DE2430999C2 - Neue Doppelsalze von S-Adenosyl-L-methionin mit Schwefel- und p-Toluolsulfonsäure, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel - Google Patents

Neue Doppelsalze von S-Adenosyl-L-methionin mit Schwefel- und p-Toluolsulfonsäure, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel

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Description

20
25
30
zur Gewinnung des Doppelsalzes
SAM+ · HSO4- · H2SO4-2CH3C6H4SO3H
die zur Auflösung des Salzes erforderliche Mindestmenge und zur Gewinnung des Doppelsalzes
SAM+ · HSO4- · H2SO4 · CH3C6H4SO3H
ein großer Oberschuß verwendet wird;
e) das gewünschte Doppelsalz durch Zugabe von Äther, Chloroform, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, selö-Butylalkohol, Isoamylalkohol oder Tetrahydrofuran ausfällt
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe b) unter Verwendung wäßriger Lösungen von Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure, deren Normalität zwischen 0,05 und 0,2 η liegt durchführt
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man die Stufe c) unter Verwendung von 4 bis 8 Volumina Aceton, Methanol, Äthanol oder Propanol, bezogen auf die wäßrige Lösung, durchführt
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe d) unter Verwendung von 10-20%igen Lösungen von p-ToIuolsulfonsäure in Methanol durchführt.
6. Arzneimittel mit einem Gehalt an Verbindungen gemäß Anspruch 1 und üblichen, pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
Die Erfindung betrifft den durch die Ansprüche näher bezeichneten Gegenstand.
SAM ist ein Produkt natürlichen Ursprungs, das in allen lebenden Organismen von Bakterien bis zu
NH2
CH3
Pflanzen, von einzelligen Organismen bis zu höheren Säugetieren einschließlich des Menschen gefunden wird und besitzt eine Struktur, die durch die folgende Formel wiedergegeben ist:
NH3
— CHj—S — CHj—CHj—CH — COOH
worin X - ein Anion darstellt
In lebenden Organismen wird SAM durch das Eingreifen von Enzymen (S-Adenosyhr.ethioninsynthetase oder S-Adenosyltransferase) im cytoplasmatischen Bereich, ausgehend von mit den Nahrungsmitteln aufgenommenen Methionin und von ATP, das in jeder lebenden Zelle als Energiereserve vorliegt, gebildet
Es ist auch bekannt, daß SAM ein Produkt von fundamentaler Bedeutung bei einer großen Zahl enzymatischer Transmethylierungen darstellt weshalb es in der Biochemie stets als sehr wichtiges Reagens bs betrachtet wurde.
Das große Problem bei dieser Substanz bestand jedoch immer in ihrer extremen Instabilität bei oder oberhalb Umgebungstemperatur und ihren Herstellungsmethoden, die mühsam sind und nicht leicht in industriellem Maßstab durchgeführt werden können.
In den letzten Jahren wurde die Forschung, die auf die Stabilisierung von SAM mit dem Ziel gerichtet war, seinen Gebrauch auf dem Gebiet biologischer Forschung zu ermöglichen, auf die Herstellung von Salzen gerichtet, die bei normalen Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen stabil sind.
Auf diese Weise wurde das Chlorid und das Bisulfat von SAM hergestellt, jedoch sind diese als Reagentien in der Biochemie nur kurze Zeit brauchbar, da ihre Stabilität selbst im trockenen Zustand bei tiefen Temperaturen beschränkt ist. Darüber hinaus sind die
Verfahren zu ihrer Herstellung zwar brauchbar für die Herstellung kleiner Mengen, jedoch nicht für die Herstellung im industriellem Maßstab.
Es wurden nun völlig unerwartet neue Salze von SAM gefunden, die bei Temperaturen bis zu 45°C zeitlich nahezu unbegrenzt stabil sind und die nach einem neuen Verfahren hergestellt werden können, das in industriellem Maßstab wirtschaftlich leicht durchführbar ist, wobei man hohe Ausbeuten erhält Es hat sich überraschend gezeigt, daß diese Salze eine starke Heilwirkung auf vielen Gebieten der Humantherapie besitzen, zwischen denen häufig offensichtlich keine Korrelation besteht
Die erfindungsgemäßen neuen Salze sind Doppelsalze von SAM mit p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure und entsprechen der Formel
SAM+ · HSO4- · H2SO4 · 2 CH3C6H4SO3H
bzw.
