustrierende Angaben, die verwendet werden zur Emittlung des Verhältnisses zwischen der Assoziationskonstante des autokomplementären Oligodesoxynucleotids Nr. 25 und der Assoziationskonstante des Oligodesoxynucleotidpaares 6TG und MPO in Tabelle I. Die Daten wurden unter Verwendung der Gleichung I analysiert. Die Konzentration an Nr. 25 in Probe 4 ist so geartet, daß die Ligierung des Einzelstranges vorherrscht. Auf diese Weise ergibt sich für die Gleichung I:
II. Ks(25)F(t) = -1n/C(25,t)/C(25,0)/
= -1n/6592/13361/
= 0,706
Die Konzentration an Nr. 25 in Probe 3 ist so geartet, daß sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige Moleküle ligiert werden. Für die Gleichung I ergibt sich somit:
III. Ks(25)F(t)+2Kd(25,25)Ca(25)F(t) = -1n/57240/126053/
= 0.789
Ks(25)F(t) ist bekannt aus Gleichung II, wobei folgende Gleichung verwendet wird:
Ca(2) = /C(2,0) - C(2,t)/1n /C(2,0)/C(2,t)/
Ca(25)= 1,2x10&supmin;&sup7;M.
Durch Kombination dieser Ergebnisse gelangt man zu:
IV. Kd(25,25)F(t)=3,48X10&sup5;
Wird dieselbe Analyse mit den Proben 1 und 2 durchgeführt, so gelangt man zu:
V. Kd(6TG,MPO)F(t)=2,38x10&sup5;
und
VI. Kd(25,25)=1,5Kd(6TG-MPO).
Viele Messungen wurden bei zwei unterschiedlichen Enzymkonzentrationen durchgeführt, und zwar innerhalb eines Bereichs zwischen 0,6 und 0,05 Weiss-Einheiten pro 10 ul, wobei die Konzentrationen an sämtlichen Oligodesoxynucleotiden bei den einzelnen Messungen unterschiedlich waren. Die relativen Assoziationskonstanten wurden durch die unterschiedlichen Enzymkonzentrationen bzw. die verschiedenen Oligodesoxynucleotidkonzentrationen nicht beeinflußt, was den Nachweis eines Doppelstranges ermöglichte. Die Unabhängigkeit der relativen Assoziationskonstanten von den Änderungen in der Enzymkonzentration und Oligodesoxynucleotidkonzentration läßt deutlich erkennen, daß während des Verlaufs der Ligierung die Gleichgewichtsbedingungen zwischen Doppelstrang und Oligodesoxynucleotiden aufrechterhalten wurde. Die Unabhängigkeit der relativen Assoziationskonstanten von der Konzentration der Oligodesoxynucleotide und die Ergebnisse in Tabelle II zeigen, daß die Substratkonzentrationen, verglichen mit Km, niedrig waren.
In den Fällen, in denen die Menge an mit den Trägermolekülen ligiertem markiertem Oligodesoxynucleotid gering ist, verglichen mit der Menge an nichtlegiertem Oligodesoxynucleotid, könnte eingewandt werden, daß die Unsicherheit in der Zählung des nichtligierten Oligodesoxynucleotids C(t) so groß ist wie die ligierte Menge oder diese noch übertrifft. Die zu ligierende Menge wird C(t) zugesetzt, um so zu C(O) zu gelangen. Es ist jedoch die Menge
1n/C(t)/C(O)/,
die in den Gleichungen erscheint. Ist die Differenz C(O) -C(t), verglichen mit C(O), gering, ist entsprechend der Gleichung
1n/C(t)/C(O)/ = -/C(O)-C(t)//C(O)
C(O)-C(t) die tatsächlich gemessene Radioaktivitätsmenge. Die Unsicherheit bezüglich C(t) erscheint dann nur in C(O).
Es war nicht möglich, die relative Assoziationskonstante des autokomplementären Oligodesoxynucleotids 6TG-MPO in Tabelle I zu messen, da jedes Polynucleotidkinase-Präparat, das zur Phosphorylierung des 5'-Endes verwendet wurde, eine Aktivität enthielt, die das Oligodesoxynucleotid rasch spaltete.
