SE445224B - Adenosintrifosfatderivat - Google Patents

Description

7909236-7 Följaktligen är det i många fall nödvändigt att fästa ATP på en lämplig matris. Emellertid är det svårt att fästa ATP i sig själv på matrisen och sålunda nödvändigt.att införa funktionella grupper i ATP vilken därefter lätt kan bindas till matrisen.

ATP-derivat har i allmänhet låg substrataktivitet i jämförelse med ATP. Följaktligen har man önskat finna ATP-derivat med högre substrataktivitet.

N6-(karboximetyl)-ATP framställd av Mosbach, European Journal of Biochemistry, volym 53 (1975) sid 481 och N6-[N-(6-amino- hexyl)karbamoyl]-ATP framställd av Yamazaki et al, European Journal of Biochemistry, volym 77 (1977) sid 511 är två ATP- derivat. Det har hittills varit känt att när funktionella grupper införes i en annan ställning än N6-ställningen av rATP erhålles mycket låg substrataktivitet. Fastän de båda ovannämnda föreningarna bär den funktionella gruppen i N - ställning har dessa föreningar inte särskilt hög substrat- aktivitet och problem uppkommer vid praktisk användning.

Eftersom N -karboximetyl-föreningen är kemiskt ostabil sker sidoreaktioner när man inberäknar (counting to) en matris eàler inför en kopplingsgrüpp (spacer) genom reaktion mellan N -karboxylgruppen och den aminogruppinnehållande föreningen vilket innebär att det är mycket svårt att åstadkomma den önskade reaktionen. Ä andra sidan syntetiseras den senare föreningen från ADP, som är mycket mera dyrbar än ATP.

Man har funnit att ett ATP-derivat som åskådliggöres av föl- jande formel har utomordentlig substrataktivitet och praktisk användbarhet i jämförelse med de tidigare kända ATP-derivaten. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett ATP-derivat som åskådliggöres av formeln 7909236-7 kal ' Nncnzcnzcoon 'ÛÖ N .<2 ° f? " H°-s°-°-%~°'ï-°' °“2 0 ou on on H n ATP-derivatet enligt föreliggande uppfinning innefattar även alkalimetallsalterna därav, där ett eller fler av fosfaterna eller karboxylgrupperna är substituerade med en alkalimetall- atom.

ATP-derivatet enligt föreliggande uppfinning kan syntetiseras enligt olika förfaranden. Detär exempelvis lätt att syntetise- ra genom reaktion mellan ATP upplöst i vatten och ß-halogen- propionsyra såsom B-jodpropionsyra eller B-brompropionsyra eller B-propiolakton och genomföra en Dimroth-omlagring av den erhållna 1-(karboxietyl)-ATP-föreningen. Derivatet i fri syraform neutraliseras om så önskas med en bas till bildning av motsvarande salt. I vatten får ATP reagera med ß-halogen- propionsyra eller B-propiolakton vid ett pH av ungefär 5 - 8, företrädesvis ungefär 6 - 7 vid ungefär 20 - 50°C. Syran och laktonen användes i åtminstone ekvimolära mängder till före- trädesvis 5 gånger eller mera mängden ATP. Dimroth-omlag~ ringen genomföres företrädesvis vid pH 8 - 11, helst ungefär 9, vid 60 till ungefär 9000. Hänvisníngar kan göras till Mosbach, ovan.

ATP-derivatet enligt föreliggande uppfinning har en karboxyl- grupp som funktionell grupp vid N -position och kan benämnas N6~(karboxietyl)-ATP. Följaktligen liknar den strukturellt 7909236-7 N6-(karboximetyl)-ATP som beskrivits ovan. I jämförelse med dessa har ATP-derivaten enligt föreliggande uppfinning en högre substrataktivitet och nackdelarna med karboximetyl- derivaten har inte observerats vid reaktion med en amino- grupp-innehållande förening som matris eller kopplingsgrupp (spacer).

