DE2833940C2

DE2833940C2 -

Info

Publication number: DE2833940C2
Application number: DE2833940A
Authority: DE
Inventors: Toshihisa Kawahara; Goro Choshi Chiba Jp Motoki
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba Jp
Current assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba Jp
Priority date: 1977-08-03
Filing date: 1978-08-02
Publication date: 1987-11-19
Also published as: IT1106865B; GB2001976B; IT7850578A0; DE2833940A1; GB2001976A; US4242505A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Präparat, welches S-Adenosyl-L-Methionin (im folgenden als SAM bezeichnet) als Wirkstoff und ein Schwefelsäureäquivalent (worunter im Rahmen der Erfindung H₂SO₄, HSO₄^- und SO₄^-- zu verstehen ist) als Stabilisierungsmittel gegen die Zersetzung der SAM-Komponente enthält.

Die SAM-Komponente ist eine physiologisch aktive Substanz und spielt eine wichtige Rolle als Methylgruppendonator bei Methylierungsreaktionen, die im lebenden Organismus mittels Transmethylasen ablaufen. Zum Beispiel stellt die SAM-Komponente als Methylgruppendonator bei Transmethylierungsreaktionen, wie der in-vivo-Methylierung hochmolekularer Stoffe, beispielsweise von Nucleinsäure, Eiweiß und Fett, ferner bei der Bildung von Kreatin aus Guanidinacetat und von Cholin aus Äthanolamin eine unentbehrliche Substanz dar. Demgemäß ist die SAM-Komponente ein wertvolles therapeutisches Mittel bei Stoffwechselstörungen. Über ihren therapeutischen Wert bei der Behandlung von Leberleiden, Hyperdislipedemia, genereller und lokaler Arteriosklerose, psychisch und nervlich bedingten Depressionen, degenerativen Arythromatien, neurologisch bedingten Schmerzzuständen sowie Störungen des Schlafrhythmus ist bereits berichtet worden.

Bei der praktischen Verwendung in Arzneimitteln erweist sich die SAM-Komponente jedoch schon bei Zimmertemperatur als äußerst instabil, und es stellt sich als ernsthaftes Problem, daß die SAM-Komponente allein in Arzneimitteln kaum verwendet werden kann. Infolgedessen ist sie in Form von anionischen Salzen, wie als Iodid, Bromid, Reineckes Salz, Hydrochlorid und Sulfat hergestellt worden; jedoch erweisen sich alle diese Salze bei der Lagerung als instabil. Beispielsweise zersetzt sich in Trockenform bei Zimmertemperatur gelagertes SAM-Hydrochlorid innerhalb von 4 Tagen etwa zur Hälfte, bezogen auf seine ursprüngliche Menge.

Neuerdings sind als stabilisierte SAM-Salze das p-Toluolsulfonat (GB-PS 14 25 384), das Doppelsalz mit p-Toluolsulfonsäure und Schwefelsäure (US-PS 39 54 726), das Methansulfonat, Äthansulfonat, 1-n-Dodecansulfonat, 1-n-Octadecansulfonat, 2-Chloräthansulfonat, 2-Bromäthansulfonat, 3-Hydroxypropansulfonat, Campher-10-sulfonat, 3-Bromcampher-10-sulfonat, Cysteinat, Benzolsulfonat, p-Chlorbenzolsulfonat, 2-Mesitylbenzolsulfonat, 4-Biphenylsulfonat, 1-Naphtalinsulfonat, 5-Sulfosalicylat, p-Acetylbenzolsulfonat, 1,2-Äthandisulfonat, o-Benzoldisulfonat, Chondroitinsulfat sowie die Doppelsalze mit den genannten Sulfonsäuren und Schwefelsäure (US-PS 40 57 686) entwickelt worden.

Einige dieser bekannten, aus den entsprechenden Sulfonsäuren und Schwefelsäure hergestellten Sulfonate bzw. Doppelsalze bringen jedoch Probleme mit sich, entweder aufgrund hygroskopischer Eigenschaften und einer unbefriedigenden Stabilität oder aber, weil sie komplizierte Verfahren für ihre Herstellung und Reindarstellung erforderlich machen. Darüber hinaus verursachen die in diesen Salzen enthaltenen Sulfonsäuren oft Reizerscheinungen oder sind giftig. Im Hinblick auf die Verwendung von SAM in Arzneinmitteln können die vorstehend erwähnten Sulfonate bzw. die aus den Sulfonsäuren und Schwefelsäure hergestellten Doppelsalze nicht immer als harmlos bezeichnet werden.

Aufgabe der Erfindung war es daher, die SAM-Komponente als Wirkstoff enthaltende Präparate zur Verfügung zu stellen, welche im Hinblick auf ihre Lagerstabilität, ihre Unschädlichkeit im lebenden Organismus sowie ihre großtechnische Herstellung ein optimales Verhalten zeigen.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch die Mitverwendung eines Nucleosidmono- und/oder -disulfats.

Das erfindungsgemäße S-Adenosyl-L-Methionin (=SAM) enthaltende Präparat, welches durch ein Schwefelsäureäquivalent gegen eine Zersetzung der SAM-Komponente stabilisiert ist, ist daher dadurch gekennzeichnet, daß dieses außer der Wirkstoff-Komponente S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) noch ein Nucleosidmonosulfat oder Nucleosiddisulfat oder ein Gemisch von diesen enthält.

Die Nucleosidsulfate (nachstehend als NS abgekürzt) führen überraschenderweise zu einer signifikanten Verbesserung der Haltbarkeit der SAM-Komponente und damit zu einer erhöhten Lagerstabilität.

Das Molverhältnis von SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu NS beträgt angesichts der für das SAM angestrebten Lagerstabilität sowie der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und ähnlicher Faktoren vorzugsweise 1 : (1 bis 3) : (0,5 oder darüber). Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden im allgemeinen als weißes Pulver hergestellt, und das in ihnen enthaltene SAM weist bei der Trockenlagerung sowohl bei Zimmertemperatur als auch bei höheren Temperaturen eine gute Lagerstabilität auf.

Den Methoden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung der vorstehend beschriebenen Konstitution und Eigenschaften sind keine speziellen Grenzen gesetzt, jedoch bieten sich hier zwei bevorzugte Methoden an:

(A) Kontaktieren einer wäßrigen Lösung, welche SAM, ein Schwefelsäureäquivalent und ein NS (im folgenden als die Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bezeichnet) mit einem organischen Lösungsmittel und Ausfällen sowie Abtrennen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (im folgenden als Verfahren A bezeichnet);
(B) Abdampfen bzw. Abdestillieren des wäßrigen Lösungsmittels aus der Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bis zum Erreichen des Trockenzustands und Gewinnen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (im folgenden als Verfahren B bezeichnet).

In der vorliegenden Offenbarung bedeutet die Bezeichnung "wäßrige Lösung" eine Lösung in Wasser oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, und die Bezeichnung "wäßriges Lösungsmittel" bedeutet Wasser, ein hydrophiles bzw. mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel oder aber ein wasserhaltiges hydrophiles oder mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel. Die Begriffe "hydrophil" und "mit Wasser mischbar" sind hier gleichbedeutend.

Die Natur der Erfindung, die mit dieser verbundenen Vorteile sowie deren einzelne Merkmale gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, in der die verschiedenen erfindungsgemäßen Aspekte zunächst allgemein behandelt und dann anhand wertvoller Testergebnisse, praktischer Beispiele bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung sowie Bezugsbeispielen im Detail aufgezeigt werden.

(1) Herstellung von SAM

Die Herstellung von SAM per se ist nicht Teil der Erfindung und kann auf jede beliebige Art und Weise erfolgen.

Den Ausgangsstoffen und Methoden zur Herstellung des in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu verwendenden SAM sind keine speziellen Grenzen gesetzt. Es bieten sich beispielsweise folgende Verfahren an:

(a) Man züchtet in einem methioninhaltigen Medium eine Kultur von Mikroorganismen vom Stamm Saccharomyces, Candida, Hansenula, Mycotorula, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Kloeckera, Cryptococcus, Hanseniaspora, Sporobolomyces, Lipomyes, Trichosporon, Torula, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus oder Mucor, läßt das SAM sich in den mikrobischen Zellen und/oder der Kulturbrühe anreichern, unterwirft zunächst das in den mikrobischen Zellen enthaltene SAM einer Extraktion mit einem Extraktionsmittel wie Perchlorsäure, einem Acetatester, einem Formiatester, Trichloressigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, und unterzieht anschließend das in dem entstandenen Extrakt und der Kulturbrühe enthaltene SAM einem Reinigungsschritt.
(b) Man bringt eine adenosintriphosphat- und methioninhaltige wäßrige Lösung mit einer Methioninadenosyltransferase enthaltenden Substanz, beispielsweise einem löslichen Enzym, einem auf einem geeigneten Träger immobilisierten Enzym oder (trockenen) mikrobischen, das Enzym enthaltenden Zellen zur enzymatischen Synthese des SAM in Berührung und unterwirft das entstandene Produkt dann einem Reinigungsschritt (japanische Patentanmeldung Nr. 71 128/1977).

(2) Reindarstellung des SAM

Den Methoden zur Reinigung einer SAM-haltigen Lösung, aus der alle festen Stoffe entfernt worden sind, wie der Zellextrakt, die Kulturbrühe oder die enzymatische Syntheselösung, sind keine besonderen Grenzen gesetzt. Im allgemeinen werden folgende Verfahren angewandt:

(a) Der pH-Wert der SAM-haltigen Lösung wird auf einen Wert zwischen 3 und 7 eingestellt. Alsdann wird die Lösung mit einem Chelatharz, beispielsweise Diaion CR 10 (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) und Dowex A-1 (Handelsname, Hersteller: Dow Chemical Company, USA), einem stark sauren Kationenaustauschharz, beispielsweise Dowex 50 W × 8 (Handelsname, Hersteller: Dow Chemical Company, USA) und Amberite IR-200 (Handelsname, Hersteller: Rohm & Haas Company, USA), oder einem schwach sauren Kationenaustauschharz, beispielsweise Diaion WK 10 (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan), Amberite IRC-50 und Amberite IRC-84 (Handelsname, Hersteller: Rohm & Haas Company) sowie Imac Z5 (Handelsname, Hersteller: Shin-etsu Kagaku K. K., Japan) zur Adsorption des SAM auf diesen Harzen in Berührung gebracht. Danach wird das SAM mit einer Säurelösung einer geeigneten Konzentration fraktionierend eluiert. Das gereinigte SAM wird hier als das SAM-Salz der beim Eluieren verwendeten Säure erhalten.
Zum Eluieren geeignete Säuren sind u. a. eine Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure, eine Carboxylsäure, beispielsweise Ameisensäure oder Essigsäure, ein Nucleosidsulfat (welches aber nicht das gleiche sein muß wie das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene NS) oder eine organische Sulfonsäure, beispielsweise p-Toluolsulfonsäure. Das entstandene Eluat kann in dem Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, so wie es ist, verwendet werden. Im allgemeinen wird das Eluat jedoch mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Aceton, Dioxan, Methoxyäthanol, Äthyläther oder Gemischen von diesen, oder aber mit einer Lösung von Phosphorwolframat, Pikrinsäure oder Pikrolonsäure in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel behandelt, um das SAM-Salz auszufällen, welches dann isoliert und zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet wird.
(b) Andererseits kann auch eine SAM-haltige Lösung, welche nicht der Behandlung in der Extraktionssäule unterworfen worden ist, mit einer gesättigten Lösung von Pikrolonsäure in Wasser oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel versetzt und das SAM selektiv als das Pikrolonat ausgefällt werden.