Die Zugabe der für die bei der Ligierung verwendeten Sequenz spezifischen Restriktionsendonuklease Sal I und von 150 uM Natriumchlorid zu Anteilen der abgeschlossenen Ligierungsreaktion führten zu einem Verlust an ligiertem markiertem Oligodesoxynucleotid und zu einem Anstieg an nichtligiertem markiertem Oligodesoxynucleotid. Tabelle II Ligierung des Oligodesoxynucleotids Nr. 25 mit einem Oligodesoxynucleotidträger Konzentration (in um) Bei 60 Minuten (Zählungen pro Minute) Ligiert bei 60 Minuten (Zählungen pro Minute)
Das mit P32 5'-phosphorylierte Oligodesoxynucleotid Nr.25 aus Tabelle I wurde mit dem Trägermolekül T-C-G-A-C-C-C-G-G- G ligiert. Die Ligierungsreaktion wurde durchgeführt mit den angegebenen Konzentrationen an markiertem Oligodesoxynucleotid, 0,06 M tris-HCl bei pH 7,5 mit 5 mM Dithiothreit, 0,5 mM ATP, 5 mM MgCl&sub2;, 1 uM 5'-phosphoryliertem Oligodesoxynucleotidträger und 0,6 Weiss-Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 ul. Die Temperatur betrug 19ºC. Die Proben wurden 1 zu 4 mit 80 % Formamid verdünnt. 2 ul-Proben wurden elektrophoretisch an 12,5 % Acrylamid und 7 M Harnstoffgel bei 50ºC analysiert. Nach der Autoradiographie zur Lokalisierung des Oligodesoxynucleotids Nr. 25 und der Glieder der ligierten Oligodesoxynucleotide wurden die entsprechenden Bereiche herausgeschnitten und gezählt. Tabelle III Ligierung der Oligodesoxynucleotide mit einem Oligodesoxynucleotidträger Probe Nr. Zusammensetzung Vorligierung (Zählungen pro Minute) Ligierung (Zählungen pro Minute)
Die angeführten Oligodesoxynucleotide wurden mit dem Trägermolekül T-C-G-A-C-C-C-G-G-G ligiert. Das Sternchen gibt das Oligodesoxynucleotid an, das mit P32 5'-phosphoryliert wurde. Die Oligodesoxynucleotidsequenzen sind in Tabelle I angegeben. Die Ligierungsreaktion wurde durchgeführt mit den angegebenen Oligodesoxynucleotiden, 0,06 M tris-HCl, bei pH 7,5, mit 5 mM Dithiothreit, 0,5 mM ATP, 5 mM MgCl&sub2;, 1 uM 5'- phosphoryliertem Oligodesoxynucleotidträger und 0,15 Weiss- Einheiten T4 DNA-Ligase in 10 ul. Die Temperatur betrug 19ºC. Die Ligierungsdauer betrug 60 Minuten. Eine Reaktionsprobe wurde 1 zu 4 mit 80 % Formamid verdünnt. 2 ul-Proben wurden mit 10% Acrylamid und 7 M Harnstoffgel bei 50ºC behandelt. Die Elektrophorese war beendet, wenn der Cyanoxylolfarbstoff bis zu ca. 7 cm gewandert war. Nach der Autoradiographie zur Lokalisierung der Oligodesoxynucleotide wurden die entsprechenden Bereiche des Gels herausgeschnitten und gezählt. Tabelle IV Relative Assoziationskonstanten Oligomerpaar Assoziationskonstante Wert, bezogen auf K(A,T/T,A)
Bemerkung: Das erste Oligomer bei jeder Expression wird mit 5'-3'-bezeichnet, das zweite mit 3'-5'-. " " bedeutet, daß die Länge der Doppelstrangligierung innerhalb der Versuchsungenauigkeit der in Abwesenheit des komplementären Oligodesoxynucleotids festgestellten Menge liegt.

