DE2945129C2

DE2945129C2 -

Info

Publication number: DE2945129C2
Application number: DE2945129A
Authority: DE
Inventors: Kazutomo Tokio/Tokyo Jp Imahori; Kosuke Matsudo Chiba Jp Tomita
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1978-11-08
Filing date: 1979-11-08
Publication date: 1988-07-14
Also published as: FR2440956B1; DK469879A; DK151264B; IT7950751A0; GB2036029A; JPS5564599A; GB2036029B; JPS6350359B2; SE445224B; IT1164135B; FR2440956A1; SE7909236L; DE2945129A1; US4282352A; DK151264C

Description

Die Erfindung betrifft die neue Verbindung N⁶-(Carboxy ethyl)-adenosintriphosphat und dessen Salze. Diese neue Verbindung ist als Ligand bei der Affinitätschromatografie oder als ein Enzym-Hilfssubstrat (Kofaktor) bei der tech nischen Anwendung von Enzymen geeignet.

Affinitätschromatografie ist in den vergangenen Jahren als wirksames Mittel zum Isolieren biologischer Stoffe untersucht worden. Adenosintriphosphat (ATP) ist bei Enzymreaktionen ein sehr wichtiger Kofaktor. Wenn man infolgedessen ein Material herstellt, in dem man ATP an eine geeignete Matrix bindet, und als Affinitäts adsorbenz verwendet, so wird es möglich, Enzyme durch Affinitätschromatografie zu isolieren und zu reinigen. Bei vielen chemischen Reaktionen, bei denen ein Enzym system in Kombination mit einem Kofaktor, wie ATP, im technischen Maßstab verwendet wird, ist es von großer Be deutung, die gegenseitige Umwandlung von ATP und Adenosin diphosphat (ADP) glatt durchzuführen, wobei die Abtrennung des Kofaktors von den Nebenprodukten erforderlich ist. Das beste Verfahren, um die Abtrennung zu erleichtern, ist dabei das Binden des Kofaktors an eine geeignete Matrix.

Es ist infolgedessen in zahlreichen Fällen erforderlich, ATP an eine geeignete Matrix zu binden. Es ist jedoch oft sehr schwierig, ATP an die Matrix zu binden, und deshalb ist es erforderlich, funktionelle Gruppen in ATP einzuführen, die dann leicht mit einer Matrix verbunden werden.

ATP-Derivate haben im allgemeinen im Vergleich zu ATP eine niedrige Substrataktivität. Es besteht infolgedessen ein Bedürfnis, ATP-Derivate mit einer höheren Substrataktivität aufzufinden.

N⁶-(Carboxymethyl)-ATP, hergestellt von Mosbach, European Journal of Biochemistry, Band 53 (1975), Seite 481, und N⁶-[N-(6-Aminohexyl)carbamoyl]-ATP, hergestellt von Yamazaki und Mitarbeiter, European Journal of Biochemistry, Band 77 (1977), Seite 511, sind zwei ATP-Derivate. Bisher war bekannt, daß beim Einführen einer funktionellen Gruppe an einer an deren Position als der N⁶-Stellung von ATP eine nur sehr niedrige Substrataktivität erzielt wird. Obwohl beide der vorerwähnten Verbindungen die funktionelle Gruppe in der N⁶-Stellung tragen, weisen diese Verbindungen doch keine sehr hohe Substrataktivität auf, und die praktische Anwendbarkeit dieser Verbindungen ist daher beschränkt. Da die N⁶-Carboxymethyl-Verbindung chemisch unstabil ist, treten beim Binden an eine Matrix oder beim Einführen von Abstandsgruppen bei der Umsetzung der N⁶-Carboxylgruppe mit einer Aminogruppen enthaltenden Verbindung Nebenreak tionen auf, und die gewünschte Umsetzung ist deshalb nur sehr schwer durchzuführen. Die zweitgenannte Verbindung wird aus ADP synthetisiert, und ist daher sehr viel teurer als ATP.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein ATP-Derivat zur Ver fügung zu stellen, welches eine hohe Substrataktivität aufweist.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der neuen Verbindung N⁶-(Carboxyethyl)-adenosintriphosphat und dessen Salzen gelöst. Geeignete Salze sind solche, bei denen eine oder mehrere der Phosphatgruppen oder die Carboxylgruppe mit einem Alkaliatom substituiert sind.

Das erfindungsgemäße ATP-Derivat kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann man es herstellen, indem man ATP in Wasser zusammen mit β-Halogenpropionsäure, wie β-Jodopropionsäure oder β-Bromopropionsäure oder mit β-Propiolacton löst und eine Dimroth-Umlagerung des ent stehenden 1-(Carboxyethyl)-ATP vornimmt. Das Derivat in der freien Säureform wird dann gewünschtenfalls mit einer Base unter Ausbildung des entsprechenden Salzes neutralisiert. In Wasser wird ATP mit einer β-Halogenpropionsäure oder β-Propiolacton bei einem pH von etwa 5 bis 8 und vorzugs weise 6 bis 7, bei etwa 20 bis 50°C umgesetzt. Die Säure und das Lacton werden in ungefähr äquimolaren Mengen bis vorzugsweise der 5fachen oder einer größeren Menge von ATP verwendet. Die Dimroth-Umwandlung wird vorzugsweise bei einem pH von 8 bis 11 und insbesondere von 9 bei 60 bis 90°C vorgenommen. Hierzu wird auf European Journal of Biochemistry, Band 52 (1975), Seite 481, verwiesen.

