DE60006814T2

DE60006814T2 - Dinucleotid-kristalle

Info

Publication number: DE60006814T2
Application number: DE60006814T
Authority: DE
Inventors: Kenya Mori; Takanori Miyashita; Hideaki Maeda; Hiroshi Sato; Yutaka Noda
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2020-07-01
Also published as: EP1191032A4; DE60021629T2; CN1144811C; PL202200B1; CN1359387A; BR0012205A; KR100593723B1; EP1362862A1; EP1191032B1; CZ20014502A3; ZA200110468B; EP1191032A1; US6617444B1; PL202176B1; ES2245431T3; PL352363A1; JP3421666B2; NO20016381D0; AU767136B2; CA2376860A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Kristalle von P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-) tetraphosphat (dCP4U) oder einem pharmazeutisch unbedenklichen oder verträglichen Salz davon (im Folgenden zur Vereinfachung als "dCP4U" bezeichnet), das oder die geeignet oder brauchbar ist oder sind als ein therapeutisches Mittel gegen chronische Bronchitis, Sinusitis und dergleichen; ein Verfahren zur Herstellung der Kristalle; und ein Verfahren zur effizienten oder wirksamen Herstellung von dCP4U.
Allgemeiner Stand der Technik
dCP4U, das durch die folgende Formel (I) dargestellt wird:
oder ein Salz davon, ist ein selektiver Agonist für den P2Y2-Purin-Rezeptor und/oder P2Y4-Purin-Rezeptor und ist eine Verbindung, von der erwartet wird, dass sie als ein therapeutisches Mittel für chronische Bronchitis, Sinusitis und dergleichen entwickelt wird (vgl. WO 98/34942).
Bisher war es nicht möglich, dCP4U in Kristallform zu erhalten, und dCP4U wurde bisher nur in Form von weißem Pulver (weißem Feststoff) durch Gefriertrocknen hergestellt. Die herkömmlicherweise erhaltenen pulverförmigen oder pulverigen Produkte oder Erzeugnisse von dCP4U weisen nur eine geringe Reinheit von 82% auf (gemessen durch HPLC). Insbesondere ist es schwierig, Uridin-5'-triphosphat (UTP), das als Ausgangsmaterial von dCP4U dient, abzutrennen, und hoch gereinigtes dCP4U wurde nur unter großen Schwierigkeiten durch eine auf herkömmliche Weise eingesetzte Ionen-Austausch-Chromatographie hergestellt (WO 98/34942).
Das obige weiße Pulver geringer Reinheit weist Nachteile auf, wie z. B. Hygroskopie. Daher muss die Herstellung eines Arzneimittels oder eines Pharmazeutikums von dCP4U in einem speziellen Apparat durchgeführt werden, in dem Feuchtigkeit sehr genau kontrolliert wird. Selbst nach Herstellung eines Arzneimittels muss das Produkt oder Erzeugnis fest oder dicht verpackt werden. Da das Arzneimittel außerdem nur für einen sehr kurzen Zeitraum zur Verfügung steht, aufgrund der geringen Stabilität des Pulverprodukts, war die Bereitstellung von hoch gereinigten und stabilen Kristallen von dCP4U sehr erwünscht.
dCP4U wird aus 2'-Deoxycytidin-5'-monophosphat (dCMP) und UTP unter Verwendung eines Aktivierungsmittels, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), hergestellt. Herkömmliche Verfahren stellen jedoch eine vergleichsweise geringe synthetische Ausbeute bereit; d.h., so niedrig wie etwa 9 Gew.-% (siehe Beispiel 20 der WO 98/34942), und können niemals als ein praktisches Verfahren dienen. Demzufolge war auch die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von dCP4U in hoher Ausbeute und in einem großen Maßstab ebenfalls erwünscht.
Im Hinblick auf das oben stehende ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, stabile Kristalle von dCP4U, das zum Herstellen von Arzneimitteln geeignet ist, bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der Kristalle bereitzustellen. Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wirksames Verfahren bereitzustellen, das geeignet ist zur Herstellung von dCP4U in großem Maßstab.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten umfangreiche Untersuchungen zur Stabilisierung von dCP4U durch, und fanden, dass dCP4U, das eine Reinheit von 95% oder mehr aufweist, hergestellt werden kann durch Anionenaustausch-Chromatographie in Kombination mit einer Chromatographie, die aktivierte Holzkohle oder Aktivkohle oder Absorptionskohle einsetzt (Chromatographie an aktivierter Holzkohle), und dass dCP4U-Kristalle aus einem solchen hoch gereinigten dCP4U hergestellt werden können. Es konnte gezeigt werden, dass die auf diese Weise erhaltenen dCP4U-Kristalle eine Reinheit besitzen, die beträchtlich höher ist als die von auf herkömmliche Weise hergestelltem dCP4U-Pulver, keine Hygroskopie aufweisen und hohe Stabilität aufweisen.