(3) Das Schwefelsäureäquivalent

Unter der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Bezeichnung "Schwefelsäureäquivalent" ist H₂SO₄ bzw. HSO₄^- und/oder SO₄^-- zu verstehen. Typischerweise gelangt das "Schwefelsäureäquivalent" in Form von SAM-Sulfat oder einer Lösung, die sowohl SAM als auch NS enthält, und welcher H₂SO₄ zugesetzt wird, bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in das Endprodukt. Das Schwefelsäureäquivalent könnte in Form von Schwefelsäure, in Form des Hydrogensulfatanions oder als Sulfatanion in den erfindungsgemäßen Präparaten vorliegen. Die genaue Form seines Vorliegens ist bisher jedoch nicht bekannt. Daher wird in der vorliegenden Erfindung der Begriff "Schwefelsäureäquivalent" zur Bezeichnung aller drei Schwefelsäureformen verwendet.

(4) Die Nucleosidsulfate

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Nucleosidsulfate (NS) umfassen im allgemeinen die Derivate von Ribonucleosid und Deoxyribonucleosid, in denen die Hydroxylgruppe bzw. -gruppen in der 2′-, 3′ und/oder 5′-Stellung (das Deoxyribonucleosid hat in der 2′-Stellung keine Hydroxylgruppe) mono- oder disulfatiert ist bzw. sind.

Die Zuckerreste dieser Stammnucleoside können beispielsweise Pentosen oder Deoxypentosen sein; diese Zuckerreste können geeignete Substituenten und/oder Schutzgruppen aufweisen, es sei denn, diese substituierten Reste haben eine ungünstige Wirkung im Hinblick auf den Zweck der vorliegenden Erfindung und die Wirkung ist dem nicht substituierten Rest äquivalent. Die als Bausteine dienenden Basen dieser Stammnucleoside können beispielsweise auch Purin oder Pyrimidin sein, und diese können die gleichen geeigneten Substituenten und/oder Schutzgruppen aufweisen wie die Zuckerreste. Darüber hinaus kann die freie Sulfat-Hydroxylgruppe der Nucleosidsulfate (d. h. die Gruppe, die mit dem Nucleosid keinen Ester bildet) in Form ihrer funktionellen Derivate, wie Salze, Ester und dergleichen, vorliegen, es sei denn, diese Derivate haben eine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ungünstige Wirkung.

Die Nucleosidsulfate werden im folgenden noch eingehender beschrieben.

(a) Das NMS

Das NMS, eine Ausführungsform des NS, ist ein Monosulfatderivat von Nucleosiden mit einem Purin- oder Pyrimidin-Basen- Baustein sowie einem Zuckerrest aus Pentose oder Deoxypentose, in dem die Hydroxylgruppe in der 2′-, 3′- oder 5′-Stellung sulfatiert worden ist. Erfindungsgemäße Beispiele für das NMS sind die 2′-, 3′- oder 5′-Monosulfate eines bestimmten frei vorkommenden Nucleosids oder eines bestimmten modifizierten Nucleosids, oder aber Gemische von diesen, die bei der Bildung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung aus SAM und einem Schwefelsäureäquivalent zur Stabilisierung des SAM beitragen. Solche natürlichen Nucleoside sind beispielsweise Inosin, Adenosin, Guanosin, Xanthosin, Uridin, Cytidin, Deoxyinosin, Deoxyadenosin, Deoxyguanosin, Deoxyxanthosin, Thymidin und Deoxycytidin; zu den modifizierten Nucleosiden gehören zum Beispiel Derivate dieser frei vorkommenden Nucleoside, deren Nucleinsäure-Grundbausteine geeignete Substituenten ausweisen. Ein solcher typischer Substituent ist eine Alkylgruppe, wie Methyl und Äthyl, ein Halogen, wie Chlor, Fluor, Iod und Brom, eine Acylgruppe, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Succinyl, Benzoyl, eine Acrylgruppe, wie Phenyl und Tolyl, eine Aralkylgruppe, wie Benzyl und Phenäthyl, eine substituierte oder nicht substituierte Aminogruppe, wie Dimethylamin, Diäthylamin und Amin, eine Alkoxygruppe, wie Methoxy oder Äthoxy, oder aber eine Hydroxygruppe.

Im einzelnen sind Beispiele für das NMS Inosin-5′-monosulfat, Adenosin-5′-monosulfat, Guanosin-5′-monosulfat, Uridin-5′-monosulfat, Cytidin-5′-monosulfat, Xanthosin-5′-monosulfat, Thymidin-5′-monosulfat, Deoxyguanosin-5′-monosulfat, Deoxyinosin- 5′-monosulfat, Inosin-2′(3′)-monosulfat, Adenosin-2′- (3′)-monosulfat, Guanosin-2′(3′)-monosulfat, Cytidin-2′(3′)-monosulfat, Uridin-2′(3′)-monosulfat, Thymidin-3′-monosulfat, Deoxyinosin-3′-monosulfat, Deoxyadenosin-3′-monosulfat, Deoxyguanosin- 3′-monosulfat sowie Deoxycytidin-3′-monosulfat, welche im folgenden als 5′-IMS bzw. 5′-AMS bzw. 5′-UMS bzw. 5′-CMS bzw. 5′-XMS bzw. 5′-TMS bzw. 5′-dGMS bzw. 5′-dIMS bzw. 2′(3′)-IMS bzw. 2′(3′)-AMS bzw. 2′(3′)-GMS bzw. 2′(3′)-CMS bzw. 2′(3′)-UMS bzw. 3′-TMS bzw. 3′-dIMS bzw. 3′-dAMS bzw. 3′-dGMS bzw. 3′-dCMS bezeichnet werden. NMS-Verbindungen, die einen besonders deutlichen Effekt hinsichtlich der Stabilisierung des SAM in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zeigen, sind 5′-IMS, 5′-UMS, 5′-CMS, 5′-GMS, 5′-AMS, 3′-TMS, 2′(3′)-AMS, 2′(3′)-CMS und 2′(3′)-UMS. Die Purin-Deoxynucleosidmonosulfate sind nicht immer geeignet, da sie sich bei dem für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erforderlichen pH-Wert leicht zersetzen.

(b) Das NDS

Das NDS, eine weitere Ausführungsform des NS, ist ein Disulfatderivat von Nucleosiden mit einem Purin- oder Pyrimidin- Nucleinsäure-Basen-Baustein und einem Zuckerrest aus Pentose oder Deoxypentose, in dem zwei der Hydroxylgruppen in 2′-, 3′- und 5′-Stellung sulfatiert worden sind. Erfindungsgemäße Beispiele für das NDS sind die 2′(3′),5′- 2′,3′- oder 3′,5′-Disulfate bestimmter frei vorkommender Nucleoside sowie bestimmter modifizierter Nucleoside, auch in Form von Gemischen, welche bei der Bildung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung aus SAM und einem Schwefelsäureäquivalent zur Stabilisierung des SAM beitragen. Beispiele für solche natürlichen Nucleoside sind Inosin, Adenosin, Guanosin, Xanthosin, Uridin, Cytidin, Deoxyinosin, Deoxyadenosin, Deoxyguanosin, Deoxyxanthosin, Thymidin und Deocytidin; geeignete modifizierte Nucleoside sind beispielsweise die Derivate dieser frei vorkommenden Nucleoside, deren Nucleinsäure-Basen- Bausteine geeignete Substituenten aufweisen, wie sie vorstehend für die NMS-Derivate beschrieben worden sind.

Beispiele für das NDS sind insbesondere Inosin-2′-(3′),5′- disulfat, Adenosin-2′-(3′),5′-disulfat, Guanosin-2′-(3′),5′-disulfat, Xanthosin-2′-(3′),5′-disulfat, Uridin-2′-(3′),5′ -disulfat, Cytidin-2′-(3′),5′-disulfat, Thymidin-3′,5′-disulfat, Deoxyinosin-3′,5′-disulfat, Deoxyadenosin-3′,5′-disulfat, Deoxyguanosin-3′,5′-disulfat, Deoxyxanthosin-3′,5′-disulfat, Deoxycytidin-3′,5′-disulfat, Adenosin-2′,3′-disulfat, Inosin- 2′,3′-disulfat, Guanosin-2′,3′-disulfat, Xanthosin-2′,3′-disulfat, Cytidin-2′,3′-disulfat sowie Uridin-2′,3′-disulfat, welche im folgenden als 2′(3′),5′-IDS bzw. 2′(3′),5′-ADS bzw. 2′(3′),5′-GDS bzw. 2′(3′),5′-XDS bzw. 2′(3′),5′-UDS bzw. 2′(3′),5′-CDS bzw. 3′,5′-TDS bzw. 3′,5′-dIDS bzw. 3′,5′- dADS bzw. 3′,5′-dGDS bzw. 3′,5′-dXDS bzw. 3′,5′-dCDS bzw. 2′,3′- ADS bzw. 2′,3′-IDS bzw. 2′,3′-GDS bzw. 2′,3′-XDS bzw. 2′,3′- CDS bzw. 2′,3′-UDS bezeichnet werden. Die NDS-Verbindungen, welche hinsichtlich der Stabilisierung des in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltenden SAM eine besonders deutliche Wirkung zeigen, sind 3′,5′-TDS; 2′(3′),5′-CDS; 2′(3′), 5′-ADS; 2′(3′),5′-UDS; 2′,3′-ADS und 2′,3′-UDS. Die Purindeoxynucleosidsulfate sind nicht immer geeignet, da sie sich bei dem für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendeten bzw. erforderlichen pH-Wert leicht zersetzen.

(5) Herstellung von NMS

Das NMS wird im allgemeinen synthetisch hergestellt. Dem Syntheseverfahren sowie der Methode für die Reindarstellung der NMS-Verbindungen sind nach der vorliegenden Erfindung keine besonderen Grenzen gesetzt.