SAM+ · HSO4- · H2SO4 · CH3C6H4SO3H
Der mit diesen neuen Salzen erzielte große technische Fortschritt kann aus der folgenden Tabelle ersehen werden, die die Zeitstabilität bei 45° C in trockenem Zustand von zwei der stabilsten Salze von SAM, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, d. h. das Chlorid und Bisulfat, mit dem neuen Di-sulfat-di-ptoluolsulfonat vergleicht Die Werte beziehen sich auf den Prozentsatz an verbliebenem SAM nach den angegebenen Zeiten:
Tabelle I
Anion Zeit (Tage) 60 120 180
30 _ _ _
Chlorid 20 5 - -
Bisulfat 50 99,9 100.2 100,4
Disulfat-di-p- 100,1
toluolsulfonat
Die bei dem Disulfat-mono-p-toluolsulfonat erhaltenen Stabilitätswerte entsprechen völlig denen, die für das Disulfat-di-p-toluolsulfonat aufgeführt sind.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen neuen SAM-Salze, Salze, die bei Umgebungstemperatur praktisch unbegrenzt stabil sind, ist es möglich geworden, eine systematische pharmakologische und klinische Untersuchung durchzuführen, die zur Auffindung von therapeutischen Eigenschaften bei den neuen Salzen geführt hat, die in ihrer Qualität und Intensität völlig überraschend sind.
Bei den bereits gesicherten Indikationsgebieten handelt es sich um folgende: Behandlung von Hepatopien, Hyperdislipidämien, allgemeinen oder lokalen Arteriosklerosen, psychiatrischen Manifestationen des depressiven und neurologischen Typs, degenerativer Arthropathien, neuralgische/ Manifestationen und Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus. Die neuen SAM-Salze werden vorzugsweise durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder in oralen oder sublingualen Tabletten oder in Kapsein verabreicht.
Beim Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Salze geht man von einer an SAM angereicherten Lösung aus, die entweder durch Extraktion aus natürlichen Substanzen, die es enthalten, oder durch enzymatische Synthese aus Adenosintriphosphat (ATP) und Methionin erhalten worden ist
Eine Lösung, die SAM in hoher Konzentration enthält, kann beispielsweise dadurch erhalten werden, daß man Hefe (Saccharomyces Cervisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis), die durch Zugabe von Methionin unter geeigneten Bedingungen (Schlenk, Enzymologia 29,283 [1965]) mit SAM angereichert ist, mit Äthylacetat und anschließend mit Schwefelsäure, die eine Normalität zwischen 0,1 und OA vorzugsweise 0,35 η aufweist,
ίο bei Umgebungstemperatur behandelt, so daß eine Lysis der Zellen bewirkt wird und praktisch 100% des vorhandenen SAM in Lösung tritt
Günstigerweise verwendet man Mengen an Wasser und Acetat, die zwischen V20 und 1Zs des Gewichts der feuchten Zellen betragen und die Behandlung erfolgt 15 bis 45 Minuten, insbesondere 30 Minuten lang.
Anschließend gibt ma» Schwefelsäure zu und die Lysis wird während einer Zeit zwischen 1 Stunde und 2 Stunden, insbesondere l'/2 Stunden durchgeführt Die Lysis der Hefezellen mit einer Mischung organischer Lösungsmittel und verdünnter Schwefelsäure ist geeigneter als die normalerweise mit Perchlorsäure bei Umgebungstemperatur oder mit Ameisensäure oder Essigsäure bei 60° C durchgeführte Lysis, weil die Umgebungstemperatur der Stabilität des SAM sehr zuträglich ist und die Lösung leicht von zellulären Rückständen abfiltriert werden kann und keine Verunreinigungen enthält die bei der Verwendung anderer Lysismittel vorliegen und bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von reinem SAM schwierig zu entfernen sind.
Die enzymatische Synthese des SAM erfolgt durch Einwirkung des Enzyms S-Adenosylmethionin-synthetase (E.C. 2.4.2.12) auf eine Inkubationsmischung, die Adenosyltriphosphat (ATP) und Methionin enthält.