Die Erfinder führten auch umfangreiche Untersuchungen an Verfahren zur Herstellung oder Synthese von dCP4U durch unter Verwendung von kostengünstigem Uridin-5'-monophosphat (UMP) anstelle von teurem UTP, und fanden, dass dCP4U wirksam oder effizient unter Verwendung von Diphenylphosphorchloridat (DPC) und einem Pyrophosphat (PPi) hergestellt werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Untersuchungen vollendet.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Kristalle von dCP4U bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Kristallen von dCP4U bereit, wobei das Verfahren eine Reinigung von rohem dCP4U durch eine Anionenaustausch-Chromatographie und eine Chromatographie an aktivierter Holzkohle umfasst, und eine Zugabe eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels zu einer Lösung von gereinigtem dCP4U, um dadurch dCP4U in Form von Kristallen zu präzipitieren oder auszukristallisieren.
Die vorliegende Beschreibung offenbart auch ein Verfahren zur Herstellung von dCP4U, das ein Umsetzen von UMP, dCMP, DPC und PPi umfasst.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Photo, das die Kristalle von kristallinem dCP4U·4Na (3,5-Hydrat) zeigt. Das Photo wurde unter einem Polarisationsmikroskop (Vergrößerung: x440) aufgenommen, wobei 1 mm auf dem Photo 25 μm entspricht.
2 zeigt ein Röntgenbeugungsspektrum oder Röntgenbeugungsdiagramm von kristallinem dCP4U·4Na (3,5-Hydrat).
3 zeigt ein Röntgenbeugungsdiagramm von kristallinem dCP4U·4Na (Decahydrat).
4 zeigt ein Röntgenbeugungsdiagramm von weißem, pulverigen dCP4U (gefriergetrocknetes Produkt).
5 zeigt ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na (3,5-Hydrat).
6 zeigt ein ³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na (Decahydrat).
7 zeigt ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von weißem, pulverigem dCP4U (gefriergetrocknetes Produkt).
Beste Ausführungsform zum Ausführen der Erfindung
Die Kristalle von dCP4U der vorliegenden Erfindung werden erhalten durch Reinigung von rohem dCP4U unter Verwendung von speziellen Maßnahmen oder Mitteln und durch Zugabe von einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel zu einer Lösung von gereinigtem dCP4U, um dadurch dCP4U als Kristalle zu präzipitieren oder kristallisieren. Die vorliegende Erfindung wird nun in Bezug auf (1) Reinigung von dCP4U und (2) Kristallisation von dCP4U beschrieben.
(1) Reinigung von dCP4U
dCP4U kann durch Anionenaustausch-Chromatographie in Kombination mit einer Chromatographie an aktivierter Holzkohle gereinigt werden. Obwohl die zwei Chromatogaphie-Techniken in willkürlicher Reihenfolge durchgeführt werden können, wird die Anionenaustausch-Chromatographie im Hinblick auf eine Verbesserung der Reinheit von dCP4U vorzugsweise vor der Chromatographie an aktivierter Holzkohle durchgeführt.
Ein Styrol- oder Acrylharz kann als Anionenaustauschharz bei den oben beschriebenen Chromatographie-Techniken verwendet werden. Beispiele von Harzen, die verwendet werden können, schließen stark basische Anionenaustauschharze ein, wie z. B. AMBERLITE IRA 402 (Rohm & Haas Co.), DIAION PA-312 und DIAION SA-11A (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), und schwach basische Anionenaustauschharze, wie z. B. AMBERLITE IRA 67 (Rohm & Haas Co.) und DIAION WA-30 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.).
Die aktivierte Holzkohle oder Aktivkohle kann in der Form von aktivierter Holzkohle oder Aktivkohle im Chromatographie-Grad oder in Chromatographie-Qualität verwendet werden, die grob gemahlen oder zermahlen oder zerrieben oder zerschlagen oder geschrotet ist, oder in Teilchen oder Partikel geformt ist, und kann kommerziell erhältliche Produkte oder Erzeugnisse einschließen (z. B. solche von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. und Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.).
Die Chromatographie kann auf eine diskontinuierliche Art und Weise oder chargenweise durchgeführt werden unter Verwendung einer Säule etc. Wenn eine Säulenchromatographie durchgeführt wird, kann eine wässerige, saure Lösung oder eine Mischung davon mit einem Salz, das eine gesteigerte Ionenkraft oder Ionenstärke aufweist, wie z. B. Natriumchlorid, als Laufmittel oder Eluent für die Anionenaustausch-Chromatographie verwendet werden; und Wasser oder eine wässerige Lösung von einem Alkali, wie z. B. Natriumhydroxid, kann als Laufmittel oder Eluent für eine Säulenchromatographie an aktivierter Holzkohle verwendet werden. Ein vorhergehender Test in kleinem Maßstab kann durchgeführt werden, um die geeignete Konzentration von jedem Laufmittel innerhalb eines Bereichs von 0,001 M bis 10 M auszuwählen.