Beispiel 3

In vivo-Replikation des Basenpaars 5-Methyl-2-pyrimidinon/6-Thioguanin

Synthetisiert wird ein das Basenpaar 5-Methyl-2-pyrmidinon/6-Thioguanin (MPO/6TG) enthaltendes doppelsträngiges Oligodesoxynucleotid. Das synthetisierte doppelsträngige Oligodesoxynucleotid weist einzelsträngige 5'-Enden auf, die einem einzigen Restriktionsenzymsite entsprechen. Das synthetisierte doppelsträngige Oligodesoxynucleotid wird dann in vitro in den einzigen Restriktionssite eines doppelsträngigen DNA-Vektor-Plasmids oder Phagen unter durch T-4-Ligase katalysierter Umsetzung inseriert. Die Insertion des doppelsträngigen synthetisierten Oligodesoxynucleotids in die DNA des Vektors verursacht dann die Inaktivierung eines durch die Basensequenz der Vektor-DNA im Insertionsbereich festgelegten Proteinfunktion. Der Verlust der Proteinfunktion, wie z.B. an dem Enzym β-Galactosidase ist für die Replikation des Vektors in den infizierten Zellen unerheblich. Ein Stamm von E. coli, der durch Zugabe externer DNA transformiert werden kann, wird der Einwirkung des das synthetisierte doppelsträngige Oligodesoxynucleotid tragenden Vektors ausgesetzt. Der Stamm von E. coli wird so gewählt, daß eine Zelle mit einem darin enthaltenen Replikationsvektor von einer solchen ohne diesen unterschieden werden kann. Außerdem ist der E.coli-Stamm so geartet, daß die An- oder Abwesenheit der nichtessentiellen Proteinfunktion nachgewiesen werden kann. Die transformierten Zellen werden in Anwesenheit der Basen und/oder (Desoxy)nucleotide MPO/6TG gezüchtet. Nach vielen Generationen der Replikation der Zellen und ihrer Vektoren, die keine nichtessentielle Proteinfunktion aufweisen, wird der Vektor isoliert. Das in der Vektor-DNA enthaltene Oligodesoxynucleotid wird dann auf die Anwesenheit des Basenpaars MPO/6TG hin analysiert.
Im allgemeinen bedient man sich der Methode zur M13-Phagen - und Plasmid-Klonung nach Messing (M13 cloning/dideoxysequencing Instruction Manual, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, 1986). Komplementäre Oligodesoxynucleotide mit 12 oder mehr Resten werden synthetisiert unter Verwendung der Phosphotriester- und/oder Phosphittriestermethode (Gait, M.J. (Ed.), Oligodeoxynucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984). Das doppelsträngige Oligodesoxynucleotid weist das Basenpaar 5-Methyl-2-pyrimidinon/6-Thioguanin (MPO/6TG) auf. Einzelsträngige Bereiche an jedem Ende des doppelsträngigen Oligomers weisen am Sal I-Restriktionssite die überstehende Sequenz (5')TCGA auf, so daß das doppelsträngige Oligomer mit dem Sal I-Klonungssite im Vektor ligiert werden kann.
Danach werden die replizierte Form des Phagen M13mp18 und des Plasmids pUC8 (oder 18) mit Sal I geschnitten, wonach das 5'-Phosphat der linearisierten Vektoren mit Alkaliphosphatase entfernt wird.
Für das übliche Ligierungsreaktionsgemisch für ein 10 ul- Volumen verwendet man 2 fMole linearen M13mp18 oder pUC8 (oder 18) und 10 bis 30 pMole komplementäre Oligodesoxynucleotide. Die hohe Konzentration der komplementären Oligomere ist erforderlich, da die Assoziationskonstante der kurzen Oligomere gering ist. Der mögliche Einbau von Konkatomeren in den Vektor ist nicht nachteilig.