Die wesentliche Bedingung zur Durchfühbarkeit dieser Methode in industriellem Maßstab ist die, daß das Enzym rein ist und in einer Form vorliegt, die aus der anfänglichen Inkubationsmischung und aus dem hergestellten SAM leicht isolierbar ist.
Das Enzym läßt sich beispielsweise durch Affinitätschromatographie dadurch reinigen, daß man eine es enthaltende Lösung, beispielsweise einen rohen Extrakt von Hefe oder »Escherichia coli« durch eine Säule percoliert, die mit einem Trägerfeststoff gefüllt ist, an den eine Gruppe kovalent gebunden wurde, die als konkurrierender Inhibitor des Enzyms wirkt Eine ausgezeichnete Füllung für eine solche Reinigungssäule besteht aus einem aktivierten Gel von Polysacchariden, an welche L-Lysin kovalent gebunden ist Günstigerweise absorbiert man dann das Eluat, das das gereinigte Enzym enthält, an einem geeigneten Trägerfeststoff und führt die katalytische Reaktion zwischen Methionin und ATP, die zur Bildung von SAM führt, in einer damit gefüllten Säule durch. Ein geeigneter Trägerfeststoff ist beispielsweise ein Polysaccharid, das durch ein Reagenz aktiviert ist, das zur Bindung von Proteinen an feste Träger geeignet ist, beispielsweise Bromcyan. Percoliert man eine Lösung von ATP und Methionin in einer geeigneten Pufferlösung durch die Säule, so erhält man in der Basis der Säule ein Eluat, das das SAM enthält
Aus der an SAM angereicherten Lösung werden die erfindungsgemäßen Salze wie folgt hergestellt:
es a) Ausfällung des in der filtrierten wäßrigen Lösung vorhandenen SAM mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Pikrolonsäure oder mit Lösungen dieser Säure in organischen Lösungsmitteln, die in
Wasser löslich sind, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, n-Butanol oder Isobutanol, Aceton, Methyläthylketon, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Tetrahydrofuran, 2-Methoxyäthanol, 2-Äthoxyäthanol, Dioxan oder Dimethylformamid;
b) Auflösen des filtrierten Niederschlags in einer Mischung, bestehend aus gleichen Volumenteilen eines Lösungsmittels, das teilweise mit Wasser mischbar ist, die wie Methyläthylketon, Methylisobutylketon, n-Butanol oder Isobutanol und einer Lösung gleicher Normalität an p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure;
c) Abtrennen der organischen Schicht und Zugabe von Aceton, Methanol, Äthanol oder Propanol zur wäßrigen Lösung;
d) Wiederauflösen des Niederschlags in einer 10 bis 20%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol in den in Anspruch 2, Stufe d) angegebenen Mengenverhältnissen und Behandlung der Lösung mit entfärbender Aktivkohle;
e) Zugabe der in Stufe e) des Anspruchs 2 genannten organischen Lösungsmittels zum Konzentrat, wodurch das reine SAM in einer gut kristallinen und leicht filtrierbaren Form ausfällt.
Die Stufe a) des Verfahrens erlaubt es, das SAM in hoher Reinheit abzutrennen. In der Tat wird in saurer Umgebung durch Pikrolonsäure als einzige Verbindung das SAM ausgefällt, wie durch Dünnschichtchromatographie gemäß Anal. Biochem. 4,16 —28 (1971) gezeigt wird. Pikrolonsäure besitzt somit eine extreme und überraschend selektive Wirkung. Die anderen Fällungsmittel, die bislang zugesetzt wurden, wie Pikrinsäure, Reineckesalz oder Borsäure, ergeben unreine Fällungen, die stets eine anschließende Reinigung des SAM durch Ionenaustauscher-Säulenchromatographie erfordern, ein Verfahren, das extrem kostspielig ist und industriell schwierig auszuführen ist. Es ist auch schwierig, das Produkt in der erforderlichen Reinheit zu erhalten.
Die Verwendung wäßriger Lösungen von Pikrolonsäure oder Lösungen dieser Säure in den zuvor genannten organischen Lösungsmitteln ergibt keine besonderen Probleme, und es handelt sich um eine Operation, die bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird.
