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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Di- und/oder
5'-Triphosphaten des Adenosins, Guanosins, Cytidins, Uridins oder Desoxyadenosins
aus den entsprechenden Nucleosid-5'-monophosphaten unter Verwendung von Phosphorsäureverbindungen.
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In tierischen und pflanzlichen Geweben sind die verschiedensten Nucleotide
in Form von 5'-Diphosphaten und 5'-Triphosphaten, wie beispielsweise die Di- und
Triphosphate von Ribonucleosiden, wie Cytidin, Uridin, Guanosin, Adenosin und auch
Desoxyadenosin, vorhanden. Sie sind biologisch wichtige Substanzen im Zusammenhang
mit der Vermehrung der Zellen und der Vererbung und Bind besonders wertvoll für
die biologische Forschung und die grundlegenden Erkenntnisse der -Lebensvorgänge.-Außegdem
sind sie für die Ernährung wichtige Substanzen.
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Es ist bereits beschrieben worden, daß man -solche Di- und Triphosphate
durch enzymatische Phosphorylierung der entsprechenden Nucleoside, also der phosphatfreien
Nucleinsäurederivate, unter Verwendung von in Hefezellen enthaltenen Enzymen gewinnen
kann. So ist beispielsweise ein Verfahren bekannt, bei dem man Adenosin und Hefenucleinsäuren
mit Hefe, Zucker und Phosphationen zu im wesentlichen Adenosin-5'-monophosphat umsetzen
kann, wobei Beimengungen von Adenosin-5'-polyphosphaten mit anfallen können. Dieses
bekannte Verfahren, ist jedoch ausschließlich mit Adenosin durchführbar und versagt
bei Verwendung von z. B. Guanosin und anderen Nucleosiden, wie in der Schrifttumsstelle
»Journal of Biological Chemistry«, Bd.193 (1951), S.481 bis 4.95, ausgeführt ist.
Dieser Literaturstelle ist ferner zu -entnehmen, daß die in Gegenwart-von Adenosin
durchgeführte: bekannte- Reaktion zur Gem winnung von 5'-Di- und 5'-Triphosphatnucleotiden
ungeeignet ist, da das Adenosin Adenosin-5'-triphosphat in Gegenwart von Hefe abbaut.
Es sind noch weitere Verfahren zur enzymatischen Phosphorylierung unter Bildung
von 5'-Di- und 5'-Triphosphatnucleotiden bekannt (vgl. R. A m m o n und W. D i r
s c-h e r.1, Fermente, Hormonei Vitamine, 3. Auflage, Bd. 1 (1959), S. 359, Satz
2ff ). Diese bekannten Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß das teure Adenosin-5'-triphosphat
.als Ausgangsmaterial und ein zumindest teilweise gereinigtes Enzym, das vergleichsweise
schwer erhältlich und nur aufwendig herstellbar ist, erforderlich sind.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und,-wenig
aufwendiges Verfahren zu schaffen, mit welchem in guter Ausbeute Nucleosid-5'-di-und
-5'-triphosphateunter Verwendung von- leicht erhältlichen Ausgangssubstanzen gewonnen
werden können.
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Diese Aufgabe wird -gelöst mittels eines Verfahrens zur Herstellung
von 5'-Di- und/oder 5'-Triphosphaten des Adenosins, Guanosins, Cytidins, Uridins-
oder Desoxyadenosins aus den entsprechenden Nücleosid-5'-monophosphaten unter Verwendung
von Phosphorsäureverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Plasmolysat
von Bierhefe oder Backhefe in einer das Monophosphat, Zucker und Phosphationen enthaltenden
Lösung bei pH-Werten von etwa 6,5 bis 7,5 und Temperaturen zwischen etwa 20 und
40°C bebrütet und nach Beendigung der Reaktion aus der Reaktionslösung die gebildeten
Nucleosid-5'-polyphosphate in üblicher Weise isoliert.
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Die als Ausgangssubstanz dienenden Nucleosid-5'-monophosphate Adenosin-5'-monophosphat
(AMP) Guanosin-5'-monophosphat (GMP), _Cytidin-5'-monophosphat (CMP)= Uridin-5'-monophosphat
(UMP) und Desoxyadenosin-5'-monophosphat (DAMP) sind bekannte Stoffe, die beispielsweise
durch fermentativen Abbau von Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure,
unter Verwendung von Diesterase als Ferment gewonnen werden können.
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Das beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Hefeplasmolysat gewinnt
man aus Bierhefe (Saccharomyces cereviseae) oder Backhefe (Torulopsis utilis, cryptococcus
utilis) durch Zerstörung der Wände, beispielsweise durch mechanisches Mahlen der
Hefe oder auch durch einfaches Mischen der Hefezellen mit Zucker. Man kann das Hefeplasmolysat
beim erfindungsgemäßen Verfahren aus Hefe und Zucker in situ zubereiten.