Für die Transformation sowohl mit M13pm18 als auch mit pUC8 (oder 18) nach der Ligierung verwendet man den DH5 α-Stamm E. coli (Bethesda Research Laboratories) oder ein Äquivalent. Im Falle von M13mp18 werden die DH5 α-Zellen mit dem E. coli-Stamm JM107 plattiert (Yarisch-Perron, et al., Gene, 33:103, 1985), da für die Infektion mit dem M13-Phagen F'- Stämme erforderlich sind.
Im Falle von M13mp18 kommen zusätzlich zu den üblichen Komponenten des Plattierungsmediums auch noch die Basen und/oder (Desoxy)nucleoside MPO und 6TG bei Konzentrationen von 0,001 M bis 0,0001 M hinzu. Kolonien von den weißen Plaques werden dann isoliert und auf einem Medium mit MPO und 6TG gereinigt. M13pm18-Phagen werden aus Zellen erzeugt, die in einem Standardmedium, dem MPO und 6TG zugesetzt wurden, wachsen. Einzelsträngige DNA wird dann aus dem Phagen nach der Phenolmethode isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).
Werden pUC8 oder 18 verwendet, werden die Zellen nach der Transformationsstufe, nachdem sie dem Plasmid ausgesetzt waren, auf einem Standardmedium unter Zugabe von 50 ug/ml Ampicillin und der Basen und/oder (Desoxy)nucleoside MPO und 6TG bei Konzentrationen von 0,001 M bis 0,0001 M plattiert. Die weißen Kolonien werden dann gereinigt und die Zellen in Anwesenheit von P32-Phosphat zur Markierung der Nukleinsäure gezüchtet. Die Plasmide werden dann aus den Zellen nach den üblichen Methoden (Maniatis et al., ibid) isoliert.
Bei der Analyse der Phagen-DNA und der Plasmid-DNA wird das Plasmid mit Sal I-Restriktionsenzym verdaut, wonach die kleinen Oligodesoxynucleotide, die durch Reinigung aus der größeren pUC8-DNA erhalten wurden, der Elektrophorese an Acrylamidgel unterworfen werden, wobei die Banden radioautographisch lokalisiert werden. Die kleinen Oligodesoxynucleotide werden dann aus dem Gel eluiert und mit Phosphordiesterase gespalten (Maniatis, et al., ibid). Das Spaltprodukt wird dann durch HPLC unter Verwendung eines starken Anionenaustauschers (wie z.B. Whatman PXS-1025 SAX 4,6 x 250 mm) mit einem linearen Gradienten von 0,007 F KH&sub2;PO&sub4;, pH 4,0, bis 0,5F KCl, 0,25 F KH&sub2;PO&sub4;, pH 4,5 analysiert. Authentische 5'-Desoxynucleotide von MPO und 6TG werden dann mit dem Spaltprodukt behandelt. Das Erscheinen von P32-Peaks, die mit denen der zugesetzten Nucleotide MPO und 6TG identisch sind, zeigt, daß das Basenpaar MPO/6TG in vivo repliziert wurde.
Außerdem wird eine einzelsträngige DNA von M13mp18 als Templat mit einem Universalprimer für die Synthese von Oligodesoxynucleotiden verwendet. Es werden dabei zwei Reaktionsgemische verwendet. Eines enthält zusätzlich die 5'-Triphosphate der Desoxynucleotide MPO und 6TG. Sind die Basen 6TG und/oder MPO am Klonungssite der Phagen-DNA vorhanden, kommt die Synthese zum Stillstand bzw. ihre Geschwindigkeit wird erheblich herabgesetzt, wenn die Polymerase auf die Basen MPO oder 6TG im Templat im Reaktionsgemisch trifft, sofern ausschließlich die üblichen Basen vorhanden sind, nimmt jedoch ihren weiteren Verlauf über den Klonungssite im Reaktionsgemisch bei Vorhandensein von MPO - und 6TG-Desoxynucleotid-5'-triphosphaten. Eines der üblichen Nucleosid-5'-triphosphate enthält α-P32. Die Analyse der in den beiden Reaktionsgemischen synthetisierten Oligodesoxynucleotide durch Acrylamidgelelektrophorese zeigt, daß weit mehr Oligodesoxynucleotide im Gemisch mit MPO- und 6TG-5'- triphosphaten produziert wurden als bei Gemischen, die diese nicht enthalten. Zu Vergleichszwecken werden anstelle der Basenpaare MPO/6TG synthetische komplementäre Oligodesoxynucleotide mit den Basenpaaren Guanin/Cytosin oder Adenin/Thymin verwendet.