Die Stufe b) wird vorzugsweise mit Lösungen durchgeführt, die p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure in Konzenirationen jeweils zwischen 0,05 und 0,2 n, vorzugsweise 0,1 η enthalten, in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser teilweise mischbar ist, wie Methyläthylketon oder n-Butanol. Der Einsatz des organischen Lösungsmittels erlaubt eine wesentliche Verringerung der Menge an wäßriger sturer Lösung, ferner wird praktisch die gesamte Pikrolonsäure entfernt.
Die Stufe c) des Verfahrens wird durchgeführt, indem man vorzugsweise zwischen 4 und 8 Volumina Aceton, Methanol, Äthanol oder Propanol, bezogen auf das Volumen der wäßrigen Lösung, verwendet.
Es wurde überraschend gefunden, daß, wenn in Stufe d) die zur Auflösung des aus Stufe c) herrührenden Niederschlags benötigte Mindestmenge an methanolischer p-Toluolsulfonsäurelösung verwendet wird, in der anschließenden Fällungsstufe e) sich das Doppelsalz
SAM+ · HSO4- · H2SO4 · 2CH2C6H4SO3H
abscheidet.
Verwendet man jedoch in Stufe d) ein Volumen an methanolischer p-Toldolsulfonsäurelösung, das mindestens dem doppelten erforderlichen Volumen gleich ist, scheidet sich in der anschließenden Fällungsstufe e) das Doppelsalz
ab.
SAM+ · HSO4- · H2SO4 · CH3C6H4SO3H
Die Verwendung von dazwischenliegenden Mengen an Methanol führt zur Bildung von Mischungen der beiden Salze.
Die endgültige Fällung der erfindungsgemäßen Salze in Stufe e) erfolgt mit Äther, Chloroform, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, selc-Butylalkohol, Isoamylalkohol oder Tetrahydrofuran.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Doppelsalze von SAM können, wie bereits erwähnt, im trockenen Zustand im praktisch unverändertem Zustand unbegrenzt aufbewahrt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Salze.
Das neue erfindungsgemäße Verfahren erfordert bei keiner Stufe Temperaturen, die höher als Umgebungstemperatur sind, und es wird in saurer Umgebung durchgeführt. Dies ist sehr wichtig, um die Zersetzung des SAM zu vermeiden. Darüber hinaus erfordert es keine komplizierten und mühsamen Verfahren, wie Chromatographie über Säulen von Ionenaustauscherharz oder Kohlenstoff, wodurch es in industriellem Maßstab nur schwierig auszuführen wäre.
Beispiel 1
Zu 90 kg Hefe, die mit SAM (6,88 g/kg) gemäß Schlenk (Enzymologia 29, 283 [1965]) angereichet ist, gibt man bei Umgebungstemperatur 11 1 Äthylacetat und 11 1 Wasser. Nach 30minütigem energischem Rühren werden 501 035 η Schwefelsäure zugesetzt, wobei das Rühren weitere 1 '/2 Stunden fortgesetzt wird. Nach dem Filtrieren und Waschen mit Wasser erhält man 1401 Lösung, die 4,40 g/l SAM, entsprechend 99,5% des im Ausgangsmaterial vorhandenen SAM, enthält
Eine Lösung von 2,3 kg Pikrolonsäure in 251 Methyläthylketon gibt man unter Rühren zur obigen Lösung. Nach dem Stehen über Nacht wird der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen.
Der so erhaltene Feststoff wird unter Rühren zu einer Mischung von 181 einer 0,1 η Lösung Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure und 18 1 Methyläthylketon gegeben. Beim Stehenlassen trennt sich die organische Phase ab und wird in das Pikrolonsäure-Wiedergewinnungssystem eingespeist, und die wäßrige Phase wird mit wenig Methyläthylketon behandelt, um zurückgebliebene Spuren von Pikrolonsäure zu entfernen. Anschließend gibt man entfärbende Aktivkohle zu und filtriert
Diese Lösung (16,51) enthält 33,8 g/l SAM, entsprechend 90% der in der Hefe vorhandenen Verbindung. Bei der Analyse durch Dünnschichtchromatographie gemäß Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) ergibt sich, daß sie nur SAM ohne Spuren seines Zersetzungsprodukts oder anderer organischer Basen enthält. Die obige Lösung wird unter Rühren u\ 1001 Aceton gegossen. Man läßt stehen und dekantiert dann vom Lösungsmittel und löst den Feststoff in 3,3 kg einer 15%igen Lösung p-Toluolsulfonsäure in Methanol. Nach der Zugabe von entfärbender Aktivkohle wird die Mischung filtriert und zu 25 1 Äthyläther zugegeben.