Das erfindungsgemäße ATP-Derivat hat eine Carboxylgruppe als funktionelle Gruppe an der N⁶-Stellung und kann deshalb als ein N⁶-(Carboxyethyl)-ATP bezeichnet werden. Es ist infolgedessen dem vorher erwähnten N⁶-(Carboxymethyl)-ATP strukturell ähnlich. Ein Vergleich zeigt jedoch, daß das erfindungsgemäße ATP-Derivat eine höhere Substrataktivität aufweist, und daß die Nachteile des Carboxymethyl-Derivats bei der Umsetzung mit einer Aminogruppen enthaltenden Ver bindung als Matrix oder als Zwischenstück nicht auftreten.

Das erfindungsgemäße ATP-Derivat kann bei den meisten Enzymen, für welche Adeninnucleotid ein Substrat oder Koenzym ist, angewendet werden. Das erfindungsgemäße N⁶- (Carboxyethyl)-ATP kann mit einer Aminogruppe enthaltenden Verbindung als Matrix oder als Abstandshalter umgesetzt und in der vorerwähnten Weise daran gekuppelt werden.

Beispiele von Aminogruppen enthaltenden Verbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Derivat reagieren, sind Aminoalkyl agarosen, wie Agarose-aminohexan, Aminoalkylcellulosen, wie Aminohexylcellulose, Polylysin, Polyethylenimin (alle die vorerwähnten Verbindungen sind Matrices) und Alkylendiamine, wie Hexamethylendiamin (Abstandshalter).

Das erfindungsgemäße ATP-Derivat kann bei Enzymen, wie Kinasen und Dehydrogenasen, angewendet werden. Insbesondere wurde die industrielle Anwendbarkeit auf Acetatkinase als Enzym für die gegenseitige Umwandlung von Adenin-Kofaktor, wie ATP und ADP, untersucht. Acetatkinase ist anderen Kinasen darin überlegen, daß das gegenseitige Umwandlungsverhältnis von ATP und ADP (ATP ⇄ ADP) hoch ist und das Acetylphosphat der phosphatliefernden Verbindung leicht synthetisiert werden kann (ATP + Essigsäure ⇄ ADP + Acetylphosphat).

Beispiel 1

1 g Dinatrium-ATP wurde in 10 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von 5 g β-Jodopropionsäure wurde der pH-Wert auf 6,5 eingestellt, und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Während der Umsetzung wurde der pH-Wert durch 2 mol/l Lithiumhydro xid auf 6,5 gehalten. Nach 8 Tagen wurden zum Reaktionsge misch 10 Volumenteile einer Aceton/Ethanol-Mischung (1 : 1, Volumenverhältnis) zugegeben. Der Niederschlag wurde ge sammelt, mit der vorerwähnten Aceton/Ethanol-Mischung ge waschen und die Aceton/Ethanol-Mischung wurde unter vermin dertem Druck entfernt. Die Ausbeute betrug 1,17 g. Nach Auflösen des Niederschlags in 10 ml Wasser wurde der pH auf 8,5 eingestellt und die Umlagerung wurde bei 70°C vor genommen. Während dieser Reaktion wurde der pH durch 2 m Lithiumhydroxid bei 8,5 gehalten. Nach 2,5 h wurde die die Umlagerungsverbindung enthaltende Lösung mit Eis gekühlt, mit 1 mol/l Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 7 eingestellt und auf eine stark basische Anionenaustauschersäule (2 cm Durchmesser und 32 cm Länge) gegeben. Die Säule wurde zunächst mit 300 ml Wasser gewaschen, und dann wurde ein linearer Lithiumchlorid gradient angelegt: Die Mischkammer enthielt 500 ml 0,3 mol/l Lithiumchlorid und das Reservoir 500 ml 0,5 mol/l Lithiumchlorid. In der abfließenden Lösung wurden die Hauptfraktionen mit einer U. V.-Absorption bei 268 nm gesammelt und konzentriert. Dazu wurde eine Ethanol/Aceton-Lösungsmittelmischung (1 : 1, Volumenverhältnis) zugegeben, wobei man 0,39 g N⁶-(Carboxy ethyl)-ATP als weißes Pulver erhielt.

Eine Untersuchung dieses Produktes durch Cellulose-Dünn schichtchromatografie unter Verwendung von 0,1 mol/l Kaliumphosphat (pH: 6,8) : Ammoniumsulfat : 1-Propanol- Mischung in einem Verhältnis von 100 (v) : 60 (w) : 2 (v) als Entwicklungslösungsmittel wurde ein einziger Fleck bei R_f 0,42 erhalten. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigte ein λ max 268 nm (ε = 15 500 m^-1cm^-1) in einer wäßri gen Lösung mit einem pH von 7.