(2) Kristallisation von dCP4U
dCP4U wird durch Zugabe eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels zu einer Lösung, die das auf diese Weise gereinigte dCP4U enthält, kristallisiert.
Beispiele von hydrophilen, organischen Lösungsmitteln, die verwendet werden können, schließen Alkohole ein, die sechs oder weniger Kohlenstoffatome aufweisen, wie z. B. Methanol und Ethanol; Ketone, wie z. B. Aceton; Ether, wie z. B. Dioxan; Nitrile, wie z. B. Acetonitril; und Amide, wie z. B. Dimethylformamid. Unter diesen sind Alkohole, besonders Ethanol, bevorzugt.
In noch weiteren Einzelheiten wird gegebenenfalls eine Lösung des auf diese Weise gereinigten dCP4U oder eine Aufschlämmung oder eine Suspension, die durch Konzentration der Lösung erhalten wird, behandelt, um dadurch den pH auf 5–10 einzustellen, vorzugsweise 6–9, und ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel wird zu der Lösung oder der Aufschlämmung bei 60°C oder weniger gegeben, vorzugsweise bei 20°C oder weniger, um dadurch den gelösten Stoff als stabile Kristalle von dCP4U zu präzipitieren oder zu kristallisieren.
Die auf diese Weise erhaltenen dCP4U-Kristalle der vorliegenden Erfindung enthalten dCP4U in einer Menge von 95% oder mehr und UTP in einer Menge von 3% oder weniger. Vorzugsweise enthalten die dCP4U-Kristalle dCP4U in einer Menge von 97% oder mehr und UTP in einer Menge von 2% oder weniger. Ganz besonders bevorzugt enthalten dCP4U-Kristalle dCP4U in einer Menge von 98% oder mehr und UTP in einer Menge von 1% oder weniger.
Solche hoch reinen dCP4U-Kristalle können in Form eines Salzes, Hydrats oder Hydratsalzes vorliegen. Beispiele von den Salzen schließen pharmazeutisch verträgliche oder pharmazeutisch unbedenkliche Salze ein, wie z. B. Alkalimetallsalze, wie z. B. Natriumsalze und Kaliumsalze; Erdalkalimetallsalze, wie z. B. Calciumsalze und Magnesiumsalze; und Ammoniumsalze. Das dCP4U kann durch 1 bis 4 Metallatome substituiert sein, um ein Salz zu bilden.
Das obige Hydrat kann 1–14 Moleküle Wasser umfassen, die an ein Molekül dCP4U gebunden sind oder einem Molekül dCP4U anhaften, und das obige Hydratsalz kann 1–14 Moleküle Wasser umfassen, die an ein Molekül eines Alkalimetallsalzes von dCP4U gebunden sind oder daran haften.
Außerdem schließen die Kristalle von dCP4U gemäß der vorliegenden Erfindung auch Tautomere davon ein.
Die auf diese Weise erhaltenen Kristalle von dCP4U werden gegebenenfalls durch ein übliches Verfahren getrocknet, wie z. B. einem Trocknen bei vermindertem Druck, einem Trocknen unter einem Luftstrom oder Luftfluss oder einem Trocknen durch Erwärmen, und sie werden nachfolgend in einen Container oder Behälter (z. B. eine Flasche, Tasche oder Beutel, Dose, Ampulle) gegeben. Ein Verpacken in dem Behälter kann erreicht werden, so dass der Behälter offen, geschlossen, luftdicht oder versiegelt ist, oder abgeschlossen. Der an Luft offene Zustand ist nicht bevorzugt im Hinblick auf die Beibehaltung der Lagerstabilität der Kristalle.
Das Verfahren zum Herstellen von dCP4U gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Umsetzen von UMP, dCMP, DPC und PPi.
Insbesondere umfasst das Verfahren ein Umsetzen von UMP mit DPC, um dadurch UMP-Diphenylphosphat (UMP-DPP) zu synthetisieren; ferner ein Behandeln der das UMP-DPP enthaltenden Reaktionsmischung mit PPi, um dadurch das UTP in der Mischung zu bilden; und ein Umsetzen des auf diese Weise gebildeten UTP ohne Isolierung aus der Reaktionsmischung, wobei dCMP in Gegenwart von DPC vorliegt, um dadurch die Zielverbindung dCP4U zu bilden.
Bei der Herstellung oder Synthese von UMP-DPP aus UMP kann ein auf herkömmliche Weise hergestelltes UMP-Trialkylaminsalz (z. B. UMP-Tributylaminsalz) in einem Lösungsmittel gelöst werden. Beispiele des Lösungsmittels schließen Amide ein, wie z. B. DMF und Dimethylacetamid (DMAC); cyclische Ether, wie z. B. Dioxan und Tetrahydrofuran; Ketone, wie z. B. Aceton; und Dimethylimidazolidinon, Hexamethylphosphorsäuretriamid, oder eine Mischung von zwei oder mehreren von diesen. Nachfolgend werden DPC und gegebenenfalls Trialkylamin zu der Lösung gegeben, und die Mischung lässt man bei 10–50°C über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten bis fünf Stunden reagieren oder sich umsetzen.