Man erhält 1184g eines gut kristallinen Salzniederschlages, der leicht filtrierbar, nicht sehr hygroskopisch
und sehr löslich in Wasser ist (mehr als 20%), wobei sich eine farblose Lösung bildet. Das Salz ist nur wenig löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in Aceton, Methyläthylketon, Chloroform, höheren Alkohlen und Benzol. Durch Dünnschichtchromatographie gemäß Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971) wird gezeigt, daß das Produkt frei von jeglicher Verunreinigung ist.
Prozentuale Analyse des Salzes führt zu den folgenden Ergebnissen:
C 36,39%, H 4,6%, S 16,7%, N 8,8%
Die berechneten Werte für C29H42N6Oi9S5 (MG 938,98) sind:
C 37,09%, H 4,51%, N 8,95%, S 17,07%
Gefunden:
H2SO4 = 20,5%
p-Toluolsulfonsäure = 36,0%
SAM = 41,7%
Berechnet:
H2SO4 = 20,89%
p-Toluolsulfonsäure = 36,67%
SAM = 41,54%
Feuchtigkeit bestimmt gemäß K. Fischer: 1,7 - 2%.
Das UV-Spektrum der neuen Verbindung zeigt ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, £ i ™ = 182.
Diese Daten stimmen überein mit einer Verbindung der Formel
NH2
CH-CH-CH-CH-Ch2-S-CH2CH2-CH-COOH ■ H2SO4-2 CH3C6H4SO3H
OH OH
O
Die neue Verbindung wurde weiterhin durch die enzymatische Methode auf der Basis der enzymatischen Methylierung von Nikotinamid oder Guanidinessigsäure mit SAM (G.L. Cantoni, J. Biol. Chem. 189,745 (1951); G. De La Hoba, B. A. Jamieson, S. H. Mudd und H. H. Richards, J. Amer. Chem. Soc. 81, 3975 (1959) identifiziert
Beispiel 2
Man gibt 1,15 kg Pikrolonsäure, die in 10 1 Isobutylalkohol gelöst sind, zu 70 1 Lösung, die aus der Lysis von Hefezellen herrühren und die unter Verwendung desselben rohen Materials und derselben Methode wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurden. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird der gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt
Der abgetrennte Festkörper wird mit 91 einer 0,1 η Lösung Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure und mit 9 1 Methylisobutylketon behandelt Nach dem Stehenlassen wird die organische Phase abgetrennt, während die wäßrige Phase durch Waschen mit wenig Methylisobutylketon von Spuren von Pikrolonsäure befreit wird. Man gibt entfärbende Aktivkohle zu und filtriert die Mischung, wobei das Filtrat in 701 Methylalkohol gegossen wird. Nach dem Stehenlassen wird der gebildete Feststoff vom Lösungsmittel dekantiert und in einer 15%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1,65 kg) gelöst Nach dem Entfärben mit Aktivkohle wird das Filtrat zu 101 Chloroform gegeben, um einen leicht filtrierbaren kristallinen Niederschlag von SAM-disulfat-di-p-toluolsulfonat zu erhalten.
Das erhaltene Produkt (1110 g) ergibt bei der Analyse Ergebnisse, die mit dem des Produkts gemäß Beispiel 1 identisch sind.