Die Struktur der Verbindung wurde außerdem durch protonen kernmagnetische Resonanzmessung (NMR) in schwerem Wasser be stimmt. Das NMR-Spektrum wurde durch die Absorption der beiden Wasserstoffatome am Purinring bei δ = 8,86 und 8,65 (jeweils Singulett), die Absorption des Wasserstoffatoms in der 1′-Stellung der Ribose bei δ 6,56 (Doublett) und der Absorption des Wasserstoffatoms am Ethylen der Carboxyethyl gruppe bei δ = 4,20 und 3,02 (Triplett) charakterisiert.

Es wurde weiterhin durch die Farbbildung mittels der Molybdän blau-Reaktion festgestellt, daß die Verbindung drei Phosphoratome enthielt.

Beispiel 2

1 g Dinatrium-ATP wurde in 10 ml Wasser gelöst und dazu wurde bei einem pH von 6,8 β-Propiolacton gegeben. Die Umsetzung wurde bei pH 6,8 mit 2 mol/l Lithiumhydroxid bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 56 h wurden 10 Volumina einer Aceton/Ethanol- Mischung (1 : 1, Volumenverhältnis) zugegeben, wobei das Pro dukt ausfiel. Das Produkt wurde bei 70°C und pH 8,5 in glei cher Weise wie in Beispiel 1 umgelagert und über einer stark basischen Anionenaustauschersäule abgetrennt, wobei man 0,20 g N⁶-(Carboxyethyl)- ATP erhielt. Die Analyse, die in gleicher Weise wie in Bei spiel 1 erfolgte, zeigte, daß die Verbindung die gleiche Struktur wie in Beispiel 1 hatte.

Die bessere Substrataktivität der erfindungsgemäßen Ver bindung wird durch folgende Vergleichsversuche gezeigt.

Vergleichsversuch

N⁶-(Carboxymethyl)-ATP und N⁶-[N-(-Aminohexyl)carbamoyl]- ATP wurde nach Mosbach et al. bzw. Yamazaki et al. (siehe die beiden vorher genannten Literaturstellen) synthetisiert, und die Substrataktivität jeder dieser Substanzen wurde mit der des erfindungsgemäßen, nach Beispiel 1 erhaltenen ATP-Derivats verglichen. Die Substrataktivität wurde ge prüft gemäß Biochemica Information, Boehringer Mannheim Co. (1973) unter Verwendung des Enzyms Acetatkinase aus Bacillus stearothermophilus (hergestellt nach dem Verfahren gemäß der JP 52-25 088 (A) in einer spezifischen Aktivität von 1369 Einheiten/mg. Die Veränderung der Absorp tion bei 340 nm in der Zeiteinheit wurde in gleicher Weise gemessen, mit der Ausnahme, daß 2 mmol Fructose-1,6-Diphosphat zu der Untersuchungsmischung gegeben wurden. Die jeweiligen maximalen Reaktionsgeschwindigkeiten (V max) werden nachfolgend angegeben, wobei als Bezug ATP = 100 verwendet wird.

N⁶-(Carboxyethyl)-ATP (erfindungsgemäß) 35
N⁶-(Carboxymethyl)-ATP 20
N⁶-[N-(6-Aminohexyl)carbamoyl]-ATP 23.

Diese Ergebnisse zeigen die höhere Substrataktivität des erfindungsgemäßen Derivates.

Referenzbeispiel

Nachdem man 100 mg von jeweils N⁶-(Carboxymethyl) und N⁶- (Caboxyethyl) ATP-Derivate in 5 ml Wasser gelöst hatte, wurden 400 mg Hexamethylendiamin zugegeben. Der pH wurde unter Verwendung von 0,5 m HCl bei 4,7 gehalten, und dann wurden 150 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid- hydrochlorid (EDC) in üblicher Weise zugegeben und die Fähig keit des Derivates, mit diesem bekannten Abstandshalter zu reagieren, verglichen. Im Falle von N⁶-(Carboxymethyl)-ATP wurde die Reaktionslösung innerhalb einiger Minuten gelb und veränderte sich dann zu einer roten Farbe und wurde viskos. Beim Versuch, das Reaktionsprodukt in diesem Zustand unter Verwendung von verschiedenen Nichtlösungsmitteln zu gewinnen, kristallisierte das Produkt nicht und konnte nicht erhalten werden.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen ATP-Derivates konnte ein solches nachteiliges Verhalten nicht beobachtet werden, und man erhielt ein rohes Reaktionsprodukt als weißes Pulver nach Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton/ Ethanol-Mischung (1 : 1, Volumenverhältnis) zum Reaktions gemisch. Bei dem erfindungsgemäßen Derivat betrug die Ausbeute nach 4 h 90 mg im Falle von EDC.

Claims

N⁶-(Carboxyethyl)-adenosintriphosphat und dessen Salze.