Beispiele entsprechender Verfahren sind nachstehend angegeben.

(i) Zur Herstellung verschiedener Nucleosidsulfate (NS), bei der ein Stammnucleosid mit einem Pyrosulfat, einem Hydrogensulfat und/oder Schwefelsäure in einem Amid-Lösungsmittel umgesetzt wird, werden die Reaktionen zur Herstellung von 5′-NMS etwa 2 bis 3 Stunden bei Temperaturen zwischen 0 und 40°C und zur Herstellung von 2′- oder 3′-NMS etwa 2 bis 3 Stunden bei Temperaturen zwischen 50 und 100°C durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird die Reaktionslösung einer Adsorption auf ein Anionenaustauschharz und anschließend einer fraktionierten Eluierung unterworfen. Das das NMS enthaltende Eluat wird ggfs. entsalzt, anschließend aufkonzentriert und das NMS dann hieraus mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels ausgefällt (japanische Patentanmeldung Nr. 47 822/1978).
(ii) Das Stammnucleosid wird zur selektiven Synthese von 5′- NMS mit Triäthylamin-N-sulfonsäure in Formamid und/oder Dimethylformamid umgesetzt. Die anschließende Reindarstellung und Trennung erfolgt auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben (japanische Offenlegungsschrift Nr. 26 882/1976).
(iii) Das Stammnucleosid wird zur Herstellung von NMS mit Triäthylamin-N-sulfonsäure in einem pyridinhaltigen Lösungsmittel umgesetzt. Die anschließende Reindarstellung und Trennung erfolgt auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben.
(iV) Zur Synthese von NMS läßt man eine Chloroformlösung von Chlorsulfonsäure auf eine Pyridinlösung des Stammnucleosids einwirken. Die anschließende Reindarstellung und Trennung erfolgt auf dieselbe Weise wie vorstehend angegeben (Bulletin of the Chemical Society of Japan, Band 28, Nr. 9 [1955]).

Bei den vorstehend beschriebenen, nicht selektiven Sulfatierungsverfahren kann dabei die 2′- oder 3′-Hydroxylgruppe des Nucleosids selektiv sulfatiert werden, wenn die 5′-Hydroxylgruppe durch eine geeignete Schutzgruppe, wie Trityl, Monomethoxytrityl oder Acyl, geschützt ist. Die 5′-Hydroxylgruppe kann selektiv sulfatiert werden, wenn die 2′- und 3′-Hydroxylgruppen durch eine Alkylidengruppe, beispielsweise eine Isopropylidengruppe, geschützt werden. Die Entfernung der Schutzgruppe kann auf jede geeignete herkömmliche Weise erfolgen.

(6) Herstellung von NDS

Im allgemeinen wird auch das NDS synthetisch hergestellt. Erfindungsgemäß sind sowohl dem Syntheseverfahren als auch der Methode für die Reindarstellung der NDS-Verbindungen keine speziellen Grenzen gesetzt. Beispielsweise kann das NDS nach den vorstehend zum Erhalt von NMS beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wobei die Menge des verwendeten Sulfatierungsmittels, die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit im Hinblick auf die Herstellung von NDS entsprechend eingestellt werden.

Geeignete Verfahrensbeispiele sind nachfolgend angegeben:

Die Synthese des NDS kann nach dem Verfahren zur Herstellung von NMS durch Umsetzen des Stammnucleosids mit einem Pyrosulfat, einem Hydrogensulfat und/oder Schwefelsäure in einem amidhaltigen Lösungsmittel bei Reaktionstemperaturen zwischen 50 und 100°C und einer Reaktionszeit von etwa 6 bis 7 Stunden erfolgen (japanische Patentanmeldung Nr. 47 822/1978). Desgleichen kann das NDS in der entsprechenden Form nach dem in der vorstehend erwähnten japanischen Offenlegungsschrift Nr. 26 882/1976 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von 5′-NMS durch Verlängerung jeweils der Reaktionsdauer erhalten werden.

Dabei läßt sich das 2′,3′-NDS dann synthetisieren, wenn die 5′-Hydroxylgruppe durch eine geeignete Schutzgruppe, wie Trityl, Monomethoxytrityl oder Acyl geschützt wird. Nach Beendigung der Reaktion kann die Entfernung der Schutzgruppe auf jede geeignete herkömmliche Art und Weise erfolgen.

Die Reindarstellung des NDS nach Abschluß der Reaktion erfolgt dadurch, daß man das erhaltene Reaktionsgemisch einer Adsorption auf ein Anionenaustauschharz unterwirft und erst eine NMS-Fraktion und dann eine NDS-Fraktion eluiert. Hieran schließen sich dann dieselben Behandlungen wie bei der Herstellung von NMS an.

(7) Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung läßt sich dadurch aus einer wäßrigen Lösung der vorstehend erwähnten drei unerläßlichen Komponenten herstellen, daß man der Lösung beispielsweise ein wäßriges organisches Lösungsmittel zusetzt, um die Zusammensetzung auszufällen (Verfahren A), und/oder das Lösungsmittel aus der Lösung verdampft (Verfahren B).

Als Ausgangsstoffe für die SAM-Komponente, welche ein erster Bestandteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist, kann SAM in freier Form oder in Form von Salzen, beispielsweise als Hydrochlorid, Sulfat, Phosphorwolframat, Iodid, Reineckes Salz, NS-Salz, organisches Sulfonat, wie p-Toluolsulfonat, und Doppelsalz aus einer organischen Sulfonsäure und Schwefelsäure, verwendet werden, und zwar in Form von Fällungsprodukten, Trockenprodukten oder wäßrigen Lösungen. Sind die Ausgangsstoffe andere SAM-Salze als das Sulfat, das NS-Salz oder dessen freie Form, so wird dieses SAM-Salz bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung dergestalt eingesetzt, daß man eine wäßrige Lösung des SAM-Salzes mit einem basischen Anionenaustauschharz, wie Dowex 2 × 8 (Handelsname, The Dow Chemical Company, USA), Amberite IRA-910, Amberite IRA-410 (Handelsnamen, Hersteller: Rohm & Haas Company, USA) sowie Diaion SA 20 A (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) in Berührung bringt, um so zur Gewinnung von SAM in Form der freien Base die Säuregruppen aus dem SAM-Salz zu entfernen oder aber dieses SAM-Salz in das Sulfat oder ein NS-Salz von SAM umzuwandeln.

Als Ausgangsmaterial für das NS, welches eine zweite Komponente der erfindungsgemäßen Zusammensetzung darstellt, kann das NS entweder in Form einer freien Säure oder aber in Form verschiedener Alkalisalze eingesetzt werden. Im Falle von 5′-AMS, 2′(3′)-AMS, 2′(3′),5′-ADS, 2′-3′-ADS, 5′-GMS, 2′(3′)- GMS, 2′(3′),5′GDS, 2′(3′)-CMS, 2′(3′)-CDS, 2′,3′-CDS und 3′,5′-TDS werden jedoch deren Alkalisalzformen verwendet, da die freie-Säure-Formen in einem wäßrigen sauren Lösungsmittel eine geringe Löslichkeit aufweisen. Ein in Form seiner freien Säure vorliegendes NS mit einer hohen Löslichkeit wird vorzugsweise so verwendet, wie es ist. Das NS kann beim Einsatz als Material für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung entweder in fester Form, beispielsweise in Form von Kristallen, oder aber als wäßrige Lösung verwendet werden.

Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu verwendende NS kann in einer oder mehreren Formen des vorstehend beschriebenen NMS und NDS eingesetzt werden.

Das Schwefelsäureäquivalent, die dritte wesentliche Komponente der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, ist ein Derivat der Schwefelsäure, das rein und pharmakologisch verträglich ist.

Nach einem der möglichen Verfahren zur Herstellung einer diese drei Komponenten enthaltenden wäßrigen Lösung, welche die Lösung des erfindungsgemäßen Präparats ist, löst man NS und Schwefelsäure in einer wäßrigen Lösung in der das SAM in freier Form vorliegt; nach einem anderen Verfahren löst man NS in einer wäßrigen Lösung von SAM-Sulfat, und nach wiederum einem anderen Verfahren setzt man zu einer wäßrigen Lösung eines NS-Salzes von SAM Schwefelsäure zu. Die Konzentration der jeweiligen Komponenten in der Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird je nach der angestrebten Zusammensetzung der herzustellenden erfindungsgemäßen Präparate bestimmt. Insbesondere wenn das erfindungsgemäße Präparat nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren (B) erhalten wird, richten sich die Konzentrationen der jeweiligen Komponenten in der Lösung des erfindungsgemäßen Präparats nach der Zusammensetzung des herzustellenden erfindungsgemäßen Präparats. Der Konzentrationsbereich in der wäßrigen Lösung

% (W/V) = (gelöster Stoff, g/Lösung ml) × 100

sollte für jede Komponente so gewählt werden, daß ein für das erfindungsgemäße Präparat geeignetes Zusammensetzungsverhältnis vorliegt; der Anteil an SAM sollte hierbei zwischen 3 und 20%, vorzugsweise zwischen 5 und 10%, der an NS zwischen 3 und 15%, vorzugsweise zwischen 5 und 12%, und der des Schwefelsäureäquivalents zwischen 1 und 20%, vorzugsweise zwischen 2 und 10%, betragen.

Die vorstehend beschriebenen Verfahren (A) und (B) werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung aus der Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet.

Nach Verfahren (A) wird die Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zwecks Ausfällung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit dem 3- bis 30-fachen Volumen eines organischen Lösungsmittels in Berührung gebracht. Das organische Lösungsmittel sollte mit einer wäßrigen Lösung, welche SAM, ein Schwefelsäureäquivalent und eine NS-Verbindung enthält, mischbar sein, und die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in diesem Lösungsmittel sollte gering sein. Erfindungsgemäß für diesen Ausfällvorgang einsetzbare organische Lösungsmittel sind: einwertige, zweiwertige und dreiwertige Alkohole mit je 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Diäthylenglycol und Triäthylenglycol; Ketone mit insgesamt bis zu 4 Kohlenstoffatomen, wie Aceton; Äther oder Ätheralkohole mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Dioxan Methoxyäthanol und Äthyläther, sowie Gemische von diesen Lösungsmitteln. Im Hinblick auf die Ausbeute bei der Ausfällung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist Methanol, Äthanol, Aceton, einem Gemisch aus Methanol und Aceton (beispielsweise im Verhältnis 1 : 1) und einem Gemisch aus Äthanol und Aceton (beispielsweise im Verhältnis 1 : 1) der besondere Vorzug zu geben.