Beispiel 3
1,15 kg Pikrolonsäure, gelöst in 121 n-ButanoL werden zu 701 einer Lösung gegeben, die von der Lysis von Hefezellen herrührt und die durch dieselbe Lysismethode und mit demselben rohren Material wie in Beispiel 1 erhalten wurde. Nach dem Stehenlassen über HSOr
Nacht wird der Niederschlag durch Znetrifugieren abgetrennt. Der erhaltene Feststoff wird zwischen 9 I einer 0,1 η Lösung Schwefelsäure und p-Toluolsulfonsäure und 12 1 n-Butanol verteilt Nach dem Stehenlassen wird die organische Phase abgetrennt, während die wäßrige Phase durch Waschen mit wenig n-Butanol von Spuren Pikrolonsäure befreit wird. Man gibt anschließend entfärbende Aktivkohle zu und filtriert die Mischung, wobei man das Filtrat in 65 1 n-Propylalkohol gießt Nach dem Stehenlassen wird der ausgefällte Feststoff vom Lösungsmittel dekantiert und in einer 15%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1,65 g) gelöst
Nach dem Entfärben mit Aktivkohle wird das Filtrat in 14 1 n-Butanol gegossen, um einen gut filtrierbaren kristallinen Niederschlag von SAM-disulfat-di-p-toluolsulfonat zu erhalten.
Das Endprodukt (1155 g) ergibt bei der Analyse dieselben Ergebnisse wie das Produkt gemäß Beispiel 1.
Beispiel 4
a) Reinigung des spezifischen Enzyms
50 ml eines perlförmigen, in Wasser suspendierten Polysaccharids behandelt man mit Bromcyan nach den bekannten Methoden zur Bindung von Amingruppen enthaltenden Substanzen an Matrizen aus PolysaccharidgeL
Man gibt zu dem so hergestellten Gel einen Überschuß an L-Lysin. Nach der Reaktion wird es wiederholt mit destilliertem Wasser, mit einer Puffermischung von pH 84 und mit einer Puffermischung von pH 4,5 gewaschen. Das Gel wird dann zur Füllung eine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 30 cm verwendet Eine Puffermischung von 0,05 m Triethanolamin und 0,01 m H2SO4 mit einem pH von 8,0 wird durch die Säule gegeben, bis eine vollständige Äquilibrierung erreicht ist Man gibt 2 ml Hefeextrakt, der das spezifische Enzym enthält, und der durch Ultraschallbehandlung oder durch Homogenisierung mit Trockeneis und gegebenenfalls nach Anreiche-
rung mit dem spezifischen Enzym erhalten wurde, auf die Säule. Die Säule wird dann mit derselben Puffermischung, die zur Äquilibrierung verwendet wurde, eluiert, wobei die Verteilung der Proteine im Eluat durch ultraviolett-spektroskopische Messungen verfolgt wird. Gleichzeitig wird die Synthetaseaktivität in den verschiedenen Fraktionen nach J. A. Stekol, Methods in Enzymology, Vol. 6, Seite 566 (1963) gemessen. Die Fraktionen, die eine relevante Aktivität aufweisen, werden zusammengegeben, und die so erhaltene Lösung zeigt eine spezifische Aktivität, die mindestens zwanzigmal größer ist als die des rohen Extraktes. Das Enzym kan in dieser Lösung durch Ausfällen mit Salzen, mit organischen Lösungsmittel oder gemäß anderen bekannten Methoden zu Konzentrierung von Proteiniösungen weiter konzentriert werden.
b) Herstellung von SAM
30 ml perlförmiges Polysaccharidgel werden mit Bromcyan nach bekannter Methode aktiviert 4 ml einer Lösung des wie oben gereinigten spezifischen Enzyms, die ungefähr 100 mg Protein enthält, werden zum aktivierten Gel zugegeben. Die Suspension des aktivierten Gels und die Enzymlösung werden 18 Stunden bei 4° C gerührt. Das Gel wird mit Wasser gewaschen. Diese Waschflüssigkeit enthält ungefähr 70% der gesainten Enzymaktivität, die anfänglich in der Lösung des spezifischen Enzyms vorhanden war. Angenähert 20% der Gesamtaktivität ist an das Polysaccharid gebunden.
Man verwendet das wie oben hergestellte Polysaccharid, um r?ine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 20 cm zu beladen. Eine Lösung, die 0,675 m Triethanolamin, 0,150 m Magnesiumsulfat, 0,05 m ATP, 0,05 m L-Methionin und 0,01 m KCl enthält, wird durch die Säule in einer Geschwindigkeit von 5 ml pro Stunde und bei einer Temperatur von 25 bis 27°C durchgegeben.