Die PPi's, die mit UMP-DPP reagieren, sind vorzugsweise organische Alkalisalze von PPi. Beispiele der Salze schließen ein Hexylaminsalz, ein Dibutylaminsalz, ein Triethylaminsalz und ein Tributylaminsalz ein.
Bei der Umsetzung von UMP-DPP mit einem organischem Alkalisalz von PPi kann das organische Alkalisalz von PPi in einem Lösungsmittel gelöst werden. Beispiele von solchen Lösungsmitteln schließen Amide ein, wie z. B. DMF, DMAC und Formamid; cyclische Ether, wie z. B. Dioxan und Tetrahydrofuran; Ketone, wie z. B. Aceton; und Dimethylimidazolidinon, Hexamethylphosphorsäuretriamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, oder eine Mischung von zwei oder mehreren von diesen. Nachfolgend wird die Lösung zu der auf diese Weise synthetisierten UMP-DPP-Lösung gegeben und die Mischung lässt man bei 10–50°C für etwa 30 Minuten bis 5 Stunden reagieren oder sich umsetzen.
Die Reaktion oder Umsetzung zwischen UMP-DPP und organischem Alkalisalz von PPi kann in Gegenwart einer geeigneten Base durchgeführt werden. Beispiele der Base schließen Pyridinbasen ein, wie z. B. Pyridin, 2,6-Lutidin, 2,4-Lutidin, α-Picolin, β-Picolin, γ-Picolin, 2,4-Dimethylaminopyridin, α-Collidin, β-Collidin und γ-Collidin, wobei Pyridin besonders bevorzugt ist. Ein basisches Lösungsmittel für die Reaktion oder Umsetzung ist auch bei den Basen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eingeschlossen. Die Konzentration der Base ist nicht besonders beschränkt. Die Base wird vorzugsweise in einer Menge von 6 Äquivalenten oder mehr in Bezug auf UMP zugegeben, ganz besonders bevorzugt in einer Menge von 18 Äquivalenten oder mehr.
Durch die Umsetzung oder Reaktion zwischen UMP-DPP und organischem Alkalisalz von PPi wird UTP in der Reaktionsmischung synthetisiert oder gebildet. Das auf diese Weise gebildete UTP und dCMP werden in Gegenwart von DPC umgesetzt oder reagieren miteinander, um dadurch dCP4U zu bilden oder zu synthetisieren.
Obwohl dCMP per se oder an sich zu der Reaktionsmischung gegeben werden kann, wird dCMP in dCMP-Diphenylphosphat (dCMP-DPP) auf eine Art und Weise überführt, die ähnlich ist zu der, die eingesetzt wird in dem Fall von UMP, und das dCMP-DPP kann auch zugegeben werden.
Die Reaktion oder Umsetzung von dCP4U kann durchgeführt werden durch Zugeben von DPC in einer Menge von 1,1 Äquivalenten oder mehr und durch Zugeben von dCMP oder dCMP-DPP in einer Menge von 0,5 bis 1,5 Äquivalenten, bezogen auf UMP, das als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, zu der zuvor genannten synthetisierten UTP-Lösung, und die Mischung lässt man bei 10–50°C über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten bis 5 Stunden reagieren oder sich umsetzen.
Das auf diese Weise erhaltene dCP4U wird gereinigt und auf die zuvor genannte Art und Weise kristallisiert, um dadurch die dCP4U-Kristalle der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun in weiteren Einzelheiten durch Beispiele beschrieben, die nicht so ausgelegt werden dürfen, als dass sie die Erfindung daraufhin beschränken würden.
Beispiel 1 Herstellung von dCP4U·4Na-Kristallen
(1) Verfahren unter Verwendung von DCC
dCP4U wurde nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, wie es in WO 98/34942 beschrieben ist, unter Verwendung von UTP, dCMP und DCC. Die Umsetzung wurde in einem Maßstab von 20 mmol durchgeführt.
Die auf diese Weise erhaltene dCP4U-Lösung wurde mit Wasser verdünnt, um dadurch das Gesamtvolumen auf 1.000 ml einzustellen, und die verdünnte Lösung wurde auf eine Säule gegeben, die mit einem mittleren oder mittel basischen Anionenaustauschharz (AMBERLITE IRA-67, Produkt von Rohm & Haas Co.) beladen war. Eine Elution wurde in aufeinander folgenden Schritten unter Verwendung von Wasser, einer 0,18 M-wässerigen Chlorwasserstoffsäurelösung und einer 0,005 M-wässerigen Chlorwasserstoffsäurelösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, durchgeführt, um dadurch Fraktionen zu sammeln, die dCP4U enthielten.