Aus der obigen Umfassenden Beschreibung der Erfindung geht hervor, daß für einen Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet viele Abänderungen und Modifikationen möglich sind, ohne von Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Doppelsträngige Gensequenz mit Basenpaaren aus Adenin (A) und Thymin (T),sowie Cytosin (C) und Guanin (G), sowie Basenpaaren aus mit künstlichen Pyrimidinen gepaarten künstlichen Purinen, worin diese in 2- und 6-stellung Substituenten aufweisen, die mit den Substituenten in 2- und 4-Stellung der gepaarten künstlichen Pyrimidine in Wechselwirkung treten,und zwar in Form einer Wasserstoffbindung oder einer hydrophoben Wechselwirkung,und eine dieser Wechselwirkungen H-S ist,und zwischen den künstlichen Purinen und künstlichen Pyrimidinen einerseits und den üblichen Basenpaaren andererseits, verglichen mit den üblichen Basenpaaren oder den künstlichen Basenpaaren, eine erhebliche Diskrimination nach der freien Energie bezüglich der Basenpaarung besteht, so daß die strukturelle Integrität des Doppelstranges aufrechterhalten wird.

2. Doppelsträngige Gensequenz von A, T, C, G, die Basenpaare umfaßt, worin eine Base ein künstliches Purin mit Substituenten in 2- und 6-Stellung ist, ausgewählt unter H, O, S und NH&sub2;, und die komplementäre Base ein künstliches Pyrimidin mit Substituenten in 2- und 4-Stellung ist, ausgewählt unter H, O, S und NH&sub2;, so daß die 6-Stellung des künstlichen Purins mit der 4-Stellung des künstlichen Pyrimidins als erste Basenwechselwirkung in Wechselwirkung tritt und die 2-Stellung des künstlichen Purins mit der 2-Stellung des künstlichen Pyrimidins als zweite Basenwechselwirkung in Wechselwirkung tritt, und wenigstens eine der Basenwechselwirkungen H-S ist und die strukturelle Integrität des Doppelstranges aufrechterhalten wird.

3. Doppelsträngige Gensequenz nach Anspruch 2, worin die erste Basenwechselwirkung H-S ist und die zweite Basenwechselwirkung ausgewählt ist unter der Gruppe,bestehend aus H-S, H-O und NH&sub2;-O.

4. Doppelsträngige Gensequenz nach Anspruch 2, worin die zweite Basenwechselwirkung H-S ist und die erste Basenwechselwirkung ausgewählt ist unter der Gruppe,bestehend aus H-S, H-O und NH&sub2;-0.

5. Verfahren zur Steuerung der Replikationsgeschwindigkeit eines Organismus mit einer doppelsträngigen Gensequenz mit Basenpaaren aus Adenin (A) und Thymin (T), sowie Cytosin (C) und Guanin (G), sowie Basenpaaren aus mit künstlichen Pyrimidinen gepaarten künstlichen Purinen, worin diese in 2-Stellung und 6-Stellung Substituenten aufweisen, die mit den Substituenten in 2- und 4-Stellung der gepaarten künstlichen Pyrimidine in Wechselwirkung treten,und zwar in Form einer Wasserstoffbindung oder einer hydrophoben Wechselwirkung, und eine dieser Wechselwirkungen H-S ist,und zwischen den künstlichen Purinen und künstlichen Pyrimidinen einerseits und den üblichen Basenpaaren andererseits, verglichen mit den üblichen Basenpaaren oder den künstlichen Basenpaaren, eine erhebliche Diskrimination nach der freien Energie bezüglich der Basenpaarung besteht,durch Steuerung der Konzentration der dem Organismus zugänglichen künstlichen Purine und künstlichen Pyrimidine.