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Als Zucker kann man Glucose oder Fructose als solche verwenden. Man
kann jedoch auch Saccharose, Mannose oder Maltose einsetzen, die, wie bekannt, in
der bebrüteten Lösung in Glucose oder Fructose umgewandelt werden.
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Als Phosphorsäureverbindungen kann man erfindungsgemäß anorganische
Phosphatsalze, wie Mono-, Di- oder Trinatriumphosphat oder auch Kaliumphosphat,
Ammoniumphosphat, Natriumpyrophosphat und sonstige Iösiiche--Phosphate einschließlich
2-. und 3basischer Phosphate . und mit Kalium-, Natrium- oder Ammoniumhydroxyd auf
einen pH-Wert -von etwa 7,0 eingestellte Phosphorsäure einsetzen.
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Man setzt das .als.- Ausgangssubstanz.-dienende Nucleosid-5'-monophosphat
vorteilhaft in Mengen von.--30 bis 50 Millimol/1;-vorzugsweise 35 bis 45 Milliaool/l;
-ein. Das erforderliche Hefeplasmolysat gewinnt man aus Mengen von 125 bis 430 g
Hefe je Liter der zu bebrütenden wäßrigen Lösung, vorzugsweise von 1.70 bis 200
g Hefe je: Liter, -und den Zucker setzt man in einer Menge von 24 bis 36 g/1 Lösung,
ivorzugsweise von 29 bis 31 g/1 Lösung, zu. Die Phosphorsäureverbindung verwendet
man zweckmäßig in eines.-Menge von 24 bis 36 g/1 der zu bebrütenden wäßrigen Lösung,
vorzugsweise 29 bis 31 g/1, gerechnet als einbasisches Natriumphosphat-monohydrat.
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Zusätzlich werden vorzugsweise eine 4 °/oige Kaliumchldridlösung und
eine 4°Joige Magnesiumchloridlösung in einer Menge von 16 bis 20 cm3/1, vorzugsweise
19,5 bis 20 cm3/1, und 10°/jger wäßriger Acetaldehyd in einer Menge von 8 bis 18
cm3/1, vorzugsvweise3.4,5 bis 15,5em.g/l;-der zu bebrütenden wäßrigen Lösung zugesetzt,
und wenn man das Hefeplasmolysat in_sita zubereitet,, dann-sutzt man. zweckmäßig
Toluol in einer Menge von 12 bis 18 cms/l, vorzugsweise von 14,#5 bis 15,5 6m3/1;
der=zu--bebrütenden Lösung zu.
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Die Bebrütung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen ,35
:und W°-C und bei einem pH-Wert zwischen 6,8 -und 7,2. -Der, -pH-Wert kann
durch Zusatz von Natronlauge; Kalilauge oder Ammoniumhydroxyd eingestellt werden.
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Die Phosphorylierungsreaktion erfordert im allgemeinen 0,5 bis 2,5
Stunden. Die Beendigung der Phosphorylierung kann ermittelt werden, indem in Abständen
von 15 Minuten die an das Mononucleotid gebundene Phosphormenge bestimmt und als
Endpunkt die Zeit genommen wird, zu der eine Anzeige keinen wesentlichen Anstieg
gegenüber der letzten Messung erkennen läßt.
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Nach dem Bebrüten werden die Hefestoffe des
Plasmolysats
durch -Filtration, :Zentrifugieren od.-dgl. aus dem Gemisch entfernt und .die Nucleosid-5'-di-und/oder
-5'-triphosphate in an. sich bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt.
Dies kann durch .Ausfällen. . der Nucleotide mittels -unlösliche Metallsalze -ergebenden
Kationen, beispielsweise Barium-, Calcium- oder Zinkionen enthaltenden Lösungen,
Abfiltrieren der ausgefällten Salze, Zersetzung der Salze mit einer Säure, Ausfällen
mit Alkohol oder Auflösen in saurer oder . alkalischer Lösung und lonenaustauscherchromatographie,
oder auch durch selektive Adsorption an Aktivkohle mit anschließender Elution und
Ionenaustauscherchromatographie erfolgen. -Das erfindungsgemäße Verfahren hat den
Vorteil, daß man aus leicht erhältlichen Nucleosid-5'-monophosphaten die- wertvollen
Nucleosid-5'-di- und -5'-triphosphate .in guter Ausbeute, und guter Reinheit gewinnt.