Nach Verfahren (B) wird im Hinblick auf die Instabilität des SAM im gelösten Zustand sowie bei hohen Temperaturen das wäßrige Lösungsmittel aus der Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bei einer niedrigeren Temperatur (die nicht höher als 35°C, vorzugsweise jedoch nicht höher als 30°C ist) und innerhalb kürzerer Zeit verdampft. Hierzu wird beispielsweise ein Gefriertrockenverfahren, ein Trockenverfahren unter vermindertem Druck oder ein Trockenverfahren im Vakuum angewandt, wobei einem Gefriertrockenverfahren der Vorzug gegeben wird.

Nach Verfahren (B) wird zum Erhalt der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung durch Lösen von NS in einer wäßrigen Lösung von SAM-Sulfat hergestellt.

Die auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße Zusammensetzung ist ein weißes Pulver. Sie bzw. es enthält, solange sie als festes Produkt vorliegt, in dem die drei Komponenten aufgrund chemischer Interaktion nebeneinander bestehen, alle drei genannten Komponenten, d. h. das SAM, das Schwefelsäureäquivalent und eine NS-Verbindung. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann nicht dadurch hergestellt werden, daß man beispielsweise einfach ein in fester Form vorliegendes SAM-Sulfat und eine feste NS-Verbindung miteinander vermischt. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist es vielmehr erforderlich, eine wäßrige Lösung herzustellen, in der jede der drei Komponenten enthalten ist, um die chemische Wechselwirkung zwischen den jeweiligen Komponenten sicherzustellen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird dann als Fällungs- oder Trockenprodukt aus der wäßrigen Lösung erhalten. In einer ihrer Formen kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung ggfs. aus einem Doppelsalz von SAM, einem Schwefelsäureäquivalent und einer NS-Verbindung in einem bestimmten konstitutionellen Verhältnis bestehen.

Abgesehen von den drei vorstehend genannten Komponenten kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung geringfügige Mengen an Verunreinigungen, beispielsweise von den Alkalisalzen der NS-Verbindungen herrührende Alkalikationen und von der NS-Synthese stammende Nucleosidtrisulfate, enthalten. Im Hinblick auf ihre Stabilität wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Trockenprodukt hergestellt, welches vorzugsweise nicht mehr als 3%, besser jedoch nicht mehr als 1% Feuchtigkeit enthält.

Im allgemeinen setzt sich das erfindungsgemäße Präparat wie folgt zusammen:

SAM1 mol Schwefelsäureäquivalent1 bis 3 Mol NS0,5 Mol oder darüber.

Die verwendete NS-Menge variiert je nach Art der verwendeten NS-Verbindung. Nachstehend sind erfindungsgemäß verwendete NS-Mengen, die sich nach den vorstehend erwähnten Mengen an SAM und Schwefelsäureäquivalent richten, im einzelnen angegeben.

Bei Verwendung von 5′-CMS wird die Wirksamkeit hinsichtlich der Stabilisierung von SAM bereits bei einer Menge von 0,7 Mol oder darüber sichtbar; ein deutlicher Stabilisierungseffekt zeigt sich jedoch bei einem Mol oder darüber. Andererseits zeigt sich bei Verwendung von 2′(3′),5′-UDS ein Stabilisierungseffekt im SAM bereits bei 0,5 Mol oder darüber; ein besserer Effekt wird allerdings bei einem Mol oder darüber erzielt. Was die anderen NS-Verbindungen anbetrifft, so variieren hier die unteren Grenzwerte, bei denen eine Wirksamkeit sichtbar wird, je nach der verwendeten NS-Verbindung und es ist in diesen Fällen schwierig einen genauen Wert anzugeben; im allgemeinen kann das gewünschte Ergebnis jedoch gut bei einer Menge von 0,7 bis 0,8 Mol oder darüber, vorzugsweise bei 1 Mol oder darüber, erzielt werden.

Wie vorstehend bereits näher beschrieben, können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hochstabile SAM-haltige Zusammensetzungen durch Verwendung einer NMS- oder NDS-Verbindung mit einer niedrigen Toxizität erhalten werden.

Im folgenden seien nun typische erfindungsgemäße Zusammensetzungen bezüglich ihrer Lagerstabilität und Herstellung anhand von Beispielen aufgezeigt. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung keinesfalls einschränken.

In den in den nachstehenden Beispielen erwähnten Haltbarkeitstests wurde die prozentuale Restmenge an SAM in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sowie die in herkömmlichen SAM-Salzen dadurch bestimmt, daß man eine vorbestimmte Testprobe in einer Ampulle verschloß, diese während einer bestimmten Zeit auf einer Temperatur von 37°C bzw. 50°C hielt, die Probe dann in destilliertem Wasser löste, einen vorbestimmten Anteil der Probelösung einem Papier-Elektrophoresetest unter Verwendung von 3% Essigsäure unterwarf, sie dann einer Papierchromatographie jeweils im rechten Winkel zur Elektrophoreserichtung unter Verwendung eines Lösungsmittels als Entwickler unterwarf, das aus Äthanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 65 : 1 : 34 bestand, mittels eines UV-Detektors die SAM-Spots die Zersetzungsprodukte des SAM sowie das NS nachwies, die UV absorbierende Subtanz mit 0,1 N Salzsäure eluierte, die optische Dichte sowohl des SAM bei 260 nm (SAM : OD₂₆₀) als auch aller das Ultraviolett absorbierender Substanzen bei 260 nm (Gesamt-OD₂₆₀) maß, den prozentualen Anteil des SAM (% SAM) im Anschluß an den Haltbarkeitstest anhand der nachstehenden Gleichung (1) und dann die prozentuale Restmenge an SAM anhand der nachstehenden Gleichung (2) errechnete, in welche die SAM% erhaltenen Werte und der Wert der vor dem Haltbarkeitstest vorhandenen prozentualen SAM-Menge (bei der Herstellung vorliegendes SAM in %) eingehen.

*) Alternativ: nicht zersetztes SAM in %.

Die Analyse der Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Präparate erfolgte dadurch, daß man eine vorbestimmte Menge der Testprobe in destilliertem Wasser löste, die vorbestimmte Menge der Probelösung durch zweidimensionales Entwickeln wie vorstehend beschrieben auftrennte, die SAM- und NS-Spots mittels eines UV-Detektors nachwies, die UV absorbierenden Substanzen einer Eluierung mit einem Eluenten aus 0,1 N Salzsäure unterwarf, die optische Dichte des SAM bei 257 nm und die optische Dichte der jeweiligen NS-Verbindung bei der Wellenlänge ihrer maximalen Absorption (Λ max.) maß und den molaren Anteil jeder einzelnen Komponente aus dem jeweiligen molaren Extinktionskoeffizienten (ε) errechnete:

Zusammenhang zwischen der Konstitution der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und ihrer Lagerstabilität

Die SAM-Sulfate wurden jeweils in unterschiedlichen molaren Verhältnissen hergestellt. Den entstandenen wäßrigen Lösungen wurden 5′-CMS bzw. 2′(3′),5′-UDS in unterschiedlichen Mengen in bezug auf das jeweilige molare Verhältnis (bezogen auf die Molzahl des in der wäßrigen Lösung enthaltenen SAM) zugesetzt bzw. in diesem gelöst. Die entstandenen Lösungen wurden alsdann zum Erhalt der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, in denen die gewählte NS-Verbindung 5′-CMS bzw. 2′(3′),5′-UDS ist, gefriergetrocknet. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurden dann eine Woche lang einem Haltbarkeitstest bei 37°C unterworfen und anschließend die prozentuale Restmenge an SAM in jeder Probe der Zusammensetzung bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 enthalten. Die hier angegebene Molzahl für das SAM in der wäßrigen Lösung wurde dadurch bestimmt, daß man die Absorption bei 260 nm maß und für den molekularen Extinktionskoeffizienten (ε) den Wert 15 400 einsetzte.

Tabelle 1

Tabelle 2

Wie aus den Tabellen 1 und 2 hervorgeht, werden die Stabilisierungseffekte dann besonders sichtbar, wenn das Verhältnis von Schwefelsäureäquivalent/SAM zwischen 1,0 und 3,0, das von 5′-CMS/SAM 0,7 oder darüber, vorzugsweise 1,0 oder darüber, und das von 2′(3′),5′-UDS/SAM 0,5 oder darüber, vorzugsweise 1,0 oder darüber, beträgt, das heißt, wenn das molare Verhältnis von SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung 1 : (1 bis 3) : (0,7 oder darüber, vorzugsweise 1,0 oder darüber) und das von SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 2′(3′),5′-UDS = 1 : (1 bis 3) : (0,5 oder darüber, vorzugsweise 1,0 oder darüber) beträgt. Nach diesem Herstellungsverfahren kann keine Zusammensetzung erhalten werden, in der das Verhältnis von Schwefelsäureäquivalent/SAM über 3,0 beträgt.

Vergleich der Lagerstabilität der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit der eines Gemisches, das durch einfaches Mischen von festem SAM-Sulfat und festem 5′-CMS hergestellt wurde

Die für den vorstehend beschriebenen Test verwendete erfindungsgemäße Zusammensetzung (SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS = 1,0 : 1,5 : 2,0), sowie eine Vergleichsprobe, die durch Mischen eines in fester Form vorliegenden SAM-Sulfats (Schwefelsäureäquivalent/SAM = 1,5) mit einem in fester Form vorliegenden 5′-CMS im doppelten Molarverhältnis hergestellt worden war, wurden in ähnlicher Weise wie bereits beschrieben, eine bestimmte Anzahl von Tagen dem Haltbarkeitstest bei einer Temperatur von 37°C unterworfen. Anschließend wurden die Werte der prozentualen Restmengen an SAM (%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 3

Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung nicht dadurch hergestellt werden, daß man die jeweiligen Komponenten einfach in fester Form miteinander vermischt. Zum Erhalt der erfindungsgemäßen Zusammensetzung muß vielmehr eine wäßrige Lösung hergestellt werden, die die für eine chemische Wechselwirkung unerläßlichen Komponenten enthält, um die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Präzipitat oder Trockenprodukt aus der wäßrigen Lösung zu erhalten.

Vergleich zwischen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und anderen SAM-Salzen in bezug auf die Lagerstabilität

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen (SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS = 1,0 : 1,5 : 2,0 (5′-CM-Zusammensetzung) und SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 2′(3′),5′-UDS = 1,0 : 1,5 : 1,5 sowie das herkömmliche SAM-Hydrochlorid und SAM-Sulfat wurden dem Haltbarkeitstest wie vorstehend beschrieben über eine bestimmte Anzahl von Tagen bei einer Temperatur von 37°C unterworfen und anschließend die Werte der prozentualen Restmengen an SAM (%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.