Die auf diese Weise erhaltenen dCP4U-Fraktionen (4000 ml) wurden auf eine Säule aufgetragen, die an aktivierter Holzkohle in einer Chromatographie-Güte oder -Grad beladen war (Taiko Granular Activated Charcoal SGP, Produkt der Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.), und dCP4U wurde unter Verwendung einer 0,05 M-wässerigen Natriumhydroxidlösung (8000 ml) eluiert.
Die auf diese Weise erhaltenen Fraktionen von dCP4U wurden kombiniert oder vereinigt und konzentriert, um dadurch eine Aufschlämmung oder Suspension zu bereiten. Der pH der Aufschlämmung wurde auf 6,0 eingestellt. Die Aufschlämmung wurde gerührt, während Ethanol schrittweise zu der Aufschlämmung gegeben wurde, und die erhaltene Aufschlämmung wurde weiter auf 10°C unter Rühren gekühlt, um dadurch dCP4U·4Na-Kristalle zu präzipitieren oder zu kristallisieren. Die Kristalle wurden abgetrennt, um 8,9 g der dCP4U 4Na-Kristalle als Ausbeute zu erhalten. Die isolierten Kristalle wurden bei vermindertem Druck bei etwa 60°C über einen Zeitraum von etwa 4 Stunden getrocknet und wurden dann einer instrumentellen Analyse unterworfen.
(2) Verfahren unter Verwendung von DPC
UTP·3Na (12,8 kg) wurde in Wasser (135 L) gelöst, und die erhaltene Lösung wurde einer Säule zugeführt, die mit einem Kationen-Austauschharz (Produkt oder Erzeugnis von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) beladen war. Die Lösung, die die Säule passiert hatte, und Fraktionen, die mit Wasser eluiert wurden, wurden kombiniert, und Tributylamin (TBA; 13,6 kg) wurde nach und nach oder in Portionen zur Neutralisation unter einem Rühren zu der vereinigten oder kombinierten Lösung gegeben. Die Lösung wurde konzentriert, und Formamid (10 kg) wurde zu der Lösung gegeben. Die erhaltene Lösung wurde durch Kochen mit Dioxan dehydratisiert. Nachfolgend wurde das dehydratisierte Material mit Pyridin (11,6 kg) verdünnt, um dadurch eine Pyridinlösung von UTP herzustellen.
In ein anderes Gefäß, das Methanol (18 L) enthielt, wurde dCMP (7,5 kg) gegeben. TBA (4,5 kg) wurde in Portionen oder schrittweise oder nach und nach zu der Lösung unter einem Rühren gegeben, die Lösung wurde auf 60°C erwärmt. Nachdem die Inhaltsstoffe gelöst waren, wurde die Lösung bis zur Trockne konzentriert. Das getrocknete Material wurde unter einem Vakuum bei 75°C weiter getrocknet und wurde gemahlen oder zerstoßen oder zerkleinert. Das zerkleinerte Material (10,3 kg) wurde in Dimethylacetamid (DMAC) (16,7 kg) suspendiert, und Diphenylphosphorchloridat (DPC) (4,4 kg) wurde zu der Suspension gegeben, und die Mischung wurde 10 Minuten lang gerührt. Nachfolgend wurde weiter TBA (10,8 kg) zu der Mischung gegeben, und die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, um dadurch eine dCMP-DPP-Lösung herzustellen.
Für die auf diese Weise hergestellte dCMP-DPP-Lösung wurde die Pyridinlösung von UTP, die auf die zuvor genannte An und Weise hergestellt worden war, unter Rühren zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von entionisiertem Wasser beendet oder abgebrochen.
Zu der obigen Mischung wurde eine 30% wässerige Natriumhydroxid-Lösung (31 L) gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, und freigesetztes TBA wurde durch Verteilung oder Trennen oder Teilung entfernt. Eine 6 mol/L Chlorwasserstoffsäure-Lösung wurde zu der wässerigen Phase gegeben, um dadurch den pH der Lösung auf etwa 7 einzustellen. Die Lösung wurde durch Entfernung des Lösungsmittels konzentriert, und ein gleiches Volumen von 95% Ethanol wurde zu der konzentrierten Lösung gegeben. Die erhaltene Mischung ließ man über Nacht stehen. Die obere Phase der Mischung, d.h. eine Ethanolphase, wurde durch Absaugen entfernt, und Wasser wurde zu dem erhaltenen, klebrigen Präzipitat oder Kristallisat gegeben, um dadurch das Präzipitat oder Kristallisat zu lösen. Das restliche Lösungsmittel wurde durch Konzentration des Lösungsmittels entfernt.