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Beispiel 1 Zur Phosphorylierung.von : AMP -wurden 100 mg dieser Substanz
und 356 mg NaH2P04 #H20 in 12 bis 15 cm3 Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde.
mit Natriumhydroxyd auf 6;9 bis 7;0 eingestellt. Dann wurden aliquote Teile von
0,2 cm3 4 °/oiger Kaliumchlorid- und 4°/oiger Magnesiumchloridlösung und 0,1 cm3
10 o/o%ger Acetaldehyd zugesetzt. Anschließend wurde ein durch Mischen von 3,56
g Bierhefe und 300 mg Glucose gebildetes Hefeplasmolysat hinzugegeben. .Dann wurde
das .Volumen auf -20-cm3 aufgefüllt,. und der pH-Wert wurde auf 6,8 bis 6,9 eingestellt.
Die so gewonnene. Suspension wurde ;1-Stunde bei 37°C bebrütet. Analytisch. wurde
ermittelt, - daß $2 % des .AMP in ein Gemisch von Adenosin-5.'=diphosphat,
(ADP)-.und-Adenosin-5'-triphosphat (ATP) umgewandelt=worden waren:.. -Das so gewonnene
Reaktionsprodukt wurde wie folgt aus dem Reaktionsgemisch isoliert: 1. Entfernung
der Hefefeststoffe durch Filtration; 2. Ausfällung der Phosphate als Bariumsalze
durch Zusatz von Bariumionen; 3. Zersetzung der abgetrennten Bariumsalze mit Schwefelsäure,
die in geringem Überschuß angewendet wurde; 4. Filtration zur Entfernung des Bariumsulfats;
5. Ausfällung der Adenosin-5'-phosphate aus dem Filtrat durch Zusatz von 5 bis 10
Volumteilen Alkohol je Volumteil Filtrat; 6. Ionenaustauscherchromatographie einer
wäßrigen Lösung der Adenosin-5'-phosphate.
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Beispiel 2 Die Phosphorylierung von GMP wurde in einer insgesamt 21
ausmachenden Lösung durchgeführt, die 17,0 g Natriumsalz von GMP, 29,4 g NaH,P04
H20, 20 cm3 4 0/,ige Kaliumchlorid- und 20 cm3 4 0/,ige Magnesiumchloridlösung,
13 cm3 10 o/oigen Acetaldehyd sowie ein aus 356 g Bierhefe, 30,0 g Glucose und 10
cm3 Toluol in situ gewonnenes Hefeplasmolysat enthielt. Es wurde 1 Stunde und 25
Minuten unter Rühren bei 37°C bebrütet. Unter diesen Bedingungen wurde maximale
Aufnahme an anorganischem Phosphor durch das GMP und eine 80 o/oige Phosphorylierung
des GMP zu Guanosin-5'-diphosphat und Guanosin-5'-triphosphat erreicht. Die gewonnenen
Produkte wurden wie folgt isoliert: 1. Entfernung der Hefefeststoffe durch Filtration;
2. Ausfällung der Phosphate als Zinksalze bei einem pH-Wert von 9,5; 3. Abtrennung
der Zinksalze durch Filtration und gutes Waschen mit Wasser; 4. Auflösung der .
Zinksalze bei einem pH-Wert von 1,0 durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure; 5.
Ausfällung der Zinkguanosinphosphate durch Zusatz der sauren. -wäßrigen Lösung zu
einem fünffachen Volumen an Alkohol und Abtrennen dieser Salze durch Filtration
und Waschen, mit Alkohol; - .
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6. -Herstellung einer Lösung der Zinksalze durch .Verdünnen mit Wasser
auf wenigstens 10-1 unter Einstellung des pH-Wertes auf 10,0 mit Ammoniumhydroxyd;
7. Ionenaustauscherchromatographie der- geklärten Lösung der Zinkguanosinphosphate.
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Es wurden dabei in. der vierten_ Stufe, in der einen pH-Wert
von 1,0 aufweisenden Lösung, 88,5 0/0 des in der nach Filtration der Hefefeststoffe
verbliebenen Lösung enthaltenen Produktmenge zurückgewonnen.. Durch die Alkoholausfällung,
der fünften Reinigungsstufe,- wurden 77,7 % an gereinigtem Produkt gewonnen, während
10,8 % in der alkoholischen Mutterlauge verblieben. In. der Mutterlauge handelt
es sich im wesentlichen um Zinkphosphat und Zink-Hexose-Phosphate. Eine Prüfung
ergab, daß der von der Mutterlauge befreite Filterkuchen zu 75 0/0 aus reinem
Zinkguanosin-5'-triphosphat (ZnGTP) bestand. Die in der sechsten Reinigungsstufe_gewonnene
Lösung der Zinksalze enthielt 73,3 % an Verfahrensprodukt, und die Eluierung der
Nucleotide ergab 8,5 °% an GMP,. 10,0 °/o an Guanosin-5'-diphosphat (GDP) und 72,5%
an Guanosin-5'-frfphosphat,(GTP). Die-restlichen Bestandteile verblieben in dem
Harz und ließen sich nur mit starker Säure zurückgewinnen. Es konnten demgemäß 540/,
des in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Produktes bei der Reinigung in Form von
reinen Fraktionen an GDP und GTP aus dem Harz wiedergewonnen werden.