ATP-derivatet enligt föreliggande uppfinning kan användas på de flesta enzymer för vilka adenin-nukleotiden är ett substrat eller ett koenzym. N6-(karboxietyl)-ATP-föreningen enligt föreliggande uppfinning kan reagera med en aminogrupp-inne- ihållande förening som matris eller kopplingsgrupp (spacer) och kopplas därtill som beskrivits ovan.

Exempel på aminogrupp-innehållande föreningar, som reagerar med derivaten enligt föreliggande uppfinning innefattar amino- alkylagaroser såsom agarosaminohexan, aminoalkylcellulosa så- som aminohexylcellulosa, polylysin, polyetylenimin (de ovan beskrivna föreningarna är matriser) och alkylendíamin såsom hexametylendiamin (kopplingsgrupp) (spacer).

ATP-derivatet enligt föreliggande uppfinning kan användas för enzymer såsom kinas och dehydrogenas. Speciellt har den industriella användningen av acetatkinas vittgående studerats som ett enzym för ömsesidig överföring av en adeninkofaktor såsom ATP och ADP. Acetatkinaset är överlägset andra kinas genom att det ömsesidiga överföringsförhållandet av ATP och ADP (ATPQI ADP) är högt och acetylfosfatet av fosfatgivaren kan lätt syntetiseras (ATP + ättiksyra.;2 ADP + acetylfosfat).

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel vari témperaturerna avser °C.

Exempel l l g dinatrium-ATP upplöstes i lO ml vatten. Efter tillsats av 5 g B-jodpropionsyra justerades pH till 6,5 och reaktionen 7909236-7 genomfördes vid rumstemperatur. Under reaktionen hölls pH vid 6,5 med 2M litiumhydroxid. Efter 8 dagar tillsattes 10 volym- mängder av en aceton-etanol-blandning (lzl, beräknat på voly- men) till reaktionsblandningen. Fällningen samlades, tvättades med den ovan beskrivna aceton-etanol-blandningen och aceton- etanol-blandningen avlägsnades därefter under reducerat tryck.

Utbytet var 1,17 g. Efter det fällningen upplösts i 10 ml vat- ten justerades pH till 8,5 och omlagringen genomfördes vid 700. Under reaktionen hölls pH-värdet vid 8,5 med 2M litium- hydroxid. Efter 2,5 timmar kyldes lösningen innehållande om- lagrad förening med is, justerades till pHg7 med lN saltsyra och påfördes på en Dowex l-X8~kolonn (Cl_-typ, 200 - 400 mesh, 2 cm diameter och 32 om lång). Kolonnen tvättades först med 300 ml vatten och en lineär litiumkloridgradient påfördes: blandningskammaren innehöll 500 ml O,3M litiumklorid och reservoaren 500 ml 0,5M litiumklorid. I effluentet samlades huvudfraktionerna med U.V. absorption vid 268 nm och koncent- rerades. En etanol-aceton lösningsmedelsblandning (l:1, be- räknat på volymen) tillsattes och gav 0,39 E N6-(karboxíetyl)- ATP som ett vitt pulver.

När denna produkt analyserades genom cellulosatunnskikts- kromatografi (Avicel-SF) med användning av en 0,lM kalium- fosfat (pH: 6,8): ammoniumsulfat : l-propanol-blandning i ett förhållande av 100 (volym) : 60 (vikt) : 2 (volym) som fram- kallningslösningsmedel erhölls en enkel fläck vid Ef 0,Ä2, Det ultravioletta absorptionsspektrumet visade A.max 268 nm (¿ = l5500M'lcm_l) i en vattenlösning med pH 7.

Strukturen hos föreningen säkerställdes ytterligare genom protonkärnmagnetisk resonans (NMR) i tungt vatten. NMR- spektrumet karatäriserades genom absorption av de två väte- atomerna på purinringen vid 8 =8,86 och 8,65 (singlet, resp.), absorption av väteatomen vid 1'-position av ribos vid 6=6,56 (dublett) och absorption av väteatomerna på etylenen av kar- boxietylgruppen vid 5=U,20 och 3,02 (triplett, resp.). 7909236-7 Dessutom bestämdes genom färgbildning vid molybdenblå-reak- tion att föreningen hade tre fosforatomer.