Das Gesamtvolumen der auf diese Weise hergestellten dCP4U-Lösung wurde auf 2.500 L eingestellt, und die Lösung wurde einer Säule zugeführt, die mit einem mittleren oder mittel basischen Anionenaustauschharz (AMBERLITE IRA-97, Produkt von Rohm & Haas Co.) beladen war. Eine Elution wurde in Schritten oder nach und nach mit Wasser, einer wässerigen 0,1 mol/L Chlorwasserstoffsäure-Lösung, und einer wässerigen 0,005 mol/L Chlorwasserstoffsäure-Lösung, die 0,4 mol/L Natriumchlorid enthielt, durchgeführt, um dadurch Fraktionen zu sammeln, die dCP4U enthielten.
Die auf diese Weise erhaltenen dCP4U-Fraktionen (2.100 L) wurden einer Säule zugeführt, die an aktivierter Holzkohle (Taiko Granular Activated Carbon SGP, Produkt von Futamura Chemical Industries, Co., Ltd.) von Chromatographie-Qualität oder -Güte beladen war, und dCP4U wurde unter Verwendung einer wässerigen 0,05 mol/L Natriumhydroxid-Lösung (1.200 L) eluiert.
Die auf diese Weise erhaltenen Fraktionen wurden vereinigt oder kombiniert und konzentriert. Der pH der erhaltenen Lösung wurde unter Verwendung einer wässerigen 30% Natriumhydroxid-Lösung auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde gerührt, während 95%iger Ethanol schrittweise oder nach und nach zu der Lösung gegeben wurde, um dadurch dCP4U·4Na-Kristalle zu präzipitieren oder zu kristallisieren. Die Kristalle wurden abgetrennt und vier Stunden lang bei 60°C getrocknet, um dadurch 4,2 kg an dCP4U·4Na-Kristalle (Wassergehalt: 5,9%, Ausbeute an isolierter Verbindung: 22%) zu erhalten.
< Physikalische Eigenschaften der dCP4U·4Na-Kristalle >
Die in (1) oder (2) hergestellten dCP4U·4Na-Kristalle von Beispiel 1 und weißes Pulver von dCP4U·4Na (gefriergetrocknetes Produkt), das auf die gleiche Art und Weise hergestellt wurde, wie in dem Verfahren, das in Beispiel 20 der WO 98/34942 beschrieben ist, wurden einer instrumentellen Analyse unterworfen. Die Kristalle wurden mit dem gefriergetrockneten Produkt in Bezug auf die physikalischen Eigenschaften verglichen.
(3) Instrumentelle Analyse
1) Analyse der Reinheit
Die dCP4U·4Na-Kristalle, die in (1) und (2) von Beispiel 1 erhalten wurden, und dCP4U-Fraktionen nach Reinigung durch jede der Chromatographien wurden mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) einer Analyse in Bezug auf die Reinheit unterworfen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Die Bedingungen für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie sind unten beschrieben.
Säule: HITACHIGEL #3013-N (Produkt von Hitachi Keisokuki Service)
Laufmittel: 10% CH₃CN, 0,18 M NH₄Cl, 0,03 M KHP₂O₄ und 0,03 M KHP₂O₄
Nachweisverfahren: UV-Detektion oder Bestimmung bei 262 nm
Tabelle 1 (DCC-Verfahren)
Tabelle 2 (DPC-Verfahren)
2) Kristallform
1 zeigt ein Photo von einer typischen Kristallform von dCP4U·4Na-(3,5-Hydrat)-Kristallen.
3) Wassergehalt
Der Wassergehalt der dCP4U·4Na-Kristalle wurde nach der Karl-Fischer-Methode gemessen. Es wurde gefunden, dass die dCP4U·4Na-Kristalle bei einem Wassergehalt von 6,9 bis 17,4 Gew.-% stabilisiert werden, der sich verändert gemäß dem Grad des Trocknens. Die Kalkulationsergebnisse oder Rechenergebnisse zeigen sichtlich, dass sich 3,5–10 Wassermoleküle an ein dCP4U-Molekül binden oder daran haften oder daran hängen.
4) Schmelzpunkt
Der Schmelzpunkt der dCP4U·4Na-Kristalle wurde nach einem herkömmlichen Verfahren gemessen. Es wurde gefunden, dass der Schmelzpunkt 202 bis 210°C betrug. Der Schmelzpunkt des gefriergetrockneten Produkts betrug etwa 195 bis 210°C.
5) Röntgenbeugung
Die dCP4U·4Na-Kristalle wurden einer Röntgenbeugung unterworfen unter Verwendung eines Röntgenbeugungs-Apparats (Modell: RINT2500V, Erzeugnis oder Produkt von Rigaku Denki) unter den folgenden Bedingungen (Messfehler: ±0,1°). Das auf diese Weise erhaltene Röntgenbeugungsspektrum oder Röntgenbeugungsdiagramm und die Daten der Peaks oder Signale von dCP4U·4Na-3,5-Hydrat sind in 2 bzw. Tabelle 3 gezeigt. In ähnlicher Weise sind das Röntgenbeugungsdiagramm und die Daten der Peaks oder Signale von dCP4U·4Na-Decahydrat in 3 bzw. Tabelle 4 gezeigt. Außerdem ist das Röntgenbeugungsdiagramm des gefriergetrockneten Produkts in 4 als Referenz oder Vergleich gezeigt.