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Die angegebenen Werte wurden spektralanalytisch durch UV-Absorption
bei 260 m#t jeweils ermittelt. Beispiel 3 Die Phosphorylierung von UMP wurde in
der Weise durchgeführt, daß in einer Gesamtlösung von 21 17,7 g Natriumsalz von
UMP, 30,4 g NaH,P04 H20, 20 cm3 4 o/oige Kaliumchlorid-, 20 cm 3 4 0/,ige Magnesiumchloridlösung
und 15 cm3 10 o/oiger Acetaldehyd sowie ein aus 356 g Backhefe, 30,0 g Glucose und
10 cm3 Toluol gewonnenes Hefeplasmolysat auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurden.
Dann wurde die enzymatische Reaktion unter Rühren 2 Stunden lang bei 37°C durchgeführt,
wobei vollständige Phosphorylierung des UMP erzielt wurde.
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Die Isolierung der Produkte wurde wie folgt vorgenommen 1. Entfernung
der Hefefeststoffe durch Filtration; 2. Adsorption der Reaktionsprodukte an Aktivkohle;
3. Elution der Reaktionsprodukte von der gewaschenen Kohle mit 50 o/oigem Isopropylalkohol,
der 1 Volumprozent Toluol und 1 Volumprozent Ammoniumhydroxyd enthielt;
4.
Entfernung des Alkohols aus dem Eluat durch Einengen; 5. weitere Verdünnung auf
1 1 bei pH 9,0 und- anschließende lonenaustauscherchromatographie. Dabei wurden
nach der Adsorption an Aktivkohle und Elution 76,60/0 der Nucleotide als alkoholische
Lösung zurückerhalten. 13,1 g an UMP waren von der Kohle aufgenommen. Nach
Einengung zur Entfernung des Alkohols und Verdünnung für die Ionenaustauscherchromatographie
enthielt die wäßrige Lösung 75,40/0 der Reaktionsprodukte.
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Aus dem Ionenaustauscher wurden 11,501, als UMP, 27,9°/o als
Uridin-5'-diphosphat (UDP), 55,6°/0 als Uridin-5'-triphosphat (UTP) und eine geringe
Menge an Beiprodukt als Uridin-5'-diphosphat-glucose (UDPG) erhalten. Praktisch
wurden 63 0/0 des eingesetzten UMP als UDP und UTP gewonnen.
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Beispiel 4 Die Phosphorylierung von UMP wurde in 100 cm3 Lösung, die
einen pH-Wert von 7,0 hatte, und 0,885 g eines Natriumsalzes von UMP, 1,52 g NaH@P04
H20, 1,0 cm3 40/0ige Kaliumchlorid-, 1,0 cm3 40/0ige Magnesiumchloridlösung, 0,75
cm3 10 0/0igen Acetaldehyd sowie ein aus 17,8 g Bierhefe, 1,50 g Glucose
und 0,75 em3 Toluol gewonnenes Hefeplasmolysat enthielt, 1 Stunde und 50 Minuten
bei 37°C unter Rühren durchgeführt.
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Die Analyse des nach Ablauf dieser Zeit und Abtrennen der Hefefeststoffe
gewonnenen Filtrates ergab, daß 65 0/0 des UMP in UDP und UTP umgewandelt worden
waren.
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Beispiel 5 Die Phosphorylierung von DAMP wurde in 20 Cm3 einer Lösung
durchgeführt, die 100 mg eines Natrium--salzes von DAMP, 356 mg NaH,P04 - H20, 0,2
cm3 40/0ige Kaliumchlorid-, 0,2 cm3 4@°/oige Magnesiumchloridlösung, 0,1 cm3 100/0igen
Acetaldehyd und ein aus 3,56 g Bierhefe, 300 mg Glucose und 0,1 cm3 Toluol gewonnenes
Hefeplasmolysat enthielt und einen pH-Wert von 6,9 bis 7,0 hatte. Die enzymatische
Reaktion wurde annähernd 2 Stunden bei 37'C ablaufen gelassen. Danach wurde analysiert.
Es wurde festgestellt, daß eine 800/0ige Umwandlung von DAMP in Desoxyadenosin-5'-diphosphat
(DADP) und Desoxyadenosin-5'-triphosphat (DATP) stattgefunden hatte.