Tabelle 4

Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, weisen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gegenüber den herkömmlichen SAM-Salzen eine wesentlich höhere Lagerstabilität auf.

Beispiel 1

Es wurde im Handel erhältliche Bierhefe (Hersteller: Oriental Kobo Kogyo K. K., Japan) in einem Nährmedium nach Schlenk ("The Journal of Biological Chemistry", Band 229, 1037 [1957]) zwecks Anreicherung von SAM gezüchtet. Das SAM wurde sodann mit 20 Litern 1,5 N Perchlorsäure aus 3,2 kg der mit SAM angereicherten Bierhefe extrahiert und die Zellreste durch Zentrifugieren entfernt. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wurde mit Kaliumcarbonat auf einen pH-Wert von 5,5 neutralisiert und das entstandene Kaliumperchlorat-Präzipitat entfernt. Dann wurden 25 Liter der auf diese Weise behandelten SAM-Lösung in eine mit Chelatharz, Diaion CR 10 (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) (H⁺-Form), beschickte Adsorptionssäule zur Adsorption an dieser eingespeist. Anschließend wurde zum Erhalt von 80 Litern der SAM-Fraktion mit 0,01 N Salzsäure eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 300 ml eingeengt und dieses Konzentrat dann zum Erhalt von 21,0 g SAM-Hydrochlorid als Fällungsprodukt einem aus Methanol und Aceton bestehenden Lösungsmittelgemisch (1 : 1) zugesetzt.

Das SAM-Hydrochlorid wurde in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und dann mittels eines stark basischen Anionenaustauschharzes, Dowex 2 × 8 (Handelsname, The Dow Chemical Company, USA) (als Kohlensäurederivat) auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert. In diesem Gemisch wurden alsdann 20 ml 12 N Schwefelsäure und 29,0 g 5′-CMS gelöst, welches gemäß dem nachstehenden Bezugsbeispiel 1 hergestellt worden war. Anschließend wurden dem Gemisch tropfenweise 2 Liter Äthanol zugesetzt und die Lösung über Nacht zum Abkühlen stehengelassen. Das entstandene Fällungsprodukt wurde zum Erhalt von 48,2 g eines Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (Ausbeute: 94,2%) abfiltriert und bei niedriger Temperatur getrocknet.

Das Präparat wurde in der bereits beschriebenen Weise zunächst einer Elementaranalyse und dann einer zweidimensionalen Entwicklungsanalyse mittels Elektrophorese und Papierchromatographie unterworfen. Die Zusammensetzung (Mol-Verhältnis) von SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS betrug 1,00 : 1,43 : 1,21.

Die durch die Elementaranalyse erhaltenen Werte, die durch die zweidimensionale Entwicklungsanalyse mittels Elektrophorese (1000 V, 45 Minuten) ermittelten, bei der Wanderung zurückgelegten Entfernungen und die mittels Papierchromatographie erhaltenen R_f-Werte, sowie die optischen Dichten des SAM und 5′-CMS sind wie nachstehend angegeben. Die Wanderungsentfernung (cm) ist nach den Ergebnissen aus der Elektrophorese positiv für die Wanderung in Richtung der Kathode und negativ für die Wanderung in Richtung der Anode. Dies gilt auch für alle weiteren nachstehend angegebenen Wanderungsentfernungen.

Elementaranalyse
C: 33,6%; H: 3,3%; N: 14,5%; S: 12,7%.

Zweidimensionales Entwickeln
(Es wurden 340 γ der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nachgewiesen bzw. lokalisiert)

Bei der Wanderung zurückgelegte EntfernungR_f-Wert SAM : 9,2 cm/45 Min., 1000 V0,35 5′-CMS : 0,1 cm/45 Min., 1000 V0,66

Optische Dichte

Es wurde eine vorbestimmte Menge des Präparats in einer Ampulle mit 3 ml Fassungsvermögen verschlossen und unter vermindertem Druck in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet. Der Haltbarkeitstest (37°C) wurde dann in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Das Präparat erwies sich als äußerst stabil, wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht.

Tabelle 5

Bezugsbeispiel 1 (Herstellung von 5′-CMS)

In 10 ml Formamid und 5 ml Dimethylformamid wurden unter Rühren 2,43 g Cytidin suspendiert und dem Gemisch nach und nach 3,64 g Triäthylamin-N-sulfonsäure zugesetzt. Die Reaktion wurde eine Stunde lang bei Zimmertemperatur durchgeführt und das Reaktionsgemisch dann zur Beendigung der Reaktion in Wasser eingegossen.

Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe von 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 neutralisiert, dann durch eine mit Amberite IRA-402 (Handelsname, Rohm & Haas, USA) (Cl^--Form) beschickte Säule von 200 ml Inhalt geleitet und anschließend mit Wasser gewaschen. Die aus der Säule abgezogenen Produktströme wurden miteinander vereint, mit Hilfe von 1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, an einer mit aktiver Holzkohle beschickten Säule adsorbiert, mit Wasser gewaschen und anschließend mit 0,02 N Natriumhydroxid eluiert. Zur Umwandlung des 5′-CMS-Salzes in seine freie Form wurde das Eluat dann mit Diaion PK 216 (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) (H⁺-Form) behandelt und konzentriert. Zur Ausfällung von Kristallen wurde dem Konzentrat sodann ein dreifaches Volumen an Aceton zugesetzt. Die entstandenen Kristalle wurden zum Erhalt von 2,3 g Cytidin-5′-monosulfat im Vakuum getrocknet.

Beispiel 2

In 40 ml destilliertem Wasser wurden 4,4 g SAM-Hydrochlorid gelöst, welches auf dieselbe Art und Weise erhalten worden war wie in Beispiel 1, und die anschließende Neutralisation (pH 7,0) erfolgte auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1. In der Lösung wurden 3 ml 12 N Schwefelsäure und 12,9 g 5′-CMS gelöst, welches nach dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten worden war. Der entstandenen Lösung wurden tropfenweise 200 ml Aceton zugesetzt und das Gemisch über Nacht zum Abkühlen stehengelassen. Das entstandene Präzipitat wurde alsdann zum Erhalt von 16,3 g der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (Ausbeute: 91,1%) abfiltriert und anschließend bei niedriger Temperatur getrocknet.

Dieses Präparat wurde dann derselben Analyse und demselben Haltbarkeitstest wie in Beispiel 1 unterworfen. Die Ergebnisse waren folgende:

Elementaranalyse:
C: 33,4%; H: 3,8%; N: 14,0%; S: 13,6%.

Optische Dichte
SAM : OD₂₅₇ = 2,246 : 0,165 µMol
5′-CMS : OD₂₈₀ = 4,882 : 0,384 µMol

(Zusammensetzung)
SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS = 1,00 : 1,05 : 2,33 (Haltbarkeit bei 37°C)

Tabelle 6

Beispiel 3

In 40 ml destilliertem Wasser wurden 6,5 g auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhaltenes SAM-Hydrochlorid gelöst und auch die anschließende Neutralisation (pH 7,0) wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der entstandenen Lösung wurden 6 ml 12 N Schwefelsäure zugesetzt und die Lösung danach tropfenweise zu 400 ml Aceton zugegeben, worauf sie über Nacht zum Abkühlen stehengelassen wurde. Das entstandene Präzipitat wurde zum Erhalt von 7,4 g SAM-Sulfat (Ausbeute 94,8%; Schwefelsäureäquivalent/SAM = 1,50, bezogen auf 21,3 mMol verbrauchte Schwefelsäure und 14,2 mMol SAM) abfiltriert.

Das SAM-Sulfat wurde in 150 ml destilliertem Wasser gelöst und dann 4,6 g des nach dem Verfahren gemäß Bezugsbeispiel 1 erhaltenen 5′-CMS zugesetzt. Die entstandene Lösung wurde sodann zum Erhalt von 12,0 g des Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung 10 Stunden lang bei 10 mmHg oder darunter und einer Temperatur von 25°C gefriergetrocknet.

Anschließend wurde das Präparat derselben Analyse und demselben Haltbarkeitstest wie in Beispiel 1 unterworfen. Die Ergebnisse waren folgende:

(Zusammensetzung)
SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS = 1,00 : 1,50 : 1,00
(Haltbarkeit bei 37°C)

Tabelle 7

Beispiel 4

In 100 ml destilliertem Wasser wurden 5,2 g SAM-Sulfat gelöst, welches auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 erhalten worden war. Ferner wurde die Lösung mit 9,7 g 5′-CMS versetzt, welches nach dem Verfahren gemäß Bezugsbeispiel 1 erhalten worden war. Die Lösung wurde dann zum Erhalt von 14,9 g des Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 gefriergetrocknet.

(Zusammensetzung)
SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-CMS = 1,00 : 1,50 : 3,00
(Haltbarkeit bei 37°C)

Tabelle 8

Beispiel 5

Zum Erhalt von 21,0 g SAM-Hydrochlorid als Fällungsprodukt wurde Beispiel 1 zum Teil wiederholt.

Das SAM-Hydrochlorid wurde in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und dann mit einem stark basischen Anionenaustauschharz, Dowex 2 × 8 (Handelsname, The Dow Chemical Company, USA) (Kohlensäureform) neutralisiert. Die entstandene Lösung wurde mit 20 ml 12 N Schwefelsäure und 58,5 g 2′,(3′),5′-UDS versetzt, welches nach dem Verfahren gemäß nachstehendem Bezugsbeispiel 2 hergestellt worden war, und die auf diese Weise hergestellte Lösung wurden dann tropfenweise zu 4 Liter Äthanol zugesetzt. Diese Lösung wurde über Nacht zum Abkühlen stehengelassen. Das entstandene Präzipitat wurde abfiltriert und zum Erhalt von 47,9 g eines Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (Ausbeute 90,2%) bei niedriger Temperatur getrocknet.

Anschließend wurde das Präparat, wie bereits vorstehend beschrieben, sowohl einer Elementaranalyse als auch einer zweidimensionalen Entwicklungsanalyse mittels Elektrophorese und Papierchromatographie unterworfen. Die Zusammensetzung war folgende: SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 2′(3′),5′-UDS = 1,00 : 1,43 : 1,31.

Die Ergebnisse der Elementaranalyse, die bei der Wanderung zurückgelegten Entfernungen und die R_f-Werte, welche anhand der zweidimensionalen Entwicklung mittels Elektrophorese (1000 V, 45 Minuten) und Papierchromatographie erhalten wurden, sowie die optischen Dichten des SAM sowie die des 2′(3′),5′-UDS sind nachstehend angegeben.