Das auf den Gehalt von SAM analysierte Eluat aus der Säule zeigt, daß die Ausbeute der Umwandlung 30% beträgt.
c) Herstellung von Doppelsalzen von SAM
mit Schwefelsäure und p-Toiuolsulfonsäure
103 ml Eluat, das 6 g/l SAM enthält, werden mit H2SQ4 angesäuert, bis ein pH von 3 erreicht ist, und man gibt hierzu unter Rühren eine Lösung von 2,3 g Pikrolonsäure in 25 ml Methylethylketon. Man läßt eine Nacht stehen, filtriert den Niederschlag und wäscht mit Wasser. Der Niederschlag wird in 18 ml einer 0,1 η ■■> Lösung H2SO4 und p-Toluolsulfonsäure und 18 ml Methyläthylketon wieder aufgelöst.
Nach Rühren und Stehenlassen wird die organische Schicht abgetrennt und die wäßrige Schicht wird mit wenig Methyläthylketon behandelt, um die letzten
in Spuren an Pikrolonsäure zu entfernen. Nach dem Abtrennen der Wasserschicht wird entfärbende Aktivkohle zugesetzt und die Mischung filtriert. Man erhält 16,5 ml einer wäßrigen farblosen Lösung, die 33,8 g/l SAM, entsprechend 90% des in der Ausgangslösung ·) enthaltenen SAM, enthält. Bei der Dünnschichtchromatographie zeigt sich, daß die Lösung nur SAM enthält. 16,5 ml der Lösung werden in 100 ml Aceton gegossen. Nach Rühren und Stehenlassen wird die Flüssigkeit durch Dekantieren abgetrennt. Der Feststoff wird in
2(1 6,6 g einer 15%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol aufgelöst. Nach der Zugabe von entfärbender Aktivkohle und nach Filtrieren wird die Lösung in 25 ml Äthyläther gegossen. Nach dem Stehenlassen wird filtriert. Das erhaltene gut kristalline Salz wigt 0,967 g
:3 und hat die Zusammensetzung:
SAM+ ■ HSO4- · H2SO, ■ CH3C6H4SO3H
Analyse: C22H34O16N6S4
Ber.: C 34,36 H 4,47
gef.: C 33,68 H 4,65
N 10,96 S 16,72%
N 10,8 S 16,5%
SAM+ 50,5%, H2O 2.1%; H2SO4 25.3%; p-Toluulsulfonsäure21.7%.
Das Ultraviolett-Spektrum zeigt ein Maximum bei 260 nm, E\"! =179.
Wiederholt man das Verfahren auf gleiche Weise, wöbe: man jedoch 3,3g einer *5%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol und In der anschließenden Ausfällungsstufe 25 ml Äthyläther verwendet, erhält man 1,18 g des Salzes
SAM+ - H2SO4 ■ 2CH3O1K4SO3H
das Eigentum besitzt, die mit denen für das Produkt gemäß Beispie! 1 angegebenen übereinstimmen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Doppelsalze von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) mit Schwefelsaure und p-Toluolsulfonsäure der Zusammensetzung
SAM+ · HSO4- · H2SO4 · (CH3C6H4SO3H)n
worin π die Bedeutung 1 oder 2 besitzt
2. Verfahren zur Herstellung der Doppelsalze gemäß Anspruch 1, ausgehend von einer an SAM angereicherten Lösung, die durch Extraktion aus Hefe oder durch enzymatische Synthese aus Adenosintriphosphat und Methionin erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man:
a) das in der Lösung vorhandene SAM durch Ansäuern mit einer Lösung von Pikrolonsäure ausfällt;
b) das SAM-Pikronolat in einer Mischung, bestehend aus gleichen Volumenteilen einer wäßrigen Lösung gleicher Normalitäten von p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure und einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser teilweise mischbar ist, löst;
c) aus der wäßrigen Schicht durch Aceton, Methanol, Äthanol oder Propanol ein SAM-SaIz ausfällt;
d) das ausgefällte Salz in einer Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol auflöst, wobei
10
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