(Bedingungen bei der Messung)

Röntgenstrahlenröhre: Cu-Kα
Röntgenstrahlenleistung: 50 kV–300 mA
Abtastgeschwindigkeit: 4,0°/Minute
Abtastintervall: 0,02°
Bereich der Winkelmessung: 2–40°
Spalt: DS-0,5°, RS-0,15 mm, SS-0,5°
Vorbehandlung: Mahlen oder Zerstoßen mit Hilfe eines Achat-Mörsers

Tabelle 3 Kristallines dCP4U · 4Na-3,5-Hydrat
Tabelle 4 Kristallines dCP4U·Decahydrat
6) Hygroskopie
Die dCP4U·4Na-Kristalle (Decahydrat) mit einem Wassergehalt von etwa 17,4% ließ man 2 Tage lang unter den folgenden Bedingungen a), b) und c) stehen: a) 25°C und eine relative Feuchtigkeit von 57%; b) 25°C und eine relative Feuchtigkeit von 75%; und c) 25°C und eine relative Feuchtigkeit von 93%. Keine Zersetzung oder Änderung im Gewicht wurde in den obigen drei Fällen beobachtet. Die Kristalle zeigten sich als stabil und wiesen keine Hygroskopie auf. Außerdem ließ man die gleichen Kristalle 7 Tage lang unter der folgenden drastischen Bedingungen d) stehen: d) 40°C und eine relative Feuchtigkeit von 75%. Keine Änderung wurde in diesem Fall beobachtet.
Wenn im Gegensatz dazu ein gefriergetrocknetes Produkt (Anfangswassergehalt: etwa 1%) 2 Tage lang unter den folgenden Bedingungen b) oder c) aufbewahrt wurde: b) 25°C und eine relative Feuchtigkeit von 75% und c) 25°C und eine relative Feuchtigkeit von 93%, nahm das Produkt am zweiten Tag der Lagerung einen schmutzartigen oder schlamm- oder schlickartigen Zustand an auf Grund der stufenweisen Zunahme des Wassergehalts.
7) Stabilität
dCP4U·4Na-Kristalle (Decahydrat) und ein gefriergetrocknetes Produkt wurden individuell oder jeweils in Flaschen gegeben, die dann versiegelt und 13 Tage lang bei 60°C (Beschleunigungstest) gelagert wurden. Keine Zersetzung der Kristalle wurde beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde bei dem gefriergetrockneten Produkt gefunden, dass es teilweise zersetzt war, wie es gezeigt ist, durch die Beobachtung eines Reinheitsverlusts des Produkts von etwa 2,2%.
8) NMR
Die dCP4U·4Na-Kristalle und das gefriergetrocknete Produkt wurden jeweils in einen aus Zirkoniumoxid hergestellten Rotor gefüllt, und die entsprechenden ¹³C-CPMAS-NMR-Spektren wurden gemessen. Die Bedingungen für die Messung sind unten beschrieben.

¹³C-CPMAS-NMR

1) Apparat:	CMX-300 (Produkt von Chemagnetics)
2) Verfahren zur Messung:	CPMAS (Seitenbanden-Unterdrückung)
3) Messtemperatur:	Raumtemperatur
4) Beobachteter Kern:	¹³C
5) Frequenz bei der Beobachtung	75,502 MHz
6) Pulsbreite der Protonen-Exzitation oder -Anregung	4,5 μs
7) Kontaktzeit	0,5 ms
8) Messbreite	30,03 kHz
9) Messpunkte	2048
10) Datenpunkte oder Datenwerte	16384
11) Wiederholungszeit	15,0 s (Fig. 6 und 7) 60,0 s (Fig. 5)
12) Standard für die chemische Verschiebung	Hexamethylbenzol (äußerer Standard 17,35 ppm)
13) Geschwindigkeit der Probenrotation	5 kHz
14) Integration	256 Mal

Die 5 und Tabelle 5 zeigen ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na-3,5-Hydrat bzw. die Peak-Daten oder Signaldaten. Die 6 und Tabelle 6 zeigen ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von kristallinem dCP4U·4Na-Decahydrat bzw. die Daten der Peaks oder Signale. Die 7 und Tabelle 7 zeigen ein ¹³C-CPMAS-NMR-Spektrum von dCP4U in Form eines weißen Pulvers (gefriergetrocknetes Produkt) bzw. die Daten der Peaks oder Signale. Die Bezugszeichen in den 5 bis 7 beziehen sich auf die entsprechenden Nummern der Peaks oder Signale in den Tabellen 5 bis 7.