(Elementaranalyse)
C: 29,3%; H: 3,6%; N: 11,0%; S: 15,1% (Feuchtigkeitsgehalt 1,89%)

(Zweidimensionales Entwickeln)
(Es wurden 220 γ der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ermittelt)

Bei der Wanderung zurückgelegte Entfernung:
SAM : 9,2 cm/45 Min., 1000 V
2′(3′),5′-UDS : -13,4 cm/45 Min., 1000 V

R_f-Wert
SAM : 0,35
2′(3′),5′-UDS : 0,62

Optische Dichte
SAM : OD₂₅₇ = 3,080, ε = 14 700 (in 0,1 N HCl) : 0,210 µMol
2′(3′),5′-UDS : OD₂₆₀ = 2,732; ε = 9900 (in 0,1 N HCl) : 0,276 µMol

Ein bestimmter Anteil des Präparats wurde in einer 3 ml-Ampulle verschlossen und unter vermindertem Druck in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet. Ein sich daran anschließender Haltbarkeitstest (37°C) wurde auf dieselbe Weise durchgeführt, wie bereits vorstehend beschrieben. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, hat sich die Probe als äußerst stabil erwiesen.

Tabelle 9

Bezugsbeispiel 2 (Herstellung von 2′(3′),5′-UDS)

In 10 ml Formamid und 5 ml Dimethylformamid wurden unter Rühren 2,44 g Uridin suspendiert und dem Gemisch nach und nach 4,55 g Triäthylamin-N-sulfonsäure zugesetzt. Die Reaktion wurde drei Stunden lang bei Zimmertemperatur durchgeführt und das Reaktionsgemisch dann zur Beendigung der Reaktion in Wasser gegeben.

Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und in eine Amberite IRA-402-Säule (Handelsname, Rohm & Haas, USA) (Cl^--Form) von 200 ml Fassungsvermögen zur Adsorption an dieser eingespeist und dann mit Wasser gewaschen. Das Uridinmonosulfat wurde mit 0,06 N Salzsäure aus der Säule eluiert. Die 2′(3′),5′-UDS-Fraktion wurde dann durch Eluieren mit 0,4 M Natriumchlorid - 0,005 N Salzsäure aufgefangen. Die aufgefangene Fraktion wurde mit 1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, an einer mit Holzkohle beschickten Säule adsorbiert, mit Wasser gewaschen und dann mit 0,02 N Natriumhydroxid eluiert. Das Eluat wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, aufkonzentriert und diesem Konzentrat zur Ausfällung eines weißen Pulvers das dreifache Volumen an Äthanol zugesetzt, welches dann zum Erhalt von 1,45 g Uridin-2′(3′),5′-disulfat (2′(3′),5′-UDS) im Vakuum getrocknet wurde.

Beispiel 6

In 80 ml destilliertem Wasser wurden 8,8 g SAM-Hydrochlorid gelöst, welches auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 gewonnen worden war, und die anschließende Neutralisation (pH 7,0) erfolgte auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5. Der Lösung wurden dann 6 ml 12 N Schwefelsäure zugesetzt. Anschließend wurde das Gemisch tropfenweise zu 1000 ml Äthanol zugesetzt und dieses Gemisch dann über Nacht zum Abkühlen stehengelassen. Zum Erhalt von 9,6 g SAM-Sulfat wurde das entstandene Fällungsprodukt abfiltriert.

Dieses SAM-Sulfat wurde zunächst in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und der Lösung wurden dann 7,1 g 2′(3′),5′- UDS zugesetzt, welches nach dem Verfahren gemäß Bezugsbeispiel 2 erhalten worden war. Anschließend wurde das entstandene Gemisch zum Erhalt von 16,9 g eines Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung 10 Stunden lang bei einem Druck von 80 µm Hg und einer Temperatur von 25°C gefriergetrocknet.

Das Präparat wurde dann derselben Analyse und demselben Haltbarkeitstest wie in Beispiel 5 unterworfen. Die Ergebnisse waren folgende:

(Zusammensetzung)
SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 2′(3′),5′-UDS = 1,00 : 1,42 : 0,95 (Feuchtigkeitsgehalt 1,18%)
(Haltbarkeit bei 37°C)

Tabelle 10

Beispiel 7

In 100 ml destilliertem Wasser wurden 5,5 g SAM-Sulfat auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6 gelöst. Weiter wurden der Lösung 10,1 g 2′(3′),5′-UDS zugesetzt, welches nach dem Verfahren gemäß Bezugsbeispiel 2 erhalten worden war. Die anschließende Gefriertrocknung zum Erhalt von 15,9 g eines Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erfolgte auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6.

Das Präparat wurde dann der gleichen Analyse und dem gleichen Haltbarkeitstest wie in Beispiel 5 unterworfen. Die Ergebnisse waren folgende:

(Zusammensetzung)
SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 2′(3′),5′-UDS = 1,00 : 1,42 : 2,39 (Feuchtigkeitsgehalt 1,89%)
(Haltbarkeit bei 37°C)

Tabelle 11

Beispiel 8

Im Handel erhältliche Bierhefe (Hersteller: Oriental Kobo Kogyo K. K., Japan) wurde in einem Nährmedium nach Schlenk (Journal of Biological Chemistry, Band 229, 1037 [1957]) zwecks Anreicherung an SAM gezüchtet. Das SAM wurde dann mit 25 Litern 1,5 N Perchlorsäure aus 4,0 kg der mit dem SAM angereicherten Bierhefe extrahiert und die Zellenrückstände durch Zentrifugieren abgetrennt.

Dem auf diese Weise behandelten Extrakt wurde dann zur Einstellung des pH-Werts auf 5,5 Kaliumbicarbonat zugesetzt und der entstandene Kaliumperchloratniederschlag wurde abgetrennt. Anschließend wurden 30 l der auf diese Weise behandelten SAM- Lösung in eine mit einem schwachsauren Kationenaustauschharz, Diaion WK 10 (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) (H⁺-Form), beschickte Säule eingespeist und das SAM am Harz adsorbiert. Zum Erhalt von 10 Litern der SAM-Fraktion wurde anschließend mit 0,1 N Salzsäure eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 400 ml eingeengt und die Salzsäurekonzentration mittels eines stark basischen Anionenaustauschharzes, Dowex 2 × 8 (Handelsname, The Dow Chemical Company, USA) (Kohlensäureform) auf 0,1 N eingestellt. Das auf diese Weise behandelte Eluat wurde alsdann zum Erhalt von 24,5 g SAM-Hydrochlorid als Fällungsprodukt zu 8 Litern eines aus Methanol und Aceton im Verhältnis 1 : 1 bestehenden Lösungsmittelgemisches zugesetzt.

Das SAM-Hydrochlorid wurde in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und mit dem Dowex 2 × 8 (Carbonsäureform) auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert. Anschließend wurden 23,5 ml 12 N Schwefelsäure zugesetzt. Dieses Gemisch wurde sodann zu 6 Litern Äthanol zugesetzt und über Nacht zum Abkühlen stehengelassen. Das entstandene Präzipitat wurde zum Erhalt von 30,1 g SAM-Sulfat (Feuchtigkeitsgehalt 5,4%) abfiltiert und bei niedriger Temperatur getrocknet.

Dann wurden in jeweils 100 ml destilliertem Wasser je 5,0 g SAM-Sulfat und darin anschließend 5′-IMS (freie Säureform), 5′-AMS-Natriumsalz, 5′-GMS-Natriumsalz bzw. 5′-UMS (freie Säureform) (im folgenden als 5′-IMS bzw. 5′-AMS.Na bzw. 5′-GMS.Na bzw. 5′-UMS bezeichnet) gelöst, welche nach dem Verfahren gemäß Bezugsbeipiel 3 erhalten worden waren.

Die entstandenen Lösungen wurden dann zum Erhalt von Präparaten der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen aus SAM, einem Schwefelsäureäquivalent sowie 5′-IMS, 5′-AMS, 5′-GMS bzw. 5′-UMS, welche im folgenden als 5′-IM- bzw. 5′-AM- bzw. 5′-GM- bzw. 5′-UM-Zusammensetzung bezeichnet werden, 10 Stunden lang bei einem Druck von 100 µm Hg oder darunter und einer Temperatur von 25°C gefriergetrocknet.

Die nachstehende Tabelle 12 enthält die Arten und Mengen der dem erfindungsgemäßen Präparat zugesetzten 5′-NMS-Verbindungen sowie deren Ausbeuten, den jeweiligen Wassergehalt und die Ausbeuten an den Präparaten gemäß der Erfindung.

Tabelle 12

Die Analyseergebnisse der einzelnen Präparate der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gehen aus den nachstehenden Tabellen hervor. Tabelle 13 enthält die Ergebnisse, die beim Auftragen von 300 γ des jeweiligen Präparats auf einem Filterpapier und zweidimensionales Entwickeln nach dem vorstehend erwähnten Verfahren erhalten wurden, sowie die hieraus errechneten molaren Anteile der jeweiligen Komponenten unter Angabe der elektronischen und chromatographischen Eigenschaften der Präparate als auch des Gehalts, in dem die jeweiligen Komponenten vorlagen. Tabelle 14 enthält die Werte der für jede Probe durchgeführten Elementaranalyse. Tabelle 15 zeigt das molare Verhältnis der jeweiligen Komponenten, welches aus den Ergebniswerten errechnet wurde.

Tabelle 13

Tabelle 14

Tabelle 15

Zur Untersuchung der Lagerstabilität der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurden jeweils 10 mg des jeweiligen Präparats sowie 10 mg SAM-Sulfat als Vergleichssubstanz in Ampullen von jeweils 10 ml Fassungsvermögen eingefüllt und unter vermindertem Druck in Gegenwart von Phosphorpentoxid 5 Stunden lang getrocknet. Die Ampullen wurden fest verschlossen und dann 7, 14 und 30 Tage stehengelassen. Dann wurde der SAM-Gehalt in den Proben gemessen und die prozentuale Restmenge an SAM errechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 enthalten. Zum Vergleich wurde dann das SAM-Sulfat unter vermindertem Druck in Gegenwart von Phosphorpentoxid gefriergetrocknet.

Tabelle 16

Beispiel 9

SAM-Hydrochlorid, welches auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 erhalten worden war, wurde zum Erhalt von 100 ml einer 10%igen SAM-Lösung in destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit Hilfe eines stark basischen Anionenaustauschharzes, Dowex 2 × 8, (Kohlensäureform) auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und der Lösung dann 12,5 ml 12 N Schwefelsäure sowie 53,734 g 5′-IMS in freier Säureform (Feuchtigkeitsgehalt 2,8%) zugesetzt.