Exempel 2 1 g dinatrium~ATP upplöstes i 10 ml vatten och 0,6 ml B- propiolakton tillsattes vid pH 6,8. Reaktíonen genomfördes vid rumstemperatur vid pH 6,8 med 2M litiumhydroxid. Efter 56 timmar tillsattes 10 volymmängder aceton-etanol-blandning (l:l, beräknat på volymen) för utfällning av produkten. Pro- dukten utsattes för omlagring vid 700 och pH 8,5 på samma sätt som i exempel 1 och separerades genom Dowex l-X8-kolonn och gav 0,20 g N6-(karboxietyl)-ATP. När produkten analyserades på samma sätt som i exempel 1 visade det sig att föreningen hade samma struktur som i exempel 1.

Referensexempel 1 N6-(karboximetyl)-ATP och N6*[N-(6-aminohexyl)-karbamoyl]-ATP syntetiserades enligt Mosbach et al och Yamazaki et al och substrataktiviteten för var och en av föreningarna jämfördes med den för ATP-derivatet erhållet enligt exempel 1 enligt uppfinningen. Substrataktivíteten testades på det sätt som be- skrivits i Bioohemica Information, Boehringer Mannheim Co (1975) med användning av, som enzym, acetatkinas från Bacillus stearothermophilus (framställd enligt förfarandet i den japanska patentansökan (OPI) 25088/77 (uttrycket “0PI" avser "publicerad icke granskad japansk patentansökan"))i specifik aktivitet av 1360 enheter/mg. Absorbansändringen vid BHO nm per tidsenhet mättes på samma sätt förutom att 2mM fruktos- 1,6-difosfiat sattes till analysblandningen. Respektive maxi- mala reaktionshastigheter (V max) anges nedan baserad på ATP som 100. " i ~ 6 _ ' ~ - _) _ ' -' N6-(karboxietyl)-ATP (uppfinning) 35 N6-(karboximetyl)-ATP 20 N ¥[N-(6-aminohexy1)karbamoyl]-ATP 23. 7909236-7 Resultaten visar en högre substrataktivitet för derivatet en- ligt föreliggande uppfinning.

Referensexempel 2 När 100 mg vardera av N6-(karboximetyl) och N6-(karboxietyl)_ ATP-derivat upplösts i 5 ml vatten tillsattes 400 mg hexa- metylendiamin. Under det att pH hölls vid U,7 med användning av 0,5M HCl tillsattes 150 mg l-etyl-5-(3-dimetylaminopropyl)- karbodiimidhydroklorid (EDC) på konventionellt sätt för att jämföra derivatens förmåga att reagera med denna konventionel- la kopplingsgrupp. För N6-(karboxmetyl)-ATP gulnade reaktions- lösningen inom några minuter och blev gradvis röd och vískös.

När reaktionsprodukten försökte återvinnas i detta tillstånd med användning av olika iek-lösningsmedel kristalliserade reaktionsprodukten inte och kunde inte erhållasl Ä andra sidan observerades inga sådana ofördelaktiga fenomen och en oren reaktionsprodukt erhölls som ett vitt pulver genom tillsats av 10 volymmängder av en aceton-etanol-blandning (lzl, beräknat på volymen) av reaktionsblandningen. Utbytet efter H timmar var 90 mg för EDC för derivatet enligt före- liggande uppfinning.

Claims (1)

1. 7909236-7 íß PATENTKRAV Ådenosintrifosfatderivat med formeln NHQHZCHZCOOH N Egg' NÉ>' 0 0 7 0 ll ll ll nu-ï-o-P-0-f-ø-caz 0 on on oa OH OH och alkalimetallsalterna därav.