Tabelle 5 Kristallines dCP4U·4Na-3,5-Hydrat (ppm)
Tabelle 6 Kristallines dCP4U·4Na-Decahydrat (ppm)
Tabelle 7 Weißes Pulver von dCP4U (gefriergetrocknetes Produkt) (ppm)
Beispiel 2: Synthese von dCP4U aus UMP
Formamid (2,5 ml) und Pyridin (7,6 ml) wurden zu einem dehydratisierten Triethylaminsalz (10 mmol) von Pyrophosphat (TEA-PPi) gegeben, gefolgt von einem Rühren der erhaltenen Mischung. Zu einem dehydratisierten Tributylaminsalz von Uridin-5'-monophosphat (UMP-TBA) (10 mmol), die in ein anderes Gefäß gegeben wurden, wurden DMAC (3,6 ml), Dioxan (3,2 ml) und Tributylamin (3,3 ml) gegeben und gerührt, und DPC (2,3 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, um dadurch UMP-DPP zu bilden, welches zu der oben genannten dehydratisierten Lösung von TEA-PPi, das zuvor zubereitet worden war, gegeben wurde. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, um UTP zu bilden. DMAC (7,2 ml) wurde zu einem Tributylaminsalz von 2'-Deoxycytidin-5'-monophosphat (TBA-dCMP) (4,9 g, 10 mmol), das in ein weiteres Gefäß gegeben wurde, gegeben, um dadurch eine Suspension zu bilden, und DPC (2,2 ml, 1,1 Äquivalente) wurde zu der Suspension gegeben. Die erhaltene Mischung wurde 40 Minuten lang gerührt, und das Tributylamin (TBA) (9,5 ml) wurde zu der Mischung gegeben. Weitere 20 Minuten lang wurde Rühren durchgeführt, um dadurch dCMP-DPP herzustellen. Die auf diese Weise hergestellte dCMP-DPP-Lösung wurde zu der zuvor synthetisierten UTP-Lösung, die im voraus hergestellt worden war, gegeben, und die Mischung wurde 56 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion oder Umsetzung wurde durch Zugabe von Wasser beendet oder abgebrochen, und der pH der Reaktionsmischung wurde durch Zugabe einer wässerigen 30% Natriumhydroxidlösung eingestellt. Nachdem das Lösungsmittel durch Konzentration entfernt worden war, wurde der pH durch Zugabe einer 6 mol/L Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wurde mit Ethylacetat getrennt oder in Phasen verteilt. Die wässerige Phase, die durch die Phasentrennung gebildet wurde, wurde einer HPLC-Analyse (272 nm) unterworfen, die zeigte, dass die Syntheseausbeute von dCP4U 37,7% betrug.
Gewerbliche oder industrielle Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben, weisen die Kristalle von dCP4U, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, hohe Reinheit auf und hohe Stabilität und keine Hygroskopie im Vergleich zu einem gefriergetrockneten Produkt, um dadurch als ein brauchbares oder geeignetes Rohmaterial oder Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Arzneimittels oder Pharmazeutikums zu dienen.
Das Verfahren zum Herstellen von dCP4U gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt die Verwendung von kostengünstigem UMP als ein Ausgangsmaterial und gewährleistet eine hohe Ausbeute. Daher ist das Verfahren geeignet für die Synthese von dCP4U in einem großen Maßstab.

Claims

Kristalle von P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat oder einem Salz davon.
Kristalle von P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat·4Na.
Kristalle gemäß Anspruch 1 oder 2, die eine Reinheit von mindestens 95% aufweisen.
Kristalle gemäß Anspruch 1 oder 2, die eine Reinheit von mindestens 97% aufweisen und 2% oder weniger Uridin-5'-triphosphat enthalten.
Kristalle gemäß Anspruch 1 oder 2, die eine Reinheit von mindestens 98% aufweisen und 1% oder weniger Uridin-5'-triphosphat enthalten.
Verfahren zur Herstellung von Kristallen, wie sie in Anspruch 1 genannt sind, wobei das Verfahren ein Unterwerfen von rohem P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat einem Reinigungsverfahren einer Anionenaustausch-Chromatographie und einer Chromatographie an aktivierter Holzkohle, und ein Zugeben eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels zu der erhaltenen Lösung von gereinigtem P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat umfasst, um dadurch ein Kristallisieren von P¹-(2'-Deoxycytidin-5')P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat in Form von Kristallen zu bewirken oder hervorzurufen.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Reinigungsverfahren zuerst die Durchführung der Anionenaustausch-Chromatographie und nachfolgend die Chromatographie an aktivierter Holzkohle umfasst.
Kristalle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sich 1–14 Wassermoleküle an ein Molekül von P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat oder einem Salz davon binden oder anhängen oder anhaften.
Kristalle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sich 3,5 Wassermoleküle an ein Molekül von P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat oder einem Salz davon binden oder anhängen oder anhaften.
Kristalle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sich 10 Wassermoleküle an ein Molekül von P¹-(2'-Deoxycytidin-5'-)P⁴-(uridin-5'-)-tetraphosphat oder einem Salz davon binden oder anhängen oder anhaften.