Die entstandene Lösung wurde tropfenweise zu 2,0 Litern Äthanol zugesetzt und diese Lösung über Nacht zum Abkühlen stehengelassen. Das entstandene Präzipitat wurde zum Erhalt von 24,8 g eines Präparats der 5′-IM-Zusammensetzung (Feuchtigkeitsgehalt 2,8%, Ausbeute 92,2%) abfiltriert und bei niedriger Temperatur getrocknet.

Diese Präparat wurde zur Bestimmung des molaren Verhältnisses von SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-IMS = 1,00 : 1,48 : 1,36 auf die gleiche Weise analysiert wie in Beispiel 8.

Elementaranalyse
C: 32,4%; H: 4,1%; N: 14,9%; S: 11,9%.

Vorhandene Mengen der einzelnen Komponenten (molare Anteile)

Die optischen Dichten wurden, wie nachstehend gezeigt, durch Auftrennen von 300 γ des Präparats der vorliegenden Erfindung mittels zweidimensionalen Entwickelns bestimmt.

SAM : OD₂₅₇_nm = 4,249; 0,292 µMol
5′-IMS : OD₂₅₀ _nm = 4,833; 0,396 µMol

Das Präparat wurde dann demselben Haltbarkeitstest (37°C) unterworfen, wie in Beispiel 8 beschrieben, und es erwies sich hierbei als äußerst stabil, wie auch aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht.

Tabelle 17

Beispiel 10

SAM-Hydrochlorid, welches auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 hergestellt worden war, wurde zum Erhalt von 20 ml 10%iger SAM-Lösung in destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und dieser dann 2,5 ml 12 N Schwefelsäure und 6,30 g 5′-GMS-Natriumsalz (Feuchtigkeitsgehalt 8,3%) zugesetzt. Nach tropfenweisem Zusatz des Gemisches zu 400 ml Äthanol ließ man dieses über Nacht zum Abkühlen stehen. Das entstandene Präzipitat wurde sodann zum Erhalt von 5,79 g eines Präparats der 5′-GM-Zusammensetzung (Feuchtigkeitsgehalt 2,2%, Ausbeute 91,1%) abfiltriert und bei niedriger Temperatur getrocknet.

Zur Bestimmung des molaren Verhältnisses von SAM zu Schwefelsäureäquivalent zu 5′-GMS = 1,00 : 1,45 : 1,93 wurde dieses Präparat anschließend auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 analysiert. Man verglich die Lagerstabilität des erfindungsgemäßen Präparats mit der von herkömmlichem SAM-Sulfat bei einer Temperatur von 50°C. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle entstanden. Die in Tabelle 18 angegebenen Werte sind die prozentualen Restmengen an SAM (%).

Tabelle 18

Beispiel 11

In jeweils 100 ml destilliertem Wasser wurden jeweils 5,0 g SAM-Sulfat gelöst, welches auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 hergestellt worden war. In den entstandenen Lösungen wurden dann 3′-TMS (freie Säureform), 2′(3′)-AMS-Natriumsalz, 2′(3′)-CMS-Natriumsalz und 2′(3′)-UMS (freie Säureform) (im folgenden als 3′-TMS bzw. 2′(3′)-AMS.Na bzw. 2′(3′)-CMS.Na bzw. 2′(3′)-UMS bezeichnet) gelöst, welche nach dem Verfahren gemäß dem nachstehenden Bezugsbeispiel 4 erhalten worden waren. Die entstandenen Lösungen wurden dann zum Erhalt der Präparate der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, welche SAM, ein Schwefelsäureäquivalent und 3′-TMS bzw. 2′(3′)-AMS bzw. 2′(3′)-CMS bzw. 2′(3′)-UMS (im folgenden als 3′-TM- Zusammensetzung bzw. 2′(3′)-AM-Zusammensetzung bzw. 2′(3′)- CM-Zusammensetzung bzw. 2′(3′)-UM-Zusammensetzung bezeichnet) enthalten, 10 Stunden lang bei einem Druck von 100 µm Hg oder darunter und einer Temperatur von 25°C gefriergetrocknet.

Die nachstehende Tabelle 19 enthält die Arten und Mengen der für die Herstellung der Präparate verwendeten 3′- oder 2′(3′)- NMS-Verbindungen sowie die Ausbeuten, den jeweiligen Wassergehalt und die Ausbeuten an den Präparaten der entstandenen Zusammensetzungen.

Tabelle 19

Die Analysenergebnisse der Präparate der vorstehenden Zusammensetzungen sind in den nachstehenden Tabellen enthalten. Tabelle 20 zeigt die Ergebnisse, die durch Auftragen von 300 γ des jeweiligen Präparats auf einem Filterpapier und zweidimensionales Entwickeln nach dem bereits beschriebenen Verfahren erhalten wurden, sowie die hieraus errechneten molaren Anteile der jeweiligen Komponenten unter Angabe der elektrophoretischen und chromatographischen Eigenschaften der Präparate als auch der jeweiligen Gehalte an den verschiedenen Komponenten. Tabelle 21 enthält die Ergebnisse der Elementaranalyse der jeweiligen Probe. Tabelle 22 zeigt das molare Verhältnis der einzelnen Komponenten, das aus den vorstehend genannten Ergebnissen errechnet wurde, sowie den jeweiligen durch die Sauerstoff-Verbrennungsmethode ermittelten Schwefelgehalt.

Tabelle 20

Tabelle 21

Tabelle 22

Die Lagerstabilität der in den gleichen Tabellen aufgeführten Zusammensetzungen wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 wiedergegeben.

Tabelle 23

Beispiel 12

In je 100 ml destilliertem Wasser wurden je 5,0 g SAM-Sulfat (Feuchtigkeitsgehalt 5,8%) gelöst, welches auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 erhalten worden war. In den entstandenen Lösungen wurden 2′(3′)-CDS-Dinatriumsalz, 2′(3′),5′- ADS-Dinatriumsalz, 2′(3′),5′-IDS (freie Säureform), 2′(3′)-5′- GDS-Dinatriumsalz, 2′,3′-ADS-Dinatriumsalz, 2′,3′-CDS-Dinatriumsalz, 2′,3′-UDS (freie Säureform) und 3′,5′-TDS-Dinatriumsalz (im folgenden als 2′(3′),5′-CDS.2 Na bzw. 2′(3′),5′-ADS.2 Na bzw. 2′(3′),5′-IDS bzw. 2′(3′),5′GDS.2 Na bzw. 2′,3′-ADS.2 Na bzw. 2′,3′-CDS.2 Na bzw. 2′,3′-UDS bzw. 3′,5′-TDS.2 Na bezeichnet) gelöst, welche anhand des Verfahrens gemäß Bezugsbeispiel 5 hergestellt worden waren. Die entstandenen Lösungen wurden zum Erhalt von Präparaten der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen aus SAM, einem Schwefelsäureäquivalent sowie 2′(3′),5′- CDS, 2′(3′),5′-ADS, 2′(3′),5′-IDS, 2′(3′),5′-GDS, 2′,3′-ADS, 2′,3′-CDS, 2′,3′-UDS bzw. 3′,5′-TDS (im folgenden als 2′(3′),5′-CD- bzw. 2′(3′),5′-AD- bzw. 2′(3′),5′-ID- bzw. 2′(3′),5′-GD- bzw. 2′,3′-AD- bzw. 2′,3′-CD- bzw. 2′,3′-UD- bzw. 3′,5′-TD-Zusammensetzung bezeichnet) 10 Stunden lang bei einem Druck von 100 µm Hg oder darunter und einer Temperatur von 25°C gefriergetrocknet.

Die nachstehende Tabelle 24 enthält die Arten und Mengen der in den erfindungsgemäßen Präparaten verwendeten NDS-Verbindungen, deren Ausbeuten, den jeweiligen Wassergehalt, sowie die Ausbeuten an den Präparaten der entstandenen Zusammensetzungen.

Tabelle 24

Die Analyseergebnisse der einzelnen Präparate der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gehen aus den nachstehenden Tabellen hervor. Die Tabellen 25 (a) und 25 (b) enthalten die Ergebnisse, die beim Auftragen von 300 γ des jeweiligen Präparats auf einem Filterpapier und dem anschließenden zweidimensionalen Entwickeln nach der vorstehend genannten Methode erhalten wurden, unter Angabe der hierbei erhaltenen elektrophoretischen und chromatographischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Präparate sowie des jeweiligen Gehalts an den einzelnen Komponenten, die hieraus errechneten molaren Anteile der einzelnen Komponenten, die Werte aus der Elementaranalyse und das molare Verhältnis der einzelnen Komponenten.

Tabelle 25 (a)

Tabelle 25 (b)

Zur Untersuchung der Lagerstabilität der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurden jeweils 10 ml eines Präparats der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und 10 mg SAM-Sulfat als Vergleichssubstanz in Ampullen von jeweils 10 ml Fassungsvermögen eingefüllt und 5 Stunden lang unter vermindertem Druck sowie in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet. Die Ampullen wurden fest verschlossen und 7, 14 und 30 Tage stehengelassen. Im Anschluß daran wurde der SAM-Gehalt in den Proben gemessen und hieraus die Restmenge an SAM in % berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 wiedergegeben. Das als Vergleichssubstanz dienende SAM-Sulfat wurde gefriergetrocknet sowie unter verminderten Druck in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet.

Tabelle 26

Bezugsbeispiel 3 (Herstellung von 5′-NMS)

In einem Gemisch aus 200 ml Formaldehyd und 100 ml Dimethylformaldehyd wurden 200 mMol eines Nucleosids (Inosin, Adenosin, Guanosin und Uridin), welches dem herzustellenden 5′-NMS entspricht, unter Rühren suspendiert, und dem Gemisch nach und nach 400 mMol Triäthylamin-N-sulfonsäure zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur für die Herstellung von 5′- AMS 3 Stunden lang, für die Herstellung von 5′-GMS 5 Stunden lang und für die Herstellung der anderen 5′-NMS-Verbindungen eine halbe Stunde lang durchgeführt. Zur Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegeben.

Im Anschluß daran wurde das Reaktionsgemisch mit 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, dann in eine mit Amberite IRA-402 (Handelsname, Hersteller: Rohm & Haas Company, USA) (Cl^--Form) beschickte Säule mit 4 Litern Fassungsvermögen zur Adsorption an dieser eingespeist, mit Wasser gewaschen und mit 0,04 N Salzsäure eluiert. Die entstandene 5′-NMS- Fraktion wurde aufgefangen, mittels 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 5,7 eingestellt und aufkonzentriert. Zur Ausfällung von Kristallen wurde eine dreifache Menge von Aceton zugesetzt, und diese Kristalle wurden dann zum Erhalt der entsprechenden 5′-NMS-Verbindungen im Vakuum getrocknet. Die Ausbeuten in den vorstehend beschriebenen Verfahren betrugen beim Einsatz von 5′-IMS-Natriumsalz 57,7%, beim Einsatz von 5′-AMS- Natriumsalz 67,1%, beim Einsatz von 5′-GMS-Natriumsalz 73,9% und beim Einsatz von 5′-UMS-Natriumsalz 63,7%.

