DE697889C - Verfahren zur Darstellung von Muskeladenylsaeure (Adenosin-5-monophosphorsaeure) undihren hoeheren Phosphorsaeurederivaten aus Adenosin - Google Patents

Description

• Verfahren zur Darstellung von Muskeladenylsäure (Adenosin-5-monophosphorsäure) und ihren höheren Phosphorsäurederivaten aus Adenosin Die Adenosin-5-monophosphorsäure (Muskeladenylsäure) ist ein Bestandteil von tierischen Zellen, Gewebsflüssigkeiten und Bakterien. Sie tritt dort meistens in Form von höheren Phosphorsäureverbindungen auf (Adenosindiphosphorsäure, Adenosintriphosphorsäure, Cözymase). Bis jetzt ist die Adenylsäure nur durch Isolierung aus den obengenannten Stoffen, in freiem Zustand oder in °Form' ihrer Phosphor-'säurederiva'te dargestellt worden.
• Gegenstand der Patentschrift 591926 ist ein Verfahren zur Gewinnung der in der -Hefe in Form von Adenosintriphosphorsäure enthaltenen Muskeladenylsäure. Dieses Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß man aus sauren Hefeextrakten bzw. Hefeplasmolysaten gewonnene Rohextrakte hydrolysiert und dann eine Adenosinphosphorsäure isoliert. Der Patentanspruch erstreckt sich also auf die Gewinnung der zelleigenen Muskeladenylsäure aus Hefe.
• Das Wesen der vorliegenden Erfindung ist 0 die Synthese von @uskeladenylsäure aus Adenosin, welches durch enzymatische oder chemische Hydrolyse von Hefenucleinsäure gewonnen wird. Das Adenosin liegt in Form von Adenosin-3-monophosphorsäure (Hefeadenylsäure) vor, welche sich von der Muskeladenylsäure durch die Stellung des Phosphorsäurerestes und durch ihre biologischen und pharmakologischen Eigenschaften unterscheidet. ' In der Biochemischen Zeitschrift 286 (1g36) S. 336 bis 343 beschreibt Lehmann u. a. die Gleichgewichtsreaktion zwischen der Adenylsäure und Kreatinphosphorsäure; dagegen handelt es sich- bei vorliegendem Verfahren um eine enzymatische Synthese von Nucleotiden aus Nucleosiden, die mit der Umesterung zwischen Kreatin- und Argininphosphorsäure einerseits und dem Adenylsäuresystem andererseits nichts zutun hat.
• Die Synthese der Muskeladenylsäure und ihrer höheren Phosphorsäurederivate wird laut vorliegender Erfindung mittels Enzymen ausgeführt, und zwar durch Einwirkung von Hefe, Trockenhefe bzw. Hefeplasmolysat oder Hefeextrakt oder von aus diesen Stoffen bereiteten Enzympräparaten und Phosphat. Als Phosphat kommen anorganische Phosphatpuffeeösungen in Betracht. Wenn man z. B. AdAbsin in Phosphatpufferlösungen der Einwirkung von Hefe, Hefeplasmolysat oder Hefeextrakt unterwirft, so erfolgt Synthese von Muskeladenyisäure, Adenosintriphosphorsäure und Cozymase. Die Ausbeute wird durch Zusatz von vergärbarem Zucker, Zuckerphosphorsäureestern oder Phosphoglycerinsäure gesteigert. An Stelle von Adenosin können als Ausgangsstoffe für die Darstellung von Muskeladenylsäure mit Vorteil auch diejenigen Stoffe verwendet werden, welche sich in Adenosin spalten lassen (z. B. Hefeadenylsäure oder Hefenucleinsäure), wobei eine Isolierung von Adenosin gar nicht notwendig ist, da die verwendeten Enzympräparate Adenosin spezifisch phosphorylieren.
• In Hoppe-Seylers Zeitschrift für physiologische Chemie 225, S. 147 (I934) ist die Spaltung von Hefenucleinsäure durch eine aus Darmschleim gewonnene Nucleotidase beschrieben. Diese Spaltung führt keineswegs zur Muskeladenosinphosphorsäure, sondern durch die in dem unreinen Präparat enthaltene Desaminase über das Adenosin zum Inosin. Beispiel i In 11 1/lo-m-Phosphatpufferlösung vom pH=7 werden io g Adenosin gelöst; dann gibt man 300 g frische flüssige Bierhefe oder eine entsprechende Menge Trockenhefe bzw. Hefeextrakt und 20 ccm Toluol hinzu und schüttelt im Thermostat bei 37'. Alle 15 Minuten werden an kleinen Proben Phosphatbestimmungen vorgenommen. Wenn maximale Bindung von anorganischem PhosphatL eingetreten ist, wird die Reaktion durch Aufkochen oder Enteiweißen unterbrochen. Das aufgekochte oder enteiweißte Gemisch wird filtriert, aus dem Filtrat der Überschuß an anorganischem Phosphat mittels Bariumhydroxyd gefällt und die Fällung einige Male ausgekocht; die vereinigten Filtrate werden nach bekannten Verfahren auf Muskeladenylsäure aufgearbeitet.
• Die Ausbeute beträgt 5 bis io g Adenylsäure. Beispiel 2 In 11 1[5-m-Phosphatpufferlösung vom PH = 7 werden io g Adenosin, 2o g Glucose oder 2o g eines anderen vergärbaren Zuckers aufgelöst; dann gibt man 3oo g frische Bierhefe oder eine entsprechende Menge von Trockenhefe oder Hefeextrakt und 2o ccm Toluol hinzu und `-schüttelt bei 37'. Alle 15 Minuten wird an kleinen Proben die Menge von Adenosinpoly. phosphorsäuren bestimmt. Wenn das Maximum der Synthese erreicht worden ist, wird die Reaktion wie in Beispiel i unterbrochen und die Cofermente der Gärung (Adenosintriphosphorsäure, Adenosindiphosphorsäure, Cozymase) werden nach bekannten Verfahren abgetrennt. Beispiel 3 Die Synthese wird wie in Beispiel 2 ausgeführt, mit dem Unterschied, daß an Stelle von vergärbaren Zuckern 2o g phosphoglycerinsaures Natrium oder 2o g Natriumsalz eines der bekannten Zuckerphosphorsäureester zugesetzt werden (Neuberg-, Robison-, Cori-, Embden-, Harden- und Young-Ester).
• Beispiel*4 Die Synthese wird wie in Beispiel i ausgeführt, mit dem Unterschied, daß an Stelle von Adenosin direkt Hefeadenylsäure in einer Menge von 15 g verwendet wird. Bei längerer Gärung findet eine Spaltung von Hefeadenylsäure statt, und das Adenosin wird weiter zu Muskeladenylsäure umgebaut. Beispiel 5 50 g Hefenucleinsäure werden durch chemische oder enzymatische Mittel zu Nucleosiden hydrolysiert. Das Hydrolysat, aus dem gegebenenfalls das Guanosin entfernt worden ist, wird auf pH-7 neutralisiert und nach Beispiel i der Einwirkung von Enzymen unterworfen. Durch die Gegenwart anderer Nucleoside wird die Muskeladenylsäuresynthese nicht gestört.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Darstellung von Adenosin-5-monophosphorsäure (Muskeladenylsäure) und ihren höheren Phosphorsäurederivaten, dadurch gekennzeichnet, daß die Anlagerung von Phosphorsäureresten an Adenosin mittels der Einwirkung von frischer Hefe, Trockenhefe bzw. Hefeextrakt oder -plasmolysat auf Mischungen von Adenosin bzw. Stoffen; die sich in Adenosin spalten lassen, und anorganischem Phosphat, gegebenenfalls in Gegenwart von vergärbaren Zuckern, Zuckerphosphorsäureestern oder Phosphoglycerinsäure, durchgeführt wird.