Die entstandenen 5′-AMS- und 5′-GMS-Natriumsalze wurden für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ohne weitere Behandlung verwendet. Beim Einsatz von 5′-IMS-Natriumsalz und 5′-UMS-Natriumsalz wurden jedoch wäßrige Lösungen von diesen hergestellt und zur Umwandlung des Natriumsalzes in die freie Säureform, welche dann zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet wurde, in eine Diaion-PK-216-Säule (Handelsname, Hersteller: Mitsubishi Kasei Kogyo K. K., Japan) eingespeist.

Bezugsbeispiel 4 (Herstellung von 3′- bzw. 2′(3′)-NMS)

In 40 ml Pyridin wurden unter Rühren 20mMol eines 5′-O- Tritylnucleosids (Tritylthymidin, Tritylcytidin und Trityluridin), welches dem herzustellenden 3′- bzw. 2′(3′)-NMS entspricht, suspendiert. Dann wurden dem Gemisch nach und nach 60 mMol Triäthylamim-N-sulfonsäure zugesetzt und dieses über Nacht zur Reaktion stehengelassen. Zur Beendigung der Reaktion wurde das Gemisch in Wasser gegeben.

Das entstandene 5′-O-Trityl-NMS wurde aus dem Reaktionsgemisch mit n-Butanol extrahiert. Die Schicht des organischen Lösungsmittels wurde mit Wasser gewaschen und bis zur Trockenheit verdampft. Der entstandene Rückstand wurde in 200 ml einer Lösung aus Chloroform und Ameisensäure im Verhältnis 1 : 1 gelöst und die Lösung dann zur Entfernung der Tritylgruppe aus dem NMS 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen.

Für die Herstellung von 2′(3′)-CMS bzw. 2′(3′)-UMS wurde die Lösung nach der Enttritylierung bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und mittels 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Dann wurde das entstandene unlösliche Triphenylcarbinol abgetrennt. Die entstandene Lösung wurde auf gleiche Weise mit Amberite IRA-402 behandelt wie in Bezugsbeispiel 3. Zum Erhalt des entsprechenden 2′(3′)-NMS-Natriumsalzes wurden mittels Zusatz von Äthanol Kristalle ausgefällt und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeuten in den vorstehend beschriebenen Verfahren waren 41,7% 2′(3′)-AMS-Natriumsalz, 44,5% 2′(3′)- CMS-Natriumsalz und 58,6% 2′(3′)-UMS-Natriumsalz.

Für die Herstellung von 3′-TMS wurde die Lösung nach der Enttritylierung an 200 ml aktivierter Holzkohle adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit einem Gemisch aus Äthanol, Ammoniak und Wasser im Verhältnis 50 : 2 : 48 eluiert. Die entstandene TMS-Fraktion wurde gesammelt, bis zur Trockenheit eingedampft und der Rückstand dann in 300 ml Wasser gelöst. Anschließend wurde die Lösung in eine Diaion-PK-216- Säule (H⁺-Form) eingespeist, mit Natriumhydroxid neutralisiert und mittels Äthanol auskristallisiert (Ausbeute 73,2%).

Die entstandenen 2′(3′)-AMS- bzw. 2′(3′)-CMS-Natriumsalze wurden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ohne weitere Behandlung verwendet. Beim Einsatz von 3′- TMS-Natriumsalz bzw. 2′(3′)-UMS-Natriumsalz wurden jedoch wäßrige Lösungen von diesen hergestellt und zur Umwandlung des Natriumsalzes in die freie Säureform, die dann zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet wurde, in eine Diaion-PK-216-Säule eingespeist.

Bezugsbeispiel 5 (Herstellung von 2′(3′),5′- bzw. 3′,5′-NDS)

In einem Gemisch aus 20 ml Formamid und 10 ml Dimethylformamid wurden unter Rühren 20 mMol eines Nucleosids (Cytidin, Adenosin, Inosin, Guanosin und Thymidin), welches den 2′(3′),5′- bzw. 3′,5′-NDS entspricht, suspendiert. Diesem Gemisch wurden dann nach und nach 40 mMol Triäthylamin-N-sulfonsäure zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur zur Herstellung von 2′(3′),5′-ADS 6 Stunden lang, zur Herstellung von 2′(3′),5′-GDS 24 Stunden lang und zur Herstellung der anderen NDS-Verbindungen jeweils 3 Stunden lang durchgeführt. Zur Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch dann in Wasser gegeben.

Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mittels 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, zur Adsorption in eine Amberite-IRA-402-Säule (Handelsname, Hersteller: Rohm & Haas Company, USA) (Cl^--Form) von 400 ml Fassungsvermögen eingespeist und dann mit Wasser gewaschen. Die entstandene Nucleosid-5′-monosulfatfraktion wurde mittels 0,04-N- Salzsäure eluiert und entfernt. Die NDS-Fraktion wurde dann mit einem Lösungsbereich aus 0,2 M Natriumchlorid - 0,05 N Salzsäure eluiert und gesammelt.

Das gesammelte Eluat wurde auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt, an einer mit Holzkohle aktivierten Säule von 600 ml Fassungsvermögen adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit 0,1 N Ammoniakwasser eluiert und entsalzt. Die entstandene Lösung wurde aufkonzentriert, mittels 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und zum Erhalt einer NDS- Konzentration von 30 bis 50% nochmals eingeengt. Die entstandene Lösung wurde auf einen pH-Wert zwischen 8 und 10,0 eingestellt und dieser dann zur Ausfällung von Kristallen, die anschließend zur Herstellung des entsprechenden NDS-Dinatriumsalzes im Vakuum getrocknet wurden, ein 3- bis 5faches Volumen Äthanol zugesetzt. Die Ausbeuten in den vorstehend beschriebenen Verfahren betrugen jeweils 49% 2′(3′),5′- IDS-Dinatriumsalz, 52% 2′(3′),5′-ADS-Dinatriumsalz, 58% 2′(3′),5′-CDS-Dinatriumsalz, 45% 2′(3′),5′-GDS-Dinatriumsalz und 62% 3′,5′-TDS-Dinatriumsalz.

Bezugsbeispiel 6 (Herstellung von 2′,3′-NDS)

In 40 ml Pyridin wurden unter Rühren 20 mMol eines 5′-O-Tritylnucleosids (Trityladenosin, Tritylcytidin und Trityluridin), welches dem herzustellenden 2′-3′-NDS entspricht, suspendiert. Diesem Gemisch wurden dann nach und nach Triäthylamin- N-sulfonsäure (60 mMol bei Verwendung von Trityladenosin oder Tritylcytidin und 120 mMol bei Verwendung von Trityluridin zugesetzt und dieses Gemisch dann zur Reaktion über Nacht stehengelassen. Zur Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegeben.

Das entstandene 5′-O-Trityl-NDS wurde anschließend aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe von n-Butanol extrahiert. Die Schicht des organischen Lösungsmittels wurde mit etwas Wasser gewaschen und bis zur Trockne eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde in 200 ml einer Lösung aus Chloroform und Ameisensäure im Verhältnis 1 : 1 gelöst und die Lösung zur Enttritylierung (Entfernung der Tritylgruppe aus der NDS- Verbindung) 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die enstandene Lösung wurde dann bis zur Trockenheit eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und mittels 1 N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt; anschließend wurde aus dieser Lösung das entstandene unlösliche Triphenylcarbinol abfiltriert. Die entstandene Lösung wurde dann mit Amberite IRA-402 auf die gleiche Weise wie im Bezugsbeispiel 5 behandelt. Die NDS-Fraktion wurde eingeengt und dann zum Erhalt von 2′,3′-NDS mit Äthanol auskristallisiert. Die Ausbeuten in den vorstehend genannten Verfahren betrugen jeweils 50,3% 2′,3′-ADS.2 Na, 35,1% 2′,3′-CDS.2 NA und 84,1% 2′,3′-UDS.2 Na.

Das entstandene 2′,3′-ADS.2 Na und 2′,3′-CDS.2 Na wurde für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ohne weitere Behandlung verwendet. Beim Einsatz von 2′,3′-UDS.2 Na wurde jedoch eine wäßrige Lösung von diesem hergestellt und zur Umwandlung des Dinatriumsalzes in die freie Säureform, die dann für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet wurde, in eine Diaion-PK-216-Säule eingespeist.

Claims

1. S-Adenosyl-L-Methionin (=SAM) enthaltendes Präparat, welches durch ein Schwefelsäureäquivalent gegen eine Zersetzung der SAM-Komponente stabilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß dieses außer der Wirkstoff-Komponente S-Adenosyl- Methionin noch ein Nucleosidmonosulfat oder Nucleosiddisulfat oder ein Gemisch von diesen enthält.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nucleosidmonosulfat Inosin-5′-monosulfat, Adenosin-5′-monosulfat, Guanosin-5′-monosulfat, Uridin-5′-monosulfat, Cytidin- 5′-monosulfat, Xanthosin-5′-monosulfat, Thymidin-5′-monosulfat, Deoxyguanosin-5′-monosulfat, Deoxyinosin-5′-monosulfat, Inosin-2′(3′)-monosulfat, Adenosin-2′(3′)-monosulfat, Guanosin -2′(3′)-monosulfat, Cytidin-2′(3′)-monosulfat, Uridin-2′(3′)-monosulfat, Thymidin-3′-monosulfat, Deoxyinosin-3′-monosulfat, Deoxyadenosin-3′-monosulfat, Deoxyguanosin-3′-monosulfat, Deoxycytidin -3′-monosulfat sowie ein Gemisch von diesen ist, und das Nucleosiddisulfat Inosin-2′(3′),5′-disulfat, Adenosin-2′(3′),5′-disulfat, Guanosin-2′(3′),5′-disulfat, Xanthosin-2′(3′),5′-disulfat, Uridin-2′(3′),5′-disulfat, Cytidin-2′(3′),5′-disulfat, Thymidin-3′,5′-disulfat, Deoxyinosin-3′,5′-disulfat, Deoxyadenosin- 3′,5′-disulfat, Deoxyguanosin-3′,5′-disulfat, Deoxyxanthosin-3′,5′-disulfat, Deoxycytidin-3′,5′-disulfat, Adenosin-2′,3′-disulfat, Inosin-2′,3′-disulfat, Guanosin-2′,3′-disulfat, Xanthosin-2′,3′-disulfat, Cytidin-2′,3′-disulfat, Uridin-2′,3′-disulfat sowie ein Gemisch